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        馬齒莧粗多糖除蛋白方法的篩選及優(yōu)化

        2021-09-14 11:59:22楊星星楊錦穎董慶軍徐海洋曲曉蘭
        現(xiàn)代食品 2021年13期
        關鍵詞:氯乙酸馬齒莧酶法

        ◎ 楊星星,楊錦穎,董慶軍,徐海洋,曲曉蘭,2

        (1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)藥學院,山東 泰安 271016;2.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)藥理學研究所,山東 泰安 271016)

        馬齒莧在我國是一種極為常見的野菜,南北方各地均有分布,它不僅營養(yǎng)豐富而且具有較高的經(jīng)濟價值,在食品、化工、藥品、農(nóng)牧業(yè)等諸多領域具有廣泛的開發(fā)前景。馬齒莧多糖是其主要活性成分之一,具有抗病毒、提高免疫力、抗衰老、降糖調脂等活性[1-2]。在其制備工藝中,去除蛋白為提高馬齒莧粗多糖純度和品質的重要環(huán)節(jié)[3-4]。因此,本研究以除蛋白率和多糖損失率為指標,選取4種常用的除蛋白方法Sevage法、三氯乙酸(TCA)法、酶法和鹽酸法進行比較研究[5-6],旨在得到一種馬齒莧多糖除蛋白效率高、多糖損失低且綠色安全的方法,以期為馬齒莧多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術支持。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試藥

        KQ500-VDE超聲波清洗器(昆山測試儀器有限公司);UV-2700型分光光度計(日本Shimadzu);RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);STARTER-2100型pH計(奧豪斯儀器公司)等。

        馬齒莧采自山東第一醫(yī)科大學藥用植物園,考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物工程研究所),木瓜蛋白酶(Solarbio),三氯乙酸、葡萄糖、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、氯仿、正丁醇等均為國產(chǎn)AR。

        1.2 方法

        1.2.1 馬齒莧粗多糖的提取

        馬齒莧全草干燥粗粉50.00 g→石油醚回流脫 脂→500 mL純凈水超聲提?。?次,30 min/次)→抽 濾→濾液濃縮→0.1%活性炭脫色→加4倍量95%乙醇→低溫冷藏靜置12 h→抽濾→濾渣分別用乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌→所得沉淀除乙醇→55 ℃干燥→得馬齒莧粗多糖。

        1.2.2 多糖含量的測定

        配制馬齒莧粗多糖水溶液(0.1 mg·mL-1),選擇苯 酚-硫酸法[7]利用葡萄糖溶液做回歸曲線,測定待測樣品的A490nm,橫坐標C(mg·mL-1)為葡萄糖標準品,縱坐標為A(nm)為樣品吸光度,做回歸方程A=0.076 2C+1.680 1(R=0.999 4)并按照式(1)計算多糖含量,多糖損失率計算如式(2)。

        式中:A0-除蛋白前樣品中多糖質量;A1-為除蛋白樣品中多糖含量。

        1.2.3 蛋白質含量測定

        配制50 mg·mL-1的樣品溶液,參照考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒說明書中介紹的方法,測定樣品的A595nm,并依據(jù)公式(3)計算出樣品的蛋白濃度,除蛋白率計算如式(4):

        式 中:OD0-空 白OD值;OD1-測 定OD值;OD2-標準OD值;C1-標準品濃度(0.5 mg·mL-1)

        式中:C0-除蛋白前樣品中蛋白濃度;C1-除蛋白后樣品中蛋白濃度。

        1.2.4 除蛋白方法的篩選

        (1)Sevage法。取馬齒莧粗多糖水溶液(10 mg·mL-1) 50 mL,按5∶1(體積比)加Sevage試劑(正丁醇∶氯仿=1∶4),劇烈振搖后靜置,離心,將兩液面交界處變性蛋白去除。吸取上層溶液重復上述操作數(shù)次直至無沉淀物后進行測定。

        (2)三氯乙酸(TCA)法。取馬齒莧粗多糖水溶液 (10 mg·mL-1)50 mL,用10%三氯乙酸調節(jié)pH=3,振搖均勻,低溫冷藏過夜,離心后,取上清液進行測定。

        (3)酶法。取馬齒莧粗多糖水溶液(10 mg·mL-1)50 mL,調節(jié)pH=6后加入木瓜蛋白酶至濃度1.0%,置于50 ℃水浴中2 h(酶解),而后換成沸水浴中加熱10 min(酶滅活),取出放置至室溫后,離心,取上清液進行測定。

        (4)鹽酸法。取馬齒莧粗多糖水溶液(10 mg · mL-1)50 mL,加入鹽酸(1 moL·L-1)調節(jié)pH=3,持續(xù)振蕩,混勻后靜置,離心,取上清液進行測定。

        (5)酶法除蛋白單因素試驗。取馬齒莧粗多糖水溶液(10 mg·mL-1)50 mL,使用鹽酸調節(jié)適宜pH,加入木瓜蛋白酶至一定濃度,在特定的溫度條件下,進行水浴規(guī)定時間,而后置于沸水浴中加熱10 min(酶滅活),取出放置至室溫后,離心,取上清液進行測定。單因素試驗條件分別為:酶用量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%(溫度為50 ℃,pH=6,時間2 h);酶解時間為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h(溫度為50 ℃,pH=6,木瓜蛋白酶用量1.0%);酶解溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃(木瓜蛋白酶用量1.0%,pH=6,時間2 h);酶解pH值為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0(木瓜蛋白酶用量1.0%,時間2 h,溫度為50 ℃)。

        2 結果與分析

        2.1 除蛋白方法比較結果

        以多糖損失率和除蛋白率為評價指標,對比4種方法的除蛋白效果,結果表明(圖1)應用最為廣泛的Sevage法除蛋白效果高于其他3種方法,但此法的多糖損失率也較高;三氯乙酸法的除蛋白率低于Sevage法和酶法,多糖損失率低于Sevage法,高于酶法;鹽酸法除蛋白率最低,多糖損失率最高。Sevage法和三氯乙酸法中存在有毒有機溶劑殘留,雖然除蛋白率都較高,但相對安全性較差;酶法清除蛋白效果相對較好,且方法綠色安全,故選擇酶法開展單因素試驗,以提高除蛋白率,降低多糖損失率。

        圖1 4種除蛋白方法的比較圖

        2.2 酶法除蛋白單因素試驗

        2.2.1 酶用量對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響由圖2可知,多糖損失率與酶用量無明顯相關性。在木瓜蛋白酶的用量小于1.5%時,除蛋白的效率是隨著酶用量的增加而增加的,而后除蛋白質率基本趨于平穩(wěn)。說明木瓜蛋白酶可以降解馬齒莧多糖中的蛋白質,達到除蛋白的效果,考慮到工藝成本及木瓜蛋白酶用量增加可能會對多糖成分有影響,故選擇木瓜蛋白酶用量為1.5%。

        圖2 酶用量對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響圖

        2.2.2 酶解時間對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響

        由圖3可知,酶解時間小于2.5 h時,除蛋白質效果和蛋白損失率均跟隨著酶解時間的增加而呈現(xiàn)上升,除蛋白率在2.5 h時達到最高,之后隨著時間增加,除蛋白率變化不大,蛋白損失率則仍然呈現(xiàn)上升??赡苁且驗殡S著酶解時間的增加,使酶與蛋白充分作用,但當酶已經(jīng)反應充分后,除蛋白的效果受反應時間延長影響不大,但蛋白損失率會持續(xù)增加。因此,酶解時間應控制在2.5 h左右。

        圖3 酶解時間對馬齒莧粗多糖除蛋白率和 多糖損失率的影響圖

        2.2.3 酶解溫度對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響

        由圖4可知,40~55 ℃區(qū)間內,除蛋白率隨著溫度上升而增加,在55 ℃時清除率達到最大,之后呈現(xiàn)較為明顯的下降趨勢。由此可得出酶解作用與溫度是密切相關的,低溫會影響酶活性的釋放,適當?shù)臏囟瓤杉ぐl(fā)酶的作用,而過高的溫度也會破壞酶導致其失活。全程蛋白損失率與酶解溫度成正比,可見溫度增加會造成蛋白損失,該結果符合蛋白質本身特性。故酶解溫度不宜過高,以55 ℃左右為宜。

        圖4 酶解溫度對馬齒莧粗多糖除蛋白率和 多糖損失率的影響圖

        2.2.4 酶解pH對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響

        由圖5可知,除蛋白率在酶液pH=6.0時出現(xiàn)較為明顯的峰值。表明溶液系統(tǒng)的酸堿環(huán)境直接影響木瓜蛋白酶酶解的效果,弱酸環(huán)境有利于酶解,該結果與木瓜蛋白酶產(chǎn)品說明書提供的相關信息相符。酶解pH環(huán)境的變化對多糖損失率無顯著影響。因此,最佳酶解pH=6.0。

        圖5 酶解pH對馬齒莧粗多糖除蛋白率和 多糖損失率的影響圖

        3 結論

        本試驗以除蛋白率和多糖損失率為指標,考察Sevage法、三氯乙酸(TCA)法、酶法和鹽酸法4種脫蛋白方法對馬齒莧多糖脫蛋白的效果,結果表明酶法明顯優(yōu)于其他3種方法,為馬齒莧多糖除蛋白較為理想的方法,優(yōu)化后的工藝為木瓜蛋白酶用量1.5%,酶解時間2.5 h,酶解溫度55 ℃,酶解pH=6.0。該方法除蛋白效率較高,多糖損失率相對較低,方法綠色安全,更適合可食性多糖的除蛋白。

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