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        基于磁性納米粒子的免疫熒光法測(cè)定 花生中的黃曲霉毒素B1

        2021-09-14 12:00:24康雪梅趙雪峰曹靜杰賈松濤李夢(mèng)雨趙林萍
        現(xiàn)代食品 2021年13期
        關(guān)鍵詞:偶聯(lián)黃曲霉毒素

        ◎ 陶 燕,康雪梅,李 超,趙雪峰,曹靜杰,賈松濤,李夢(mèng)雨,趙林萍

        (河南中標(biāo)檢測(cè)服務(wù)有限公司,河南 鄭州 450001)

        黃曲霉毒素(AFs)是自然界中黃曲霉和寄生曲霉屬真菌產(chǎn)生的有毒代謝物。有一系列不同類型的AFs,AFB1和AFG1(黃曲霉毒素G1)毒性最強(qiáng),食用受污染的谷物或動(dòng)物產(chǎn)品可能影響人體健康。據(jù)報(bào)道,AFB1具有致癌作用,是一種免疫抑制劑,即對(duì)人體有致癌作用。因此,迫切需要一種高選擇性的AFB1檢測(cè)方法。

        黃曲霉毒素分析方法有很多,有研究[1]對(duì)樣品預(yù)處理和分析方法進(jìn)行了分類,免疫親和或多純化柱是儀器分析常用的材料,如高效液相色譜、氣相色譜和液相色譜。這些方法要求實(shí)驗(yàn)室設(shè)備完善,耗時(shí)且昂貴。AFB1的檢測(cè)方法和商業(yè)試劑盒有很多,免疫化學(xué)方法已成功用于食品和飼料中AFB1的檢測(cè)。YU等[2]發(fā)現(xiàn)AFB1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的檢測(cè)限 (LOD)為10 pg·mL-1和90 pg·mL-1。ELISA可 能出現(xiàn)假陽(yáng)性或陰性,常有基質(zhì)干擾,且檢測(cè)時(shí)間很長(zhǎng)。近年來(lái),納米材料已廣泛應(yīng)用于免疫分析的開(kāi)發(fā)。納米顆粒已被用作固定化生物分子的支撐材料或作為示蹤劑獲得擴(kuò)增檢測(cè)。磁性微球具有良好的生物相容性,反應(yīng)后易于從反應(yīng)溶液中分離。目前,已經(jīng)開(kāi)發(fā)出利用金納米顆粒對(duì)AFB1進(jìn)行磁性比色免疫分析,WANG等[3]描述了一種檢測(cè)AFB1的競(jìng)爭(zhēng)性方法,在樣品中的AFB1和涂上AFB1-BSA的磁性微球間進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,該方法已應(yīng)用于玉米樣品檢測(cè)。但上述描述的方法都由許多組件和步驟組成,成本較高,且準(zhǔn)備工作較長(zhǎng),當(dāng)在分析中使用多組件時(shí),會(huì)產(chǎn)生不正確結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn),因此,急需一種快速、簡(jiǎn)單的AFB1測(cè)定方法。

        本文提出了一種快速、靈敏的基于MNP的AFB1免疫熒光檢測(cè)方法,該方法僅由兩種成分組成,即涂有MNPs的多克隆抗AFB1抗體和AFB1-BSA-FITC熒光偶聯(lián)物。該方法滿足了用戶的3個(gè)主要要求:樣本量小、AFB1檢出限低、檢測(cè)時(shí)間短。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物、熒光素5(6)-異硫氰酸酯、二甲基甲酰胺、Sephadex G25培養(yǎng)基、2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇(Tris)、NaCl、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、兔分離抗血清產(chǎn)生的多克隆抗黃曲霉毒素B1抗體、戊二醛、牛血清白蛋白(BSA)、吐溫80,均從德國(guó)Sigma Aldrich訂購(gòu)。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)ELGA PURELAB Option純化。

        1.2 AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物的獲得與證明

        AFB1-BSA的熒光偶聯(lián)物的獲得。熒光素5(6)-異硫氰酸酯(FITC)為熒光標(biāo)記物,最大發(fā)射波長(zhǎng)519 nm(綠色)。偶聯(lián)方法是,1.5 mg AFB1-BSA加入到1 mL碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH=9.6),F(xiàn)ITC溶于二甲基甲酰胺(1 mg·mL-1),然后,AFB1-BSA與0.24 mL FITC溶液混合在一個(gè)避光的玻璃瓶中。在4 ℃下反應(yīng)過(guò)夜后,用Sephadex G25中性柱子(10×220 mm)過(guò)濾反應(yīng)混合物,用Tris緩沖液(pH=8.2)洗脫。使用6900紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各組分的吸光度,265 nm(AFB1)、280 nm(蛋白質(zhì))和495 nm(FITC),通過(guò)熒光分光光度分析(Perkin Elmer LS45熒光分光光度計(jì))證實(shí)了所得到的熒光共軛物為AFB1-BSA-FITC。

        1.3 APTES包覆MNPs及抗AFB1多克隆抗體的固定化

        磁性納米顆粒(MNPs)參照GABROVSKA等人[4]研究的制備方法獲得。利用APTES修飾,使其在MNPs上形成氨基基團(tuán)[5]。①經(jīng)修飾的MNPs作為多克隆抗-AFB1抗體的固相載體,戊二醛活化納米粒子用于抗體結(jié)合,APTES涂層的MNPs(10 mg)懸浮于2 mL 5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PB,50 mmol · L-1, pH為8.0),室溫下在搖床上反應(yīng)2 h,將活化的涂布APTES的MNPs用2 mL 50 mmol·L-1PB洗滌(pH 8.0),再用2 mL 10 mmol·L-1PB(pH 7.4)洗滌5次。 ②完全去除多余的戊二醛后,將多克隆抗-AFB1抗體(327 μg·mL-1)1.6 mL 10 mmol·L-1PB(pH 7.4)加入到納米粒子中。懸浮液在4 ℃下反應(yīng)過(guò)夜???AFB1抗體被固定在活化的APTES涂層MNPs上(MNP-Ab),用10 mmol·L-1pH為7.4的PB進(jìn)行3次洗滌,加入 2 mL阻斷液(10 mmol·L-1PB,pH為7.4,含5% BSA和0.05% Tween 80),在室溫下?lián)u床上反應(yīng)1 h;然后對(duì)MNP-Ab進(jìn)行4次洗滌。③將MNP-Ab重新懸浮于10 mmol·L-1PB(pH=7.4)至終濃度為5 mg·mL-1。

        檢測(cè)固定化抗體活性。在聚苯乙烯微效板上對(duì)抗-AFB1抗體進(jìn)行非特異性吸附,采用Bradford法 (100 μg)測(cè)定抗體吸附量。使用和MNP-Ab相同數(shù)量的抗體,3種濃度的AFB1-BSA-FITC熒光共軛物(30 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1,10 mmol·L-1PB,pH為7.4,含10%甲醇)用于抗體活性測(cè)定。

        1.4 MNP-Ab用量和熒光共軛濃度的優(yōu)化

        優(yōu)化MNP-Ab的用量和AFB1-BSA-FITC的濃度。比較3種不同用量的MNP-Ab:0.125 mg、0.250 mg和0.375 mg,稀釋緩沖液為10 mmol·L-1PB,pH為7.4,含10%甲醇。①幾種不同濃度的200 μL AFB1樣 品(0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、 50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1)加入含MNP-Ab小瓶中,在37 ℃搖床中反應(yīng)15 min。②每個(gè)樣品中加入熒光偶聯(lián)物AFB1-BSA-FITC 22 μL(28 μg·mL-1),這些混合物在37 ℃搖床進(jìn)一步反應(yīng)15 min。③用磁力分離器收集偶聯(lián)AFB1的MNP-Ab和偶聯(lián)AFB1-BSA-FITC的MNP-Ab。測(cè)定上清液中過(guò)量的AFB1-BSA-FITC熒光強(qiáng)度,熒光強(qiáng)度與AFB1與MNP-Ab結(jié)合呈線性正相關(guān),熒光測(cè)量采用熒光分光光度計(jì),得到的熒光數(shù)據(jù)歸一化(NS,%),采用公式(1)計(jì)算:

        式中:B0為初始AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物溶液的熒光強(qiáng)度,b為含AFB1樣品的熒光強(qiáng)度,Bx為不含AFB1樣品的熒光強(qiáng)度。

        歸一化信號(hào)與樣本中AFB1濃度呈線性負(fù)相關(guān),NS越高,AFB1濃度越低。

        優(yōu)化AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)濃度。試驗(yàn)偶聯(lián)物濃 度 分 別 為22 μg·mL-1、28 μg·mL-1和35 μg·mL-1, AFB1的使用濃度分別為0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1。①在小瓶中加入0.25 mg MNP-Ab。②加入200 μL AFB1溶液,在37 ℃搖床中反應(yīng)15 min。③加入22 μL的偶聯(lián)物,在相同條件下反應(yīng)。④使用磁力分離器收集上清液中的過(guò)量的AFB1-BSA-FITC,按上述方法測(cè)定上清液的熒光強(qiáng)度,并將信號(hào)歸一化。

        1.5 花生中AFB1的測(cè)定

        花生用研缽和杵磨成細(xì)粉,過(guò)篩。將所得的花生粉放入4個(gè)容器中(各1 g),3個(gè)樣品,1種沒(méi)有毒素只有甲醇的樣品。加入溶于甲醇的AFB1使之達(dá)到 3個(gè)AFB1濃度水平(0.4 ng·g-1、1.0 ng·g-1、2.0 ng·g-1)。 樣品分別在室溫下干燥過(guò)夜提取。提取時(shí)甲醇/水的比例為80/20(5 mL)。進(jìn)行下一步含量檢測(cè)。①制備4瓶MNP-Ab(0.25 mg)。②加 入200 μL的 花生AFB1稀釋提取物,懸濁液在搖床中37 ℃下反應(yīng) 15 min。③加 入AFB1-BSA-FITC偶 聯(lián) 物22 μL,濃度為28 μg·mL-1(稀釋緩沖液為含有0.1% BSA的 PB-10%甲醇),在37 ℃的搖床中反應(yīng)15 min后,按上述方法測(cè)定上清液的熒光強(qiáng)度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物的獲得與證明

        競(jìng)爭(zhēng)性抗原-熒光染料的制備是競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光分析的主要內(nèi)容之一。在本研究中,使用商業(yè)上可獲得的AFB1-BSA偶聯(lián)物,可用于直接標(biāo)記FITC。

        所得AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物經(jīng)紫外可見(jiàn)光譜和熒光分光光度分析可證實(shí)。比較AFB1-BSA-FITC、游離的AFB1-BSA和游離的FITC的吸收光譜,該熒光偶聯(lián)物對(duì)游離的AFB1-BSA的典型吸收最大值為265 nm和355 nm,對(duì)游離的FITC的吸收最大值為495 nm,這3個(gè)峰的存在是AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)形成的證據(jù)。在光譜中AFB1(自身熒光)在435 nm的特征發(fā)射峰可以觀察到,在527 nm處還出現(xiàn)了另一個(gè)峰,這是FITC在偶聯(lián)物中存在的證據(jù)。因此,AFB1-BSAFITC偶聯(lián)物被成功制備。

        2.2 APTES包覆MNPs及抗AFB1多克隆抗體的固定化

        通過(guò)濕法合成的MNPs中含有羥基作為官能團(tuán),固定抗體較為困難,因此修飾MNPs是一個(gè)必要的步驟。通過(guò)APTES涂層在MNPs表面獲得了氨基,經(jīng)過(guò)APTES改性后,顆粒尺寸增大,涂覆后MNPs尺寸為8.2 nm,這種MNPs尺寸對(duì)于確保磁體完全分離是非常重要的。

        APTES包被的MNPs作為多克隆抗AFB1抗體固定化的固體載體。通過(guò)戊二醛結(jié)合劑將APTES包覆的MNP表面上的氨基與抗體氨基偶聯(lián),偶聯(lián)后進(jìn)行Bradford檢測(cè),結(jié)果表明,每1 mg MNPs固定有40 μg抗-AFB1抗體。測(cè)定了固定在MNPs的抗體的活性,并與吸附在微孔板上的游離抗體的活性進(jìn)行了比較,比較結(jié)果表明,兩種抗體的活性非常相似,相對(duì)活性為92%,結(jié)果表明,固定在MNPs上的抗AFB1抗體活性不受化學(xué)結(jié)合劑的影響。

        2.3 MNP-Ab用量的優(yōu)化

        MNP-Ab含量和熒光偶聯(lián)物濃度的優(yōu)化是建立單一免疫分析法的重要步驟。不同濃度的MNP-Ab分別在AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物(28 μg·mL-1)和5種不同濃度的目標(biāo)抗原(AFB1)下使用。圖1顯示了從5種 不 同 濃 度 的AFB1(0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、 12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1) 和 3種不同數(shù)量的MNP-Ab中獲得的歸一化信號(hào),歸一化信號(hào)與樣品中的AFB1濃度呈線性負(fù)相關(guān)。

        圖1 MNP-Ab的用量?jī)?yōu)化圖

        結(jié)果表明,MNP-Ab的最佳用量為0.250 mg。這種情況下,上清液中游離的偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度足夠高,不同AFB1添加濃度下上清液中熒光強(qiáng)度的變化也是最大的。顯然,此濃度抗體提供的免疫分析分辨率較好。

        2.4 熒光共軛物的優(yōu)化濃度

        對(duì)熒光共軛物的濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示。主要目標(biāo)在不同的抗原濃度下獲得足夠強(qiáng)的熒光信號(hào)和良好的分辨率。在不同AFB1濃度下(0.25 pg·mL-1、 1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和 100.00 pg·mL-1),AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)熒光信號(hào)變化最大時(shí),濃度為28 μg·mL-1,信號(hào)歸一化后可得到證實(shí)。因此,此共軛濃度被選擇為最佳,以確保提高免疫分析分辨率。

        圖2 優(yōu)化的AFB1-BSA-FITC濃度隨AFB1濃度變化圖

        2.5 花生中AFB1的測(cè)定

        花生中加入溶于甲醇的AFB1以達(dá)到3種不同濃度(0.4 ng·g-1、1.0 ng·g-1、2.0 ng·g-1),同 時(shí) 選 一 個(gè)不含毒素只有甲醇的花生樣本,樣品干燥后,進(jìn)行提取程序,提取后稀釋提取液,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率,見(jiàn)表1,花生中AFB1濃度越低,其結(jié)果RSD越低,可接受的回收率為96%~120%。樣品體積為40 μL,不提取情況下,檢測(cè)時(shí)間不超過(guò) 35 min,同時(shí)獲得的LOD足夠低(0.9 pg·mL-1),因此,建立的免疫分析法可用于實(shí)際樣品中AFB1的檢測(cè)。所開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法能夠在沒(méi)有非特異性干擾的情況下測(cè)定低濃度的毒素。

        表1 添加花生樣品中AFB1的檢測(cè)結(jié)果及回收率表(n=3)

        3 結(jié)論

        建立了一種快速、靈敏的基于MNP的競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光檢測(cè)方法檢測(cè)AFB1,檢測(cè)線性范圍為2~100 pg·mL-1, AFB1免疫檢測(cè)的LOD較低,為0.9 pg·mL-1。獲得的免疫測(cè)定時(shí)間小于35 min。在這種體系中,分析物到固定抗體的傳質(zhì)距離大大縮短,因此,與抗體固定在平面表面(如酶標(biāo)板孔)相比,可更快實(shí)現(xiàn)抗體-抗原結(jié)合平衡。所得結(jié)果證實(shí)了所開(kāi)發(fā)的基于磁性納米顆粒的免疫熒光法在實(shí)際樣品中測(cè)定AFB1的優(yōu)勢(shì)。

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