孫寶婷 邱萌霞 王子辰 王梓源 崔建東 賈士儒

（天津科技大學(xué) 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457）

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，主要分布于植物、紅酵母中，在一些藻類和原生動物體內(nèi)也含有一定量的PAL［1］。PAL可催化苯丙氨酸（L-Phe）生成反式肉桂酸（t-CA）和氨。在生物化工行業(yè)中，是酶法合成苯丙氨酸的關(guān)鍵酶。在醫(yī)藥行業(yè)中，PAL可被用于診斷和治療部分腫瘤、酪氨酸代謝異常以及苯丙酮尿 癥［2-4］。但是，游離的PAL穩(wěn)定性差，在人體內(nèi)抗原性強(qiáng)、半衰期短，降低了其應(yīng)用效果。

有機(jī)金屬骨架材料（metal-organic frameworks）是一種由金屬離子和有機(jī)配體通過配位鍵連接而成的配位聚合物［5-6］。具有可調(diào)節(jié)的超高孔隙率、高比表面積、高結(jié)晶度、高機(jī)械穩(wěn)定性、良好的光電性能等優(yōu)勢特性［7-9］，在醫(yī)藥和催化等領(lǐng)域得到了廣泛的研究。通常，MOFs被用作氣體吸附、分離、催化和藥物遞送等，近年來在酶的固定化方向有一定的應(yīng)用，例如脂肪酶［10-11］、葡萄糖氧化酶［12］、甘油脫氫酶［13］、有機(jī)磷酸水解酶［14］、尿酶［15］等。有機(jī)金屬骨架材料中，ZIF-8是材料中研究最廣泛的一種，可以在水溶液中以2-甲基咪唑為有機(jī)配體，與金屬Zn2+構(gòu)成籠狀配位化合物，由于其制備條件溫和、多孔的三維結(jié)構(gòu)以及比表面積大等特點，在吸附［16-18］、分離［19-20］、催化［21-23］、生物醫(yī)學(xué)［24-26］和生物檢測器［27］等領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。

研究表明，ZIF-8可以作為酶固定化的載體，對酶起到一定的保護(hù)作用［28-31］，固定后酶的穩(wěn)定性有所提高。以ZIF-8為載體固定酶主要有兩種方式，一種是通過吸附的方式將酶固定在預(yù)先制備好的ZIF-8上，但是，由于酶通過較弱的作用力（如氫鍵、范德華力等）結(jié)合在ZIF-8表面，酶易從ZIF-8上脫落流失，穩(wěn)定性差，而且，由于酶直接暴露在載體表面，容易受到外界環(huán)境的影響而失活。另一種方式是將酶加入到ZIF-8前體物中，在ZIF-8形成過程中將酶與ZIF-8晶體共沉淀包埋ZIF-8的空隙和網(wǎng)格中，這種方法制備的固定化酶穩(wěn)定性好，對酶的保護(hù)效果好，應(yīng)用較為普遍。但是，被包埋酶蛋白表面電荷的不同，會直接影響到酶蛋白在ZIF-8中的包埋效率，導(dǎo)致所制備的固定化酶活回收率較低。研究表明，表面電荷低的酶蛋白更容易被包埋在ZIF-8中［28-32］。因此，有必要開發(fā)新的方法來提高酶在ZIF-8中的包埋效率和酶活回收率。

研究表明，一些氨基酸可以輔助增強(qiáng)ZIF-8包埋酶的效率［30］。本研究以半胱氨酸（Cys）為輔助劑包裹在PAL表面以遮蔽蛋白表面電荷，然后基于共沉淀包埋策略，利用Cys中的巰基具有富集親和金屬離子的特性，加速Zn2+和2-甲基咪唑在PAL酶蛋白周圍結(jié)晶形成ZIF-8外殼（圖1），從而提高PAL在ZIF-8中的包埋效率和酶活回收率，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了PAL固定化酶（PAL@ZIF-8）的制備條件，并檢測了其催化性能。

圖1 半胱氨酸輔助的PAL@ZIF-8制備過程Fig.1 Cysteine-assisted preparation of PAL@ZIF-8

1 材料與方法

1.1 材料

來源于重組大腸桿菌的PAL（0.02 U/mg）保存于本實驗室；2-甲基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮（MW8000），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸鋅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；L-半胱氨酸、苯丙氨酸，北京索萊寶科技有限公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。

場發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡（FEI-Apreo），F(xiàn)EI公司；激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1000），日本Olympus有限公司；冷凍干燥機(jī)（LGJ-10），北京松源華興科技發(fā)展有限公司；pH計（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫水浴鍋（HH6），常州榮華儀器制造有限公司；紫外分光光度計（UV-6100），上海美譜達(dá)儀器有限公司；磁力攪拌器（B15-1），上海思樂儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)（H2050R），湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PAL在ZIF-8的合成 將1 mg的PAL（0.02 U）溶解于2 mL 超純水中，依次加入2 mg PVP（MW：8 000）和4 mg Cys攪拌至溶解，然后分別加入2 mL 160 mmol/L 2-甲基咪唑和2 mL 40 mmol/L醋酸鋅，室溫放置4 h，離心收集沉淀，超純水洗滌3遍。

1.2.2 酶活測定方法 由于PAL轉(zhuǎn)化L-Phe生成的反式肉桂酸在278 nm下有吸光值，并且在一定范圍內(nèi)，反式肉桂酸濃度與吸光值成線性關(guān)系。采用紫外分光光度計法測量PAL的酶活，PAL酶活單位（U）定義在一定條件下1 min內(nèi)催化L-Phe生成1 μmol反式肉桂酸所需要的酶量。測定條件如下：1.5 mL離心管中依次加入490 μL pH 8.8 Tris-HCL、500 μL 50 mmol/L L-Phe和10 μL PAL或PAL@ZIF-8，40℃反應(yīng)10 min，然后加入40 μL 4 mol/L HCl終止反應(yīng)，10 000 × g離心后，在278 nm紫外波長下測量上清液的吸光值。繪制反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，酶活計算公式如下：

圖2 反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of trans-cinnamic acid

式中 C：反式肉桂酸的濃度（mg/L）；V：反應(yīng)體系的體積（mL）；MW：反式肉桂酸的分子量（148.16 g/mol）；T：反應(yīng)時間（10 min）。

1.2.3 酶蛋白負(fù)載率和酶活回收率

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 2-甲基咪唑濃度對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響 將1 mg的PAL（0.02 U）溶解于2 mL 超純水中，依次加入2 mg PVP（MW：8000）和4 mg Cys攪拌至溶解，然后分別加入2 mL 40 mmol/L醋酸鋅和2 mL 100-1 000 mmol/L 2-甲基咪唑，室溫放置4 h，10 000 × g離心收集沉淀，超純水洗滌3遍。參照1.2.2方法進(jìn)行酶活測定，并計算酶活回收率。

1.2.4.2 醋酸鋅濃度對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響 將1 mg的PAL（0.02 U）溶解于2 mL 超純水中，依次加入2 mg PVP（MW：8 000）和4 mg Cys攪拌至溶解，然后分別加入2 mL 10-180 mmol/L醋酸鋅和2 mL 200 mmol/L 2-甲基咪唑，室溫放置4 h，10 000×g離心收集沉淀，超純水洗滌3遍。參照1.2.2方法進(jìn)行酶活測定，并計算酶活回收率。

1.2.4.3 Cys濃度對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響 將1 mg的PAL（0.02 U）溶解于2 mL 超純水中，依次加入2 mg PVP（MW：8 000）和0-9 mg Cys攪拌至溶解，然后分別加入2 mL 60 mmol/L醋酸鋅和2 mL 200 mmol/L 2-甲基咪唑，室溫放置4 h，10 000 × g離心收集沉淀，超純水洗滌3遍。參照1.2.2方法進(jìn)行酶活測定，并計算酶活回收率。

1.2.4.4 PVP濃度對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響 將1 mg的PAL溶解于2 mL 超純水中，依次加入0-9 mg PVP（MW：8 000）和4 mg Cys攪拌至溶解，然后分別加入2 mL 60 mmol/L醋酸鋅和2 mL 200 mmol/L 2-甲基咪唑，室溫放置4 h，10 000 × g離心收集沉淀，超純水洗滌3遍。參照1.2.2方法進(jìn)行酶活測定，并計算酶活回收率。

1.2.4.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Design-expert v11.0.4軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗Box-Behnken做進(jìn)一步的優(yōu)化。

1.2.5 PAL@ZIF-8的催化性能

1.2.5.1 最適催化溫度 將10 μL游離PAL和PAL@ZIF-8分別加入490 μL 50 mmol/L Tris緩沖液（pH 8.8）和500 μL 50 mmol/L L-Phe反應(yīng)體系中，在20℃-70℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)10 min，加入40 μL HCl（4 mol/L）終止反應(yīng)，10 000 × g離心后，測上清液在278 nm下的吸光值，計算酶活，確定最佳催化溫度。

1.2.5.2 最適催化pH值 將10 μL游離PAL和PAL@ZIF-8分別加入490 μL不同pH的緩沖液（pH 3.0-11.0）和500 μL 50 mmol/L L-Phe反應(yīng)體系中，在40℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)10 min，加入40 μL HCl（4 mol/L）終止反應(yīng)，10 000 × g離心后，測上清液在278 nm下的吸光值，計算酶活，確定最佳反應(yīng)pH。

1.2.5.3 溫度耐受性 取相同酶活的游離PAL和PAL@ZIF-8分別加入490 μL 50 mmol/L Tris緩沖液（pH 8.8）和500 μL 50 mmol/L L-Phe反應(yīng)體系中，置于50℃水浴鍋中，分別在處理10、20、30、40和50 min時取出，冷卻至室溫，40℃進(jìn)行酶促反應(yīng)10 min，加入40 μL HCl（4 mol/L）終止反應(yīng)，10 000 × g離心后，測上清液在278 nm下的吸光值，計算酶活。

1.2.5.4 pH耐受性 取相同酶活的游離PAL和PAL@ZIF-8分別在50 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.0、5.0）及50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0、9.0、11.0）中處理1 h，40℃進(jìn)行酶促反應(yīng)10 min，加入40 μL HCl（4 mol/L）終止反應(yīng)，10 000 × g離心后，測上清液在278 nm下的吸光值，計算酶活。

1.2.5.5 重復(fù)使用性 取0.5 mL PAL@ZIF-8，2 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）緩 沖 液 和2.5 mL 50 mmol/L L-Phe；40℃反應(yīng)10 min，10 000 × g離心后，測上清液在278 nm下的吸光值。將所得沉淀用去離子水洗一遍，重新懸浮于2.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）緩沖液，渦旋使其分散均勻，加入2.5 mL 50 mmol/L L-Phe再次進(jìn)行酶促反應(yīng)后測定上清液在278 nm下的吸光值。重復(fù)測定10次，確定PAL@ZIF-8重復(fù)使用穩(wěn)定性。

1.2.5.6 儲存穩(wěn)定性 取相同酶活的PAL和PAL@ZIF-8在室溫下儲存，每隔1 d取出一部分測定酶活，比較二者的儲存穩(wěn)定性。

1.2.5.7 PAL和PAL@ZIF-8的表觀動力學(xué) 利用雙倒數(shù)法測定Km和Vmax，即將50 mmol/L L-Phe分別稀釋為25 mmol/L、12.5 mmol/L、5 mmol/L、2.5 mmol/L的不同濃度的L-Phe，進(jìn)行游離PAL、PAL@ZIF-8的催化反應(yīng)，測其A278nm。

1.2.6 PAL@ZIF-8的表征 利用美國捷克場發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡（FEI Apreo）、日本Olympus激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1000）、德國布魯克傅里葉變換紅外光譜儀（TENSOR 27）對PAL@ZIF-8進(jìn)行表征。

2 結(jié)果

2.1 單因素對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響

單因素對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響由圖3所示。由圖3-A可知，隨著2-甲基咪唑濃度的增加，PAL@ZIF-8的酶活回收率也在增加，當(dāng)2-甲基咪唑濃度為200 mmol/L時，PAL@ZIF-8的酶活回收率達(dá)到最高，為52.68%，進(jìn)一步增加2-甲基咪唑濃度，PAL@ZIF-8的酶活回收率反而下降，因此選擇200 mmol/L 2-甲基咪唑濃度作為后續(xù)優(yōu)化實驗的條件。由圖3-B可知醋酸鋅濃度過低或過高都不利于PAL@ZIF-8酶活回收率，當(dāng)醋酸鋅濃度為60 mmol/L時，PAL@ZIF-8的酶活回收率達(dá)到最高，為55.56%，因此以2-甲基咪唑濃度為200 mmol/L和醋酸鋅濃度為60 mmol/L作為后續(xù)優(yōu)化實驗的條件。由圖3-C得出，在4 mL制備體系中，當(dāng)Cys的添加量為4 mg時，PAL@ZIF-8的酶活回收率達(dá)到最高，為54.66%，因此選用Cys添加量4 mg作為后續(xù)優(yōu)化實驗的條件。同時，在4 mL制備體系中，當(dāng)PVP添加量為2 mg時，PAL@ZIF-8的酶活回收率最高達(dá)到54.09%，且隨著PVP添加量的繼續(xù)增加PAL@ZIF-8的酶活回收率并未出現(xiàn)明顯增加（圖3-D），因此選用PVP添加量2 mg作為后續(xù)優(yōu)化實驗的條件。

圖3 各因素對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響Fig.3 Influence of various factors on the recovery of PAL@ZIF-8 activity

2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

由上述單因素實驗結(jié)果可知，2-甲基咪唑濃度、醋酸鋅濃度和Cys添加量對PAL@ZIF-8的酶活回收率影響較大，且2-甲基咪唑濃度在100-300 mmol/L，醋酸鋅濃度在40-80 mmol/L，以及Cys添加量在3-5 mg的范圍內(nèi)時PAL@ZIF-8的酶活回收率較高，因此選定2-甲基咪唑濃度（A，mmol/L）、醋酸鋅濃度（B，mmol/L）和Cys添加量（C，mg）為3個實驗因素，采用響應(yīng)面中心組合試驗Box-Behnken進(jìn)一步設(shè)計優(yōu)化不同因素下PAL@ZIF-8的酶活回收率，以PAL@ZIF-8的酶活回收率（Y，%）為響應(yīng)值探討各因素對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響及其相互作用關(guān)系，以期獲得PAL@ZIF-8的最優(yōu)制備條件。響應(yīng)面實驗因素及水平表如表1所示。Box-Behnken實驗設(shè)計表及響應(yīng)值如表2所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素及水平表Table 1 Test factors and level table of response surface

Design-expert軟件對Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果如表2所示，利用該軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行二次多項回歸擬合，得回歸方程：Y=-332.8945+1.0551×A + 2.17861×B+107.4455×C-0.000501×AB-0.0191× AC+ 0.1205×BC-0.00231×A2-0.022862×B2-14.06225×C2。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and response values

公式中Y表示PAL@ZIF-8的酶活回收率，A表示2-甲基咪唑濃度（mmol/L），B表示醋酸鋅濃度（mmol/L），C表示Cys添加量（mg）。

通過軟件分析，得出的模型方差分析結(jié)果如表3所示，模型P＜0.0001，失擬項P=0.0581＞0.05，此外，該模型的校正確定系數(shù)R2=0.9891（表4）。

表4 模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the model

由表3中方差分析可知，2-甲基咪唑濃度、醋酸鋅濃度和Cys含量的一次項P值均小于0.01，模擬交互項中，BC影響顯著（P＜0.05），模擬平方項中A2，B2，C2影響極顯著（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計方差分析表Table 3 Analysis for regression equation of Box-Behnken design

各因素在合成PAL@ZIF-8過程中對PAL@ZIF-8酶活回收率影響的3D和等高線分析圖見圖4，PAL@ZIF-8酶活回收率隨著2-甲基咪唑濃度、醋酸鋅濃度和Cys含量的增加而增加，當(dāng)達(dá)到各因素的峰值時，隨之減小。

圖4 各因素交互作用對苯丙氨酸解氨酶酶活回收率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of the effect of interaction of various factors on the recovery of PAL activity

由以上結(jié)果可得，半胱氨酸輔助的最佳PAL@ZIF-8制備條件為：200 mmol/L 2-甲基咪唑、60 mmol/L醋酸鋅和4 mg Cys，2 mg PVP。

2.3 PAL@ZIF-8的表征

由圖5-B可見，半胱氨酸參與合成的PAL@ZIF-8呈球體，大小約為5-8 μm，而常規(guī)方法合成的ZIF-8為正十二面體型（如圖5-B所示），直徑大約為1 μm。此外，利用熒光顯微鏡下觀察經(jīng)異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的PAL制備出的PAL@ZIF-8，可以清晰地看到PAL@ZIF-8顆粒散發(fā)出綠色熒光（圖6）。能譜儀對元素的分析結(jié)果如圖7所示，PAL和ZIF-8中都不含S元素（圖7-a和7-b），但是，L-Cys含有硫元素（圖7-c），同時在半胱氨酸輔助的PAL@ZIF-8中也含有S元素（圖7-d）。這個結(jié)果證明L-Cys參與了PAL@ZIF-8的合成。

圖5 PAL@ZIF-8掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope(SEM)of PAL@ ZIF-8

圖6 PAL@ZIF-8激光掃描共聚焦顯微鏡圖Fig.6 Laser scanning confocal microscopy of PAL@ZIF-8

圖7 ZIF-8、PAL、L-Cys和PAL@ZIF-8的能譜圖Fig.7 Energy disperse spectroscopy spectrum of ZIF-8，PAL，L-Cys and PAL@ZIF-8

2.4 PAL@ZIF-8催化性能研究結(jié)果

由圖8中A、C可知，PAL@ZIF-8與游離PAL最適催化溫度和最適催化pH值相同，但PAL@ZIF-8的溫度和pH適用范圍比游離的PAL更廣泛。另外，在50℃處理條件下（圖8-B），隨著時間的延長，游離PAL與PAL@ZIF-8的酶活殘留率呈遞減趨勢，當(dāng)處理至30 min時，游離PAL的酶活殘留率只剩15.81%，而PAL@ZIF-8的酶活殘留率還能保留41.96%。圖8-C表明，游離PAL和PAL@ZIF-8的最適催化pH都為9.0。但是，游離PAL表現(xiàn)出比PAL@ZIF-8都低的酸堿耐受性（圖8-D），在酸性條件下，游離PAL基本喪失酶活，而PAL@ZIF-8仍能保持50%-60%的殘留酶活，在pH值為11的條件下，游離PAL的酶活殘留率為62.47%，PAL@ZIF-8的殘留酶活為83.96%。與游離PAL相比，PAL@ZIF-8的Km值較大，反應(yīng)速率降低（表5）。

表5 PAL與PAL@ZIF-8的表觀動力學(xué)常數(shù)Table 5 Comparison of apparent kinetic parameters of free PAL and PAL@ZIF-8

圖8 PAL@ZIF-8的催化性能Fig. 8 Catalytic performance of PAL@ZIF-8

另外，與不添加Cys的傳統(tǒng)共沉淀包埋法相比，在相同PAL濃度條件下，Cys輔助制備的PAL@ZIF-8酶蛋白負(fù)載率增加了12%，酶活回收率增加了40%（表6）。表明該方法可以高效將酶蛋白包埋在ZIF-8中。

表6 負(fù)載率及酶活回收率對比Table 6 Comparison of load rate and recovery of PAL activity

圖9-A是PAL@ZIF-8的重復(fù)使用穩(wěn)定性結(jié)果，結(jié)果表明PAL@ZIF-8殘留酶活率隨著使用次數(shù)的增加逐漸降低，在重復(fù)使用了7次之后，PAL@ZIF-8仍保留初始酶活的60%以上，表明PAL@ZIF-8有較好的重復(fù)使用穩(wěn)定性。同時，儲存穩(wěn)定性結(jié)果表明，PAL@ZIF-8在室溫下儲存19 d仍可保持70%以上的初始酶活，但游離PAL已經(jīng)失活（圖9-B）。說明PAL@ZIF-8儲存穩(wěn)定性良好。

圖9 PAL@ZIF-8重復(fù)使用性及儲存穩(wěn)定性Fig. 9 Reusability and storage stability of PAL@ZIF-8

3 討論

3.1 單因素對PAL@ZIF-8酶活回收率的影響

固定化苯丙氨酸解氨酶的其他方法中，酶活回收率低，或分散性較差［33-34］，對進(jìn)一步的應(yīng)用有所限制。而使用傳統(tǒng)合成PAL@ZIF-8方法，雖分散性較好，但所得酶活回收率為13.38%，按照1.2.1中Cys參與PAL@ZIF-8的初始合成方法，所得酶活回收率為30.16%±3.24%，不能滿足后續(xù)應(yīng)用需要，因此對Cys參與PAL@ZIF-8的合成方法進(jìn)行優(yōu)化。合成過程中，2-甲基咪唑濃度太低，難以形成ZIF-8，不能將PAL充分包埋在ZIF-8中，但是，2-甲基咪唑濃度過高，堿性過強(qiáng)，易使PAL酶失活，導(dǎo)致PAL@ZIF-8的酶活回收率降低。其中，醋酸鋅的濃度過低或過高都不利于PAL@ZIF-8酶活回收率。當(dāng)Cys添加量為4 mg時，酶活回收率最高，在該合成過程中，Cys中的巰基富集金屬離子，添加量過大，影響蛋白與金屬離子的結(jié)合，因此酶活回收率變低，當(dāng)添加量較少時，金屬Zn2+對PAL的酶活力有影響，對PAL的活性中心的保護(hù)作用較小，因此當(dāng)Cys添加量為4 mg時，可得到最高的酶活回收率。而PVP在合成過程中有利于各個組分的分散，達(dá)到一定量后，酶活回收率不再升高。因此，選用200 mmol/L 2-甲基咪唑、60 mmol/L醋酸鋅、4 mg Cys、2 mg PVP作為后續(xù)優(yōu)化實驗的條件。

3.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

通過軟件分析，得出的模型方差分析結(jié)果，模型P＜0.0001，表明對PAL@ZIF-8酶活回收率所建立的二項式模型具有顯著性，失擬項P=0.0581＞0.05，無失擬現(xiàn)象，說明在本實驗中，使用該方程預(yù)測PAL@ZIF-8酶活回收率的方法是可行的。此外，該模型的校正確定系數(shù)R2=0.989 1，表明模型可以解釋98.91%的響應(yīng)值的變化，實驗誤差小，因此可用該方程對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

由表中方差分析可知，2-甲基咪唑濃度、醋酸鋅濃度和Cys含量的一次項P值均小于0.01，說明這3項對PAL@ZIF-8的酶活回收率影響達(dá)到了極顯著的水平，模擬交互項中，BC影響顯著，模擬平方項中A2，B2，C2影響極顯著，說明這3項對苯丙氨酸解氨酶的酶活回收率影響順序為醋酸鋅濃度＞2-甲基咪唑濃度＞Cys添加量。

由各因素在合成PAL@ZIF-8過程中對PAL@ZIF-8酶活回收率影響的3D和等高線分析圖可知，PAL@ZIF-8酶活回收率隨著2-甲基咪唑濃度、醋酸鋅濃度和Cys含量的增加而增加，當(dāng)達(dá)到各因素的峰值時，隨之減小。圖中，醋酸鋅濃度的等高線圖較2-甲基咪唑濃度和Cys含量的等高線更密集，說明醋酸鋅濃度對PAL@ZIF-8酶活回收率影響更顯著，與方差分析結(jié)果一致。

綜合分析以PAL@ZIF-8酶活回收率為響應(yīng)值的擬合模型，預(yù)測出最佳PAL@ZIF-8制備條件為：200 mmol/L 2-甲基咪唑、60 mmol/L醋酸鋅和4 mg Cys，2 mg PVP，在此條件下預(yù)測所得PAL@ZIF-8酶活回收率為56.97%。同時在此條件下，進(jìn)行了3次平行驗證實驗，測得PAL@ZIF-8酶活回收率為（56.15±0.94）%，與預(yù)測值相符，表明響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計的最佳條件可靠，具有準(zhǔn)確性和實用性。

3.3 PAL@ZIF-8的表征

Cys參與合成的PAL@ZIF-8呈球體，與傳統(tǒng)ZIF-8多面體型［35］或十字花型不同［36］，且直徑較傳統(tǒng)PAL@ZIF-8大，這種形態(tài)上的變化可能是由于Cys上豐富的巰基富集了Zn2+，改變了2-甲基咪唑與Zn2+的結(jié)合狀態(tài)，同時，Cys在酶蛋白周圍的包裹遮蔽了酶蛋白表面電荷，使酶蛋白與ZIF-8間的作用減少，從而導(dǎo)致ZIF-8的形態(tài)發(fā)生變化。通過熒光顯微鏡觀察到被FITC標(biāo)記的PAL被包埋在ZIF-8顆粒中，因此成功制備出PAL@ZIF-8固定化酶。Cys中的巰基對多種重金屬有高度的親和性［37］，巰基中含有硫元素，因此可以通過測定PAL@ZIF-8中是否含有硫元素來驗證Cys是否參與合成PAL@ZIF-8。通過能譜儀對元素的分析結(jié)果可知，空載體ZIF-8、游離PAL都不含有硫元素，但在Cys和PAL@ZIF-8中都觀察到了硫元素，這個結(jié)果表明Cys參與了PAL@ZIF-8的合成。

3.4 PAL@ZIF-8催化性能研究結(jié)果

Cys參與合成的PAL@ZIF-8與游離PAL相比，最適催化溫度和最適催化pH值相同，但其溫度耐受性和pH耐受性優(yōu)于游離PAL，PAL@ZIF-8耐受高溫及極端pH環(huán)境的能力比游離PAL更強(qiáng)，耐受范圍更廣。Cys參與合成的PAL@ZIF-8穩(wěn)定性的提高可能是由于酶在固定化過程中，被ZIF-8致密的納米孔腔包圍，使酶的構(gòu)象在孔內(nèi)保持穩(wěn)定，可以維持一定的酶活性，因此表現(xiàn)出良好的溫度耐受性及pH耐受性，且Cys參與合成的PAL@ZIF-具有較好的重復(fù)使用性和儲存穩(wěn)定性，但是，與游離PAL相比，由于載體的存在，PAL@ZIF-8的Km值較大，表明底物與PAL@ZIF-8間的傳質(zhì)阻力大，親和力小，從而造成PAL@ZIF-8反應(yīng)速率降低。Cys參與的PAL@ZIF-8與傳統(tǒng)PAL@ZIF-8相比，蛋白負(fù)載率和酶活回收率都有提高，表明該方法可以高效將酶蛋白包埋在ZIF-8中。

4 結(jié)論

通過Cys輔助法制備了PAL@ZIF-8，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化得到了PAL@ZIF-8最佳制備條件：0.17 mg/mL PAL，0.33 mg/mL PVP（Mw:8 000），0.67 mg/mL Cys，60 mmol/L醋 酸鋅和200 mmol/L 2-甲基咪唑，在此優(yōu)化條件下所得PAL@ZIF-8固定化酶酶活回收率為56.15±0.94%，比優(yōu)化前提高了近25%。該方法所得的PAL@ZIF-8具有良好的溫度和pH耐受性，室溫儲存穩(wěn)定性以及良好的重復(fù)使用性，酶的負(fù)載率及酶活回收率均有提高，是一種高效的酶固定化策略。