馬小翔 劉亞月，，3 聶影影 黎燕媚 王遠(yuǎn) 薛欣怡 洪鵬志，，3 張翼，，3

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湛江市腦健康海洋藥物與營養(yǎng)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所，湛江 524088； 2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院海洋醫(yī)藥研發(fā)中心，深圳 518120；3. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 大連工業(yè)大學(xué)， 大連 116034）

海洋約占地球總面積的71%，蘊(yùn)含著種類多樣、活性豐富的微生物資源［1］。海洋生物尤其是海洋微生物在海洋高鹽、高壓、低氧、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境下，產(chǎn)生獨(dú)特的新陳代謝機(jī)制，進(jìn)而能生成結(jié)構(gòu)新穎、活性豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為藥物先導(dǎo)化合物提供豐富來源［2-3］。海洋真菌因遺傳背景復(fù)雜、代謝產(chǎn)物種類豐富、產(chǎn)量高，逐漸成為海洋微生物新天然產(chǎn)物的主要來源，在2010-2013年的統(tǒng)計(jì)里約占64%［4］。而且研究表明真菌含有大量次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters）［5］，但在實(shí)驗(yàn)室或者人工培養(yǎng)條件下，真菌大部分功能基因簇通常處于沉默狀態(tài)。通過改變培養(yǎng)基組成、改變發(fā)酵條件（如培養(yǎng)容器）以及加入小分子化合物（如前體小分子、酶抑制劑等）等豐富真菌代謝產(chǎn)物多樣性的方法越來越受到研究者的關(guān)注［6］。

新化合物發(fā)現(xiàn)的方法學(xué)研究正在引領(lǐng)海洋微生物天然產(chǎn)物研究的新浪潮?；谫|(zhì)譜的分子網(wǎng)絡(luò)（molecular networking，MN）是一種可視化計(jì)算策略［7］。結(jié)構(gòu)相似的化合物在質(zhì)譜測試中會(huì)裂解產(chǎn)生相似的碎片離子，通過計(jì)算機(jī)算法計(jì)算樣品經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）后得到的二級(jí)質(zhì)譜的相似度，依據(jù)相似度將質(zhì)譜信息整合成一種可視化的分子網(wǎng)絡(luò)圖。MN有利于快速、大規(guī)模地鑒定已知化合物、相似化合物以及挖掘新化合物。近年來，隨著全球天然產(chǎn)物社會(huì)分子網(wǎng)絡(luò)（Global Natural Product Social Molecular Networking，GNPS）數(shù)據(jù)庫的開放使用，借助來自全球的化合物及其譜圖積累，GNPS逐漸成為研究天然產(chǎn)物的重要MN工具［8］。如Nie等［9］將生物活性耦合LC-MS/MS和GNPS，高效地評估挖掘來自多種海洋真菌提取物的乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）抑制活性和抗氧化活性化合物。

土曲霉（Aspergillus terreus）屬于子囊菌門（Ascomycota）散囊菌綱（Eurotiomycetes）散囊菌目（Eurotiales）發(fā)菌科（Trichocomaceae）曲霉屬（Aspergillus），是一種廣泛存在于海洋和陸地的真菌。丁內(nèi)酯類和土震素類化合物是土曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物中的特征代謝產(chǎn)物［10］，研究者發(fā)現(xiàn)丁內(nèi)酯類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抑制葡萄糖苷酶、抑制葡萄糖醛酸酶等活性［11-13］，可通過抗炎、抑制細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5、促進(jìn)軸突生長等多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用［14-17］；土震素類化合物具有顯著的AChE抑制活性［18］。本實(shí)驗(yàn)室于前期研究篩選出一株分離自南海珊瑚的海洋土曲霉C23-3，其代謝產(chǎn)物具有一定抗氧化、抑菌和AChE抑制活性且高產(chǎn)丁內(nèi)酯Ⅰ［19］?？紤]到這株菌的代謝產(chǎn)物及活性可能在抗阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s disease，AD）等神經(jīng)退行性疾病藥物研發(fā)中具有較好研究價(jià)值，值得深入挖掘其代謝潛力。

考慮到土曲霉主體活性產(chǎn)物丁內(nèi)酯I（butyrolactone I）的生源合成途徑［20-21］，本研究選用小分子前體酪氨酸/4-羥基苯丙酮酸的類似物（3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸和3，4-二羥基苯丙酮酸）、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的底物（萜類側(cè)鏈供體金合歡醇和法尼焦磷酸銨鹽（farnesyl pyrophosphate ammonium salt，F(xiàn)PP））、L-硒代蛋氨酸以及氧化脅迫劑（H2O2）和亞硫酸氫鈉甲萘醌（menadione sodium bisulfite，MSB）共9種化學(xué)誘導(dǎo)劑對菌株 Aspergillus terreus C23-3 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)合LC-MS/MS和GNPS研究化學(xué)調(diào)控對菌株次級(jí)代謝的影響，以期誘導(dǎo)菌株C23-3產(chǎn)生產(chǎn)量更高或多樣性更豐富的丁內(nèi)酯類等代謝產(chǎn)物，為后續(xù)篩選和開發(fā)利用具有AD活性的先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海洋真菌土曲霉Aspergillus terreus C23-3（GDMCC No.60316）采自湛江徐聞珊瑚保護(hù) 區(qū)，現(xiàn)保存于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 海水馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯汁500.0 mL（由馬鈴薯200.0 g煮熟過濾而成）、蔗糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、海水晶20.0 g；固體培養(yǎng)基需加入瓊脂20.0 g，加水定容至1.0 L。糙米培養(yǎng)基：糙米833.3 g、海水晶 20.0 g，加水定容至1.0 L。pH均為自然，1×105Pa滅菌20 min備用。

1.1.3 主要試劑與儀器 誘導(dǎo)劑：3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3，4-二羥基苯丙酮酸、L-硒代蛋氨酸、H2O2、MSB、金合歡醇和FPP。用5%稀鹽酸（HCl）或二甲基亞砜（DMSO）或無菌水溶解，于超凈臺(tái)經(jīng)0.22 μmol/L濾膜過濾備用。

乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二苯代苦味酰自由基（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine，ATCh）、5，5'- 二硫代二硝基苯甲酸（dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；24孔板，無錫耐思生物科技有限公司；薄層層析板Silica gel 60 F254，德國默克公司；LC-MS/MS分析用試劑為Fisher質(zhì)譜純，其他試劑及材料均為國產(chǎn)分析純。

多功能紫外透射儀，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；霉菌培養(yǎng)箱及生物安全柜，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；Thermo Finnigan液相色譜-二極管陣列檢測器- LCQ Advantage MAX離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備種子 將菌株C23-3凍存管置于溫度28℃、濕度80%的霉菌培養(yǎng)箱活化過夜；將菌種接種到預(yù)先裝有200 mL滅菌海水馬鈴薯固體培養(yǎng)基的錐形培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3-4 d，待菌落孢子生長茂盛備用。

1.2.2 誘導(dǎo)菌株 使用0.85%的無菌生理鹽水將1.2.1培養(yǎng)的菌種孢子洗下，搖勻。海水馬鈴薯培養(yǎng)基和糙米培養(yǎng)基均使用24孔板，每孔加入2 mL培養(yǎng)基和200 μL孢子懸液，28℃、濕度80%培養(yǎng) 3 d。

3 d后，誘導(dǎo)組根據(jù)設(shè)置的誘導(dǎo)劑濃度（如圖1標(biāo)注所示），向菌株培養(yǎng)物加入化學(xué)誘導(dǎo)劑；對照組根據(jù)誘導(dǎo)劑的溶劑（5% HCl、DMSO和無菌水），向菌株培養(yǎng)物加入與誘導(dǎo)劑等體積的溶劑；空白組為不加誘導(dǎo)劑或溶劑的菌株培養(yǎng)物。每個(gè)條件設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，24 孔板置于霉菌培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)物形態(tài)并拍照記錄。

1.2.3 提取次生代謝產(chǎn)物 分別在第14天和28天提取菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物。先將用于微量發(fā)酵的24孔板冷凍干燥。對于液體培養(yǎng)物，每孔加入2 mL甲醇浸泡過夜，將孔內(nèi)物質(zhì)全部轉(zhuǎn)移至離心管，加入2 mL甲醇洗凈孔內(nèi)殘留后轉(zhuǎn)移至離心管合并，功率500 W超聲提取30 min，靜置過夜取上清液備用；沉淀則加入4 mL甲醇，超聲提取步驟同上，重復(fù)2次；將總的上清液過濾膜（孔徑0.45 μm）濃縮干燥、稱重，4℃ 冷藏備用。對于固體培養(yǎng)物，每孔加入1 mL甲醇浸泡過夜；將孔內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)移至離心管后加3 mL甲醇洗凈孔內(nèi)殘留，剩余操作同液體培養(yǎng)物的提取。

1.2.4 薄層層析分析、生物活性自顯影及化學(xué)顯色 此部分參考張翼等［22］的方法，不同培養(yǎng)基的發(fā)酵提取物均以三氯甲烷∶甲醇（體積比為20∶1）為薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）展開劑，分別記錄254、365 nm的紫外圖像，DPPH自由基清除活性與AChE抑制活性自顯影圖像，茴香醛硫酸顯色及鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色圖像。

1.2.5 LC-MS/MS 將各提取物均用色譜甲醇配成等體積樣品溶液進(jìn)行液質(zhì)分析。

色譜分析條件：進(jìn)樣量為20 μL，洗脫條件為：0.00-1.00 min，30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；1.00-8.00 min，30%-99%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；8.00-12.00 min，99%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；12.00-12.20 min，99%-30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；12.20-15.00 min，30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸），流速0.6 mL/min。DAD檢測器信號(hào)采集波長為190-600 nm，監(jiān)測波長為210 nm、254 nm、280 nm、310 nm和360 nm。色譜柱為Phenomenex Kinetex C18 100?反相色譜柱（100×4.60 mm，5 μm）。

質(zhì)譜檢測條件：質(zhì)量掃描范圍設(shè)置為m/z 100-2 000，電噴霧離子化，正離子模式，離子源電壓：4 kV，毛細(xì)管溫度：325℃，二級(jí)質(zhì)譜觸發(fā)信號(hào)強(qiáng)度閾值1×105CPS（Count Per Second），碰撞能量：35 eV，離子傳輸管電壓：10 V。

1.2.6 分子網(wǎng)絡(luò)的創(chuàng)建和可視化分析 使用Proteo Wizard軟件轉(zhuǎn)換原始液質(zhì)數(shù)據(jù)文件的格式，然后上傳至GNPS數(shù)據(jù)庫計(jì)算分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入 Cytoscape 3.7軟件繪制分子網(wǎng)絡(luò)圖。利用GNPS的二級(jí)質(zhì)譜相似度匹配功能可注釋樣品所含的已知化合物，并根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)圖中不同節(jié)點(diǎn)的關(guān)系，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，來發(fā)現(xiàn)已知化合物的類似物或衍生物。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)前后菌株表觀形態(tài)變化

菌株C23-3在海水馬鈴薯液體培養(yǎng)基條件下，如圖1-C所示，空白組的菌絲體呈現(xiàn)乳白色，邊緣呈現(xiàn)灰黑色；如圖1-A所示，分別添加3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸后，隨著誘導(dǎo)劑濃度的增大，菌株的菌絲體生物量無明顯變化，菌絲體由淺黃色變成淺棕色；而添加MSB、H2O2、FPP以及無菌水的組（圖1-B-C），菌膜邊緣黑色部分增加。

菌株C23-3在糙米培養(yǎng)基條件下，如圖1-C所示，空白組菌絲體呈棕色；如圖1-A所示，分別添加3-氨基-L-酪氨酸和3-羥基-L-酪氨酸后，實(shí)驗(yàn)組各個(gè)濃度的菌絲體生物量變少且顏色變淺；加入3-硝基-L-酪氨酸、3，4-二羥基苯丙酮酸、金合歡醇后，菌絲體生物量減少；如圖1-B所示，添加L-硒代蛋氨酸后，菌株產(chǎn)生少量白色菌絲體。

圖1 菌株C23-3化學(xué)調(diào)控前后生長形態(tài)（培養(yǎng)28 d）Fig.1 Growth morphology of strain C23-3 before and after chemical regulation（cultured for 28 days）

同等培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)14 d的菌株表現(xiàn)形態(tài)與培養(yǎng)28 d的無明顯差異。綜上所述，在3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3，4-二羥基苯丙酮酸、金合歡醇和L-硒代蛋氨酸誘導(dǎo)前后菌株C23-3外觀形態(tài)上產(chǎn)生了明顯變化，而菌株形態(tài)變化與次級(jí)代謝產(chǎn)物通常密切相關(guān)［23-24］，為了驗(yàn)證誘導(dǎo)劑引起的次生代謝變化，本文對菌株提取物進(jìn)行了TLC指紋圖譜與生物活性自顯影的分析。

2.2 誘導(dǎo)前后TLC指紋圖譜比較

對添加化學(xué)誘導(dǎo)劑前后的菌株提取物進(jìn)行了不同波長下的吸收/熒光斑點(diǎn)、茴香醛顯色斑點(diǎn)、DPPH自由基清除活性斑點(diǎn)、三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色斑點(diǎn)和AChE抑制活性斑點(diǎn)的TLC指紋綜合比較，如表1及圖2所示，添加化學(xué)誘導(dǎo)劑前后菌株TLC指紋圖譜發(fā)生了顯著變化。在糙米培養(yǎng)基中，3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）、3-羥基-L-酪氨酸（10 mmol/L）、3-硝基-L-酪氨酸（10 mmol/L）、3，4-二羥基苯丙酮酸（1 mmol/L）、金合歡醇（1 μmol/L）、MSB（10 μmol/L）、H2O2（1 mmol/L）、FPP（5 μmol/L）和L-硒代蛋氨酸（61 mmol/L）這9種誘導(dǎo)條件下代謝產(chǎn)物更豐富或發(fā)生變化，且具有一定生物活性。而海水馬鈴薯液體培養(yǎng)基由于代謝產(chǎn)物過少，未做進(jìn)一步分析。

圖2 菌株 C23-3 化學(xué)調(diào)控前后發(fā)酵產(chǎn)物 TLC 指紋圖譜（糙米培養(yǎng)基）Fig.2 TLC fingerprints of strain C23-3 fermentation products before and after chemical regulation（brown rice medium）

2.3 誘導(dǎo)前后代謝產(chǎn)物總體多樣性比較

利用LC-MS/MS對糙米培養(yǎng)基上經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)后菌株微量發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)合GNPS數(shù)據(jù)庫和Cytoscape等軟件做分子網(wǎng)絡(luò)圖。首先使用同一誘導(dǎo)劑的不同條件（改變濃度或培養(yǎng)時(shí)間）及其對應(yīng)空白組和對照組的菌株提取物單獨(dú)做分子網(wǎng)絡(luò)分析，然后從9種誘導(dǎo)劑中匯總次生代謝產(chǎn)物豐富或有明顯變化的培養(yǎng)條件再做分子網(wǎng)絡(luò)（圖3）。基峰圖（base peak chromatograms，BPC）是將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中最強(qiáng)離子的離子強(qiáng)度連續(xù)描繪而得的圖譜，結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)數(shù)量、大小、比例分布等，二者在一定程度上可反映菌株代謝產(chǎn)物的總體多樣性。

在分子網(wǎng)絡(luò)圖中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一種化合物（不排除為同分異構(gòu)體的集合），實(shí)質(zhì)上是液質(zhì)數(shù)據(jù)中具有相同整數(shù)質(zhì)荷比、視為相同二級(jí)質(zhì)譜圖的所有母離子的集合，其上標(biāo)注的質(zhì)荷比為采集的全部母離子質(zhì)荷比的均值；化合物二級(jí)質(zhì)譜之間的相似性用余弦值（即cosine值，范圍為0-1）表示，余弦值與相似性成正比，節(jié)點(diǎn)之間的連線粗細(xì)與節(jié)點(diǎn)之間的cosine值正相關(guān)；節(jié)點(diǎn)不同顏色的扇形分布代表化合物不同來源的相對含量；節(jié)點(diǎn)的大小代表不同化合物的總離子強(qiáng)度。如圖3所示，分子網(wǎng)絡(luò)圖直觀的顯示某些代謝產(chǎn)物在不同的培養(yǎng)條件下分布不同，有的有明顯的偏向性，只在少數(shù)甚至個(gè)別條件下才產(chǎn)生，如最大離子簇中m/z 461.259、459.243、551.168等節(jié)點(diǎn)，在Cytoscape軟件中點(diǎn)擊相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)可瀏覽詳細(xì)信息。根據(jù)樣品與GNPS數(shù)據(jù)庫里收錄化合物二級(jí)質(zhì)譜的相似性匹配（cosine值大于0.7），判斷菌株C23-3的已知產(chǎn)物主要有丁內(nèi)酯Ⅰ（compound 1）、土震素B（compound 2）、洛伐他?。╟ompound 3）和和一個(gè)相對微量成分洛伐他汀羥酸（compound 4，洛伐他汀內(nèi)酯鍵開環(huán)產(chǎn)物）。

?

對于這四種特征化合物，根據(jù)GNPS提取的化合物的出峰時(shí)間和分子量信息，在BPC（圖4）中可找到對應(yīng)的色譜峰及質(zhì)譜信息（丁內(nèi)酯Ⅰ：［M+H］+m/z 425，保留時(shí)間在8.35 min；土震素B：［M+H］+m/z 527，保留時(shí)間8.84 min；洛伐他?。海跰+H］+m/z 427，保留時(shí)間10.39 min；洛伐他汀羥酸：［M+H］+m/z 445，保留時(shí)間9.43 min；其二級(jí)質(zhì)譜見圖5-7），發(fā)現(xiàn)在不同培養(yǎng)條件下它們的產(chǎn)量有較大變化。

除了上述已知代謝產(chǎn)物的變化外，實(shí)驗(yàn)中也觀察到一些未知成分的變化，在圖4中用箭頭標(biāo)注了相應(yīng)樣品中較獨(dú)特的成分。

圖4 菌株C23-3不同培養(yǎng)條件下代謝產(chǎn)物的液質(zhì)聯(lián)用基峰色譜圖Fig.4 Base peak chromatograms of the metabolites of strain C23-3 under different culture conditions

如加入3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）后，在12.63 min產(chǎn)生基峰為m/z 736.43的化合物；加入3-羥基-L-酪氨酸（10 mmol/L）后，在13.07 min產(chǎn)生基峰為m/z 338.80的化合物；加入3-硝基-L-酪氨酸（10 mmol/L）后，在7.71 min產(chǎn)生基峰為m/z 513.04的化合物；加入3，4-二羥基苯丙酮酸（1 mmol/L）后，在10.05 min和11.12 min分別產(chǎn)生基峰為m/z 520.30和529.25的化合物；而空白組、試劑對照組以及其他誘導(dǎo)組在相同保留時(shí)間則沒有，推測這些前體小分子可能對菌株的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響。

添加FPP（5 μmol/L）后，在7.33 min（基峰m/z 422.99）和11.24 min（基峰m/z 429.25）的化合物強(qiáng)度比其他組略高；添加了金合歡醇的實(shí)驗(yàn)組在13.49 min的化合物（基峰m/z 409.24）與其他組有所區(qū)別，由此推斷萜類側(cè)鏈供體FPP和金合歡醇可能刺激菌株C23-3提高部分化合物的產(chǎn)量。

添加MSB（10 μmol/L）后，在10.64 min產(chǎn)生基峰為m/z 459.26的化合物；添加H2O2（1 mmol/L）后，在12.84 min產(chǎn)生基峰為m/z 338.21的化合物，推測氧化劑MSB和H2O2對菌株C23-3可能造成氧化脅迫，刺激其代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。

加入L-硒代蛋氨酸（61 mmol/L）的實(shí)驗(yàn)組與其他組的BPC無顯著差異，與TLC結(jié)果有一定差異，推測可能某些代謝產(chǎn)物在正離子條件下未能檢測到。

綜上所述，這9種化學(xué)誘導(dǎo)劑可對菌株C23-3代謝產(chǎn)物的種類或產(chǎn)量產(chǎn)生不同程度的影響。

2.4 誘導(dǎo)前后特征代謝產(chǎn)物衍生物分析

除了通過與數(shù)據(jù)庫收錄的二級(jí)質(zhì)譜匹配以指認(rèn)已知化合物，GNPS還可利用二級(jí)質(zhì)譜相似性來分析樣品中各代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，由已知化合物節(jié)點(diǎn)來發(fā)現(xiàn)其可能的同族化合物。

根據(jù)圖3中通過對已知化合物Compounds 1-4相連的主要節(jié)點(diǎn)的二級(jí)質(zhì)譜（圖5-圖7）的分析，主要是其母離子和碎裂離子與已知化合物相應(yīng)離子質(zhì)荷比的關(guān)系，推測這些化合物可能為相應(yīng)已知化合物異構(gòu)體或由其脫水、脫氫、脫氧或降碳而來。與質(zhì)荷比為m/z 425.027的丁內(nèi)酯Ⅰ結(jié)構(gòu)相似的節(jié)點(diǎn)有4個(gè)（Compounds 5-8），質(zhì)荷比依次為m/z 425.028（和丁內(nèi)酯I二級(jí)質(zhì)譜相似又有顯著不同，雖未與其聚在同簇，但推測可能為其異構(gòu)體）、m/z 423.01（丁內(nèi)酯I脫氫產(chǎn)物）、m/z 441.046（Compound 5加氧產(chǎn)物）和m/z 407.021（丁內(nèi)酯I脫水產(chǎn)物）；與質(zhì)荷比為m/z 527.166的土震素B結(jié)構(gòu)相似的節(jié)點(diǎn)有2個(gè)（Compounds 9-10），質(zhì)荷比分別為m/z 511.169（土震素B脫氧產(chǎn)物）和m/z 513.128（土震素B降碳產(chǎn)物，如甲氧基變?yōu)榱u基）；與質(zhì)荷比為m/z 427.236的洛伐他汀結(jié)構(gòu)相似的節(jié)點(diǎn)有3個(gè)（Compounds 11-13），依次是m/z 409.247（脫水產(chǎn)物）、m/z 411.184（脫氧產(chǎn)物）和m/z 429.256（加氫產(chǎn)物）。其中部分化合物在上文BPC譜圖比較中也是獨(dú)特色譜峰。

圖3 菌株C23-3不同培養(yǎng)條件下代謝產(chǎn)物基于二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)系的分子網(wǎng)絡(luò)圖及局部放大圖Fig.3 Molecular network and its partial enlarged diagram of the metabolites of strain C23-3 under different cultural conditions based on MS2 relationships

圖5 Compound 1及其可能衍生物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 5 MS2 spectra of compound 1 and its possible derivatives

圖7 Compounds 3、4及其可能衍生物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 MS2 spectra of compounds 3，4 and their possible derivatives

為了進(jìn)一步分析9種誘導(dǎo)劑對菌株C23-3丁內(nèi)酯類、土震素類及洛伐他汀類特征代謝產(chǎn)物多樣性及產(chǎn)量的影響，對上述GNPS注釋或推測的該三類化合物Compounds 1-13的提取離子色譜圖（Extracted ion chromatogram，EIC）相應(yīng)化合物峰面積進(jìn)行了計(jì)算和比較。

圖6 Compound 2及其可能衍生物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 MS2 spectra of compound 2 and its possible derivatives

結(jié)果（圖8）顯示，添加誘導(dǎo)劑金合歡醇（1 μmol/L）的丁內(nèi)酯Ⅰ產(chǎn)量相對最多，F(xiàn)PP（5 μmol/L）以及MSB（10 μmol/L）誘導(dǎo)組代謝產(chǎn)物中的丁內(nèi)酯Ⅰ略少于金合歡醇組，但FPP組和MSB組的丁內(nèi)酯類的種類和產(chǎn)量更豐富；FPP（5 μmol/L）誘導(dǎo)組的土震素B產(chǎn)量和種類在這九組里相對較優(yōu)，其次是3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）誘導(dǎo)組。而洛伐他汀類代謝產(chǎn)物在3，4-二羥基苯丙酮酸（1 mmol/L）、3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）和硒代蛋氨酸（61 mmol/L）組中產(chǎn)量與多樣性較優(yōu)。綜上所述，菌株C23-3在不同化學(xué)誘導(dǎo)劑的作用下，菌株的特征產(chǎn)物（丁內(nèi)酯Ⅰ、土震素B和洛伐他?。┘捌淇赡苎苌锏姆N類和產(chǎn)量發(fā)生了較大變化。

圖8 菌株C23-3不同化學(xué)調(diào)控條件下的代謝物中特征產(chǎn)物及其衍生物的含量Fig.8 Contents of the characteristic products and their derivatives in the metabolites of strain C23-3 under different chemically regulated conditions

3 討論

研究表明，很多微生物雖然具有豐富的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，但在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下相當(dāng)部分處于沉默狀態(tài)［25］，活性菌株的潛力有待進(jìn)一步挖掘。前體導(dǎo)向生物合成技術(shù)有利于在已知的先導(dǎo)化合物基礎(chǔ)上開展結(jié)構(gòu)優(yōu)化與改造，如黃婷婷［26］向吡啶霉素鏈霉菌NRRL B-2517的野生型菌株飼喂與天然底物3-羥基吡啶羧酸結(jié)構(gòu)類似的芳香羧酸和氨基酸，分離得到幾種新的吡啶霉素結(jié)構(gòu)類似物。本研究考慮了不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和多類型化學(xué)調(diào)控手段（包括化合物骨架的小分子前體類似物、萜類側(cè)鏈供體類似物、氧化脅迫及硒代氨基酸）的綜合運(yùn)用，以利于發(fā)現(xiàn)更好的誘導(dǎo)條件。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明不同類型的化學(xué)誘導(dǎo)劑可對菌株C23-3代謝產(chǎn)物和生物活性的確能產(chǎn)生不同程度的影響，特別是丁內(nèi)酯類、土震素類和洛伐他汀類化合物的多樣性和產(chǎn)量發(fā)生了較大的變化，丁內(nèi)酯類和土震素類化合物被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗神經(jīng)炎癥和乙酰膽堿酯酶抑制活性［15-18］，本研究為抗阿爾茨海默氏癥等活性的新化合物發(fā)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。

另一方面，本研究中不同的調(diào)控條件包括一些前體類似物雖然改變了菌株的代謝，但在質(zhì)譜中并未明顯檢測到含有特定飼喂前體結(jié)構(gòu)片段的預(yù)期丁內(nèi)酯衍生物，推測可能是由于培養(yǎng)基中原有的天然前體（如酪氨酸、苯丙氨酸、對羥基苯丙酮酸和二甲基烯丙基二磷酸）與相應(yīng)合成酶系的親和力更強(qiáng)，故菌株的特征代謝產(chǎn)物丁內(nèi)酯Ⅰ仍是主產(chǎn)物，可能抑制了目標(biāo)化合物的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物改變可能是調(diào)控物對菌株代謝產(chǎn)生了間接影響。如李亞偉等［27］利用真菌有機(jī)相粗提物誘導(dǎo)纖維堆囊菌，發(fā)現(xiàn)加入的誘導(dǎo)物對該菌生長和營養(yǎng)利用無顯著影響，而可能通過小分子信號(hào)物質(zhì)改變關(guān)鍵酶的活性，調(diào)整代謝途徑，進(jìn)而影響目標(biāo)產(chǎn)物埃博霉素的產(chǎn)量。在今后的研究中通過改變前體類似物的加入時(shí)間或加入相應(yīng)的酶抑制劑，有可能會(huì)促進(jìn)相應(yīng)衍生物產(chǎn)生，這有待進(jìn)一步研究。

本研究也顯示基于LC-MS/MS的GNPS分子網(wǎng)絡(luò)對于挖掘菌株多樣性次生代謝產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，可對已知化合物進(jìn)行注釋，并基于二級(jí)質(zhì)譜相似性發(fā)現(xiàn)多樣化的衍生物，比較不同條件下代謝產(chǎn)物差異。但我們也注意到，這一研究工具還有待繼續(xù)完善，有些情況下仍需要輔以人工判斷，但隨著數(shù)據(jù)庫中特定類型化合物二級(jí)質(zhì)譜的積累，它的識(shí)別、聚類能力也會(huì)越來越強(qiáng)。

4 結(jié)論

菌株C23-3在不同化學(xué)誘導(dǎo)劑作用下，其TLC紫外斑點(diǎn)、化學(xué)顯色及生物活性斑點(diǎn)對比空白組和對照組有顯著變化；利用GNPS和LC-MS/MS分析其代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)9種誘導(dǎo)劑可刺激菌株C23-3代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量發(fā)生不同程度的變化，其中金 合 歡 醇（1 μmol/L）、FPP（5 μmol/L）、MSB（10 μmol/L）和3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）等 4 種誘導(dǎo)劑效果較好，可刺激菌株產(chǎn)生多樣化的丁內(nèi)酯類化合物和土震素類化合物。這為抗氧化或乙酰膽堿酯酶抑制活性化合物的深入研究提供基礎(chǔ)，對抗AD藥物的研發(fā)具有一定的科學(xué)意義。