◎ 盛周煌，劉常青，宋力飛

（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663）

百香果（Passiflora edulis）是一種屬于西番蓮科西番蓮屬的草質(zhì)藤本植物，原產(chǎn)于安的列斯群島，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，主要品種包括紫果和黃果兩大類[1]。百香果富含人體所需的17種氨基酸、多種維生素和類胡蘿卜素以及各種微量元素[2]；果皮可直接用作飼料，也可用于提取其中的果膠膳食纖維[3]；根、莖、葉均可入藥[4]，有抗炎鎮(zhèn)痛[5]、活血強身[6]、滋陰補腎[7]、降脂降壓[8]、提神醒酒[9]、消除疲勞[10]、排毒養(yǎng)顏[11]和增強人體免疫力[12]等功效。

目前我國并未對百香果的質(zhì)量要求作出相關(guān)規(guī)定，廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB 45/T 2100—2019僅對百香果的果形、色澤、成熟度等感官項目作出要求，受植物產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收時間的影響，不同來源的百香果在化學(xué)成分方面存在一定差異，因此需創(chuàng)建一個百香果質(zhì)量控制分析方法對其化學(xué)成分方面的質(zhì)量差異作出評估。指紋圖譜具有全息性、客觀性、準(zhǔn)確性、整體性及模糊性的特征，能較好地表征物質(zhì)化學(xué)成分組成的整體性及復(fù)雜性，全面反映物質(zhì)中的化學(xué)成分信息[13]。

本研究利用HPLC建立百香果指紋圖譜，收集不同來源的百香果，分析比較其HPLC指紋圖譜特征，以期為百香果的質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與方法

1.1 儀器

Agilengt 1100系列高效液相色譜儀（包括DAD陣列檢測器，美國Agilent公司）；LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津）；Platisil ODS色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；BSA224S型電子天平（德國賽多利斯）；HR2089/90榨汁機（飛利浦）；FJ-200高速分散均質(zhì)機（上海標(biāo)本模型廠）。

1.2 材料與試劑

乙腈（天津科密歐試劑廠，色譜純），磷酸（天津科密歐試劑廠，色譜純），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-202018），原花青素對照品（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，產(chǎn)品編號78204），蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100080-202012），超純水（實驗室自制）。9批百香果樣品信息見表1。

表1 百香果樣品信息表

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

Platisil ODS色譜柱：5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相為乙腈（B）-0.1%磷酸水（A）溶液，采用梯度洗脫程序，見表2。柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；檢測波長202 nm，進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序表

1.3.2 對照品溶液的制備

稱取綠原酸、原花青素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含綠原酸、原花青素、蘆丁分別為45 μg、25 μg、80 μg的溶液，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備

取完整百香果樣品切碎，加10倍水于榨汁機中攪切1 min制成漿液，然后用高速均質(zhì)機以最大轉(zhuǎn)速 （20 000 r·min-1）均質(zhì)3次，每次3 min，每次間隔 3 min，過濾，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度考察

取S4百香果，按1.3.3項方法制備樣品，按1.3.1項色譜條件測定色譜圖，連續(xù)進樣6次，考察各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD，并利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件進行各圖譜間的相似度計算。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD≤1.5%，相對峰面積的RSD≤3.0%，且各色譜圖相似度均在0.99以上，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重現(xiàn)性考察

取S4百香果6份，按1.3.3項方法制備樣品，按1.3.1項色譜條件測定色譜圖，并利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件進行各圖譜間的相似度計算。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD≤1.0%，相對峰面積的RSD≤3.0%，且各色譜圖相似度均在0.99以上，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性考察

取S4百香果，按1.3.3項方法制備樣品，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h以1.3.1項色譜條件測定色譜圖測定色譜圖，考察各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD，并利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件進行各圖譜間的相似度計算。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD≤1.0%，相對峰面積的RSD≤3.0%，且各色譜圖相似度均在0.99以上，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.2 不同來源百香果指紋圖譜共有模式的建立

將9批不同來源的百香果按1.3.3項方法制備樣品溶液，按1.3.1項色譜條件測定指紋圖譜，結(jié)果見圖1。不同批次百香果產(chǎn)品受地理環(huán)境、氣候、采收期等的差異性影響，其指紋圖譜略有不同，但并不改變其共有性，具有指紋圖譜特征性，可初步擬定為百香果原材的指標(biāo)成分群。

圖1 不同批次百香果指紋圖譜圖

采用平均數(shù)法，時間窗寬度為0.1 s，設(shè)S3為參照圖譜，生成百香果產(chǎn)品共有模式對照圖譜（圖2）。通過軟件分析，選取分離度較好的色譜峰，不同來源的百香果樣品HPLC色譜圖有10個共有峰。

圖2 百香果共有模式HPLC圖譜圖

精密吸取對照品溶液，按1.3.1項色譜條件測定色譜圖，用對照品色譜圖與對照指紋色譜圖對比發(fā)現(xiàn)指紋圖譜中第3、8、10號色譜峰分別為化合物綠原酸、原花青素、蘆丁，結(jié)果見圖3。

圖3 百香果指紋圖譜特征峰定性圖

2.3 不同來源百香果原材相似度分析

利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件對百香果原材指紋圖譜進行相似度分析，將9批不同來源百香果樣品色譜圖與百香果共有模式HPLC圖譜進行比較，其中蘆丁峰（10號峰）的峰形和分離度均較好，故選擇作為參照峰，計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，具體結(jié)果見表3～表5。

由表3～表5可知，各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.5%，表明不同產(chǎn)地百香果物質(zhì)成分種類無太大差別。受地區(qū)氣候、采收期等因素的影響，不同區(qū)域百香果原材物質(zhì)成分含量差異較大。不同來源百香果相似度介于0.544～0.922，表明樣品具有一定的代表性，反映了不同產(chǎn)地百香果的質(zhì)量具有差異性。

表3 9批百香果各共有峰相對保留時間表

表5 9批百香果相似度分析表

表4 9批百香果各共有峰相對峰面積表

2.4 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.4.1 檢測波長的選擇

本研究利用二極管陣列檢測器（DAD）在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，綜合比對不同波長下色譜圖中色譜峰的數(shù)量、峰型及保留時間等，最終確認將202 nm作為最優(yōu)檢測波長測定色譜圖。

2.4.2 流動相的選擇

本試驗考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-冰醋酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液6種流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明，甲醇流動相體系基線隨時間增加而不斷向上飄移，乙腈-冰醋酸水流動相體系基線隨時間增加而不斷向下飄移，乙腈-甲酸水流動相體系基線上下浮動。所以最終選定乙腈-磷酸水溶液作為流動相。

2.4.3 色譜柱的選擇

本試驗通過分析比較Intersil ODS-3、Platisil ODS和Diamonsil C18（2）3種色譜柱對色譜峰的峰型、分離度、保留時間等的影響，結(jié)果表明迪馬科技的Platisil ODS色譜柱分離效果較好。因此選擇Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。

3 結(jié)論

本研究建立了精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好的百香果HPLC指紋圖譜，色譜峰分離度良好，分離出較多的色譜峰，綠原酸、原花青素、蘆丁成分有效被檢出，為百香果的質(zhì)量鑒別提供了豐富的樣品信息，反映了不同來源百香果化學(xué)成分種類及含量的差別，為百香果原料的質(zhì)量控制及相關(guān)百香果產(chǎn)品的開發(fā)提供高水平的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，同時也為百香果原料的篩選提供了科學(xué)有效的評價方法。