葉敏 高教琪 周雍進(jìn)

（1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)研究部，大連 116023；2. 大連市能源生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023）

天然產(chǎn)物是一類來(lái)源于微生物或植物中具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)功能，特別在抗癌、抗菌、抗炎癥上發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是藥物的重要組成部分［1］。隨著人們需求不斷增加，迫切需要經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)供應(yīng)。近年來(lái)，合成生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)等技術(shù)快速發(fā)展，使得利用微生物細(xì)胞工廠合成高附加值天然產(chǎn)物有望成為一種有效的替代方式。遺憾的是，目前大多關(guān)于天然產(chǎn)物生物合成的研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室層面上，如何平衡外源代謝途徑和內(nèi)源網(wǎng)絡(luò)提高生物合成效率仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)［2］。

目前，最常用底盤細(xì)胞是模式生物大腸桿菌、釀酒酵母，其清晰的遺傳背景和成熟的操作工具、調(diào)控手段等使得其廣泛用于天然產(chǎn)物合成［3-5］。然而，大腸桿菌難以表達(dá)真核酶如P450，而釀酒酵母偏好生產(chǎn)乙醇影響產(chǎn)物得率。此外，二者需要溫和生存條件，且底物利用范圍有限，特別是近年來(lái)第三代原料生物轉(zhuǎn)化倡導(dǎo)利用廉價(jià)的一碳資源［6］，因此迫切需要拓展宿主范圍。

近年來(lái)，非常規(guī)酵母由于其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)獲得越來(lái)越多的關(guān)注。非常規(guī)酵母主要是指釀酒酵母和裂殖酵母以外的其他酵母，常見的包括解脂耶氏酵母、巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母等。而利用非常規(guī)酵母作為細(xì)胞工廠已經(jīng)應(yīng)用于合成多種產(chǎn)物［7］，特別是羧酸化合物［8］與生物燃料等［9］。非常規(guī)酵母在發(fā)酵條件耐受性、廣譜底物利用能力、高密度發(fā)酵上具有突出優(yōu)勢(shì)［10］；此外，基因編輯技術(shù)和平臺(tái)的不斷發(fā)展［11］，為非常規(guī)酵母細(xì)胞工廠構(gòu)建提供了強(qiáng)有力技術(shù)支持。

本文系統(tǒng)總結(jié)非常規(guī)酵母合成天然產(chǎn)物（特別是萜類和黃酮類化合物）的研究進(jìn)展，介紹了相關(guān)代謝工程改造手段和策略；并與模式微生物進(jìn)行對(duì)比分析其作為細(xì)胞工廠的優(yōu)劣勢(shì)；最后介紹非常規(guī)酵母基因操作平臺(tái)的發(fā)展及其合成更復(fù)雜生物堿等天然產(chǎn)物的潛力，并展望其未來(lái)發(fā)展的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

1 非常規(guī)酵母

模式微生物如釀酒酵母具有清楚的遺傳背景和成熟的遺傳操作平臺(tái)，在天然產(chǎn)物合成上取得了良好的進(jìn)展［12-13］。然而，釀酒酵母面臨耐受溫度、有機(jī)溶劑的適應(yīng)范圍窄［10，14］，可利用底物有限［14］等不足。另一方面，釀酒酵母Crabtree效應(yīng)使得高密度發(fā)酵存在困難（圖1）。尋求和開發(fā)其他酵母細(xì)胞，有望拓展酵母細(xì)胞工廠的應(yīng)用潛力。

圖1 釀酒酵母和非常規(guī)酵母優(yōu)缺點(diǎn)比較Fig.1 Comparison between Saccharomyces cerevisiae and non-conventional yeasts

非常規(guī)酵母一般指除了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）以外的其他酵母。目前研究最為廣泛的非常規(guī)酵母是解脂耶氏酵母，其具有相對(duì)全面的基因組注釋，因此更易于進(jìn)行基因操作，在β-胡蘿卜素類化合物、白藜蘆醇、柚皮素生物合成上表現(xiàn)優(yōu)越，超越了釀酒酵母中取得的產(chǎn)量。解脂耶氏酵母作為產(chǎn)油酵母，其優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞質(zhì)中乙酰輔酶A和NADPH供給充足，有利于下游產(chǎn)物合成，其胞內(nèi)脂質(zhì)體能為長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷烊划a(chǎn)物合成與儲(chǔ)存提供疏水環(huán)境［15］；特別是，解脂耶氏酵母能夠以長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷舅嶙鳛槲ㄒ惶荚?，?shí)現(xiàn)廉價(jià)原料的高效轉(zhuǎn)化［16］；并且和模式生物相比表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性［17］。然而，解脂耶氏酵母生理特性的研究沒(méi)有釀酒酵母深入，其培養(yǎng)大多采用豐富培養(yǎng)基［17-18］，成本較高；此外，解脂耶氏酵母在合成更為復(fù)雜的天然產(chǎn)物如黃酮和生物堿的報(bào)道較少，可能是其外源途徑的構(gòu)建及與內(nèi)源代謝的適配充滿挑戰(zhàn)。

除解脂耶氏酵母外，還有系列非常規(guī)酵母具備多種優(yōu)良特性，有望成為構(gòu)建細(xì)胞工廠的優(yōu)良宿主［19］。比如：甲醇酵母（巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母等）能夠以甲醇作為唯一碳源，而甲醇的同化需要木酮糖-5磷酸（Xu5P）循環(huán)［20-21］，因此其合成途徑磷酸戊糖支路（PPP）效率很高，能夠供應(yīng)更多PPP中間體和NADPH，可能有利于黃酮類等天然產(chǎn)物的合成；漢遜酵母和畢赤酵母還都是工業(yè)上外源蛋白表達(dá)宿主，具有更類似高等生物蛋白翻譯后修飾能力［22］，對(duì)于外源酶的表達(dá)更有利；此外，漢遜酵母還能夠耐受40℃以上的高溫［23］，在工業(yè)發(fā)酵上能夠節(jié)約冷卻成本。還有乳酸克魯維酵母、樹干畢赤酵母，分別能夠利用乳糖、木糖；紅發(fā)夫酵母具備天然蝦青素合成能力，這些酵母都被GRAS認(rèn)證且能夠進(jìn)行高密度發(fā)酵［14］，具備合成多種天然產(chǎn)物的潛力。

盡管如此，目前在天然產(chǎn)物細(xì)胞工廠的構(gòu)建方面，非常規(guī)酵母的研究還非常有限，主要原因在于基因操作平臺(tái)不夠完善，因而構(gòu)建復(fù)雜天然產(chǎn)物合成途徑相對(duì)困難。隨著基因組測(cè)序技術(shù)、CRISPRCas9基因編輯平臺(tái)以及合成生物學(xué)元件等的快速發(fā)展，非常規(guī)酵母將具有越來(lái)越大的應(yīng)用潛力。

2 非常規(guī)酵母合成萜類化合物

2.1 萜類化合物合成

萜類是由異戊烯基為單元合成，包括單萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）、三萜（C30）、四萜（C40）等，這一大類化合物通常包含抗癌、消炎、鎮(zhèn)痛等藥用效果，也常在化妝品、調(diào)味品、香精香料或食品中添加來(lái)修飾產(chǎn)品的色、香、味。萜類化合物是目前以非常規(guī)酵母作為細(xì)胞工廠研究最為廣泛的天然產(chǎn)物。

酵母體內(nèi)存在天然萜類合成途徑——甲羥戊酸（MVA）途徑，通過(guò)表達(dá)不同外源萜類合酶能夠?qū)崿F(xiàn)多種化合物合成（圖2）。解脂耶氏酵母是優(yōu)良的萜類化合物合成細(xì)胞工廠（表1），特別在合成諾卡酮、類胡蘿卜素類化合物（C40，包括番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-紫羅蘭酮和蝦青素）時(shí)，其產(chǎn)量甚至超過(guò)了模式生物。由于解脂耶氏酵母天然積累油脂，為這些長(zhǎng)鏈化合物提供了良好的疏水環(huán)境，避免了細(xì)胞膜積累從而影響細(xì)胞活力［15］。研究表明通過(guò)增加細(xì)胞質(zhì)脂肪酸合成能夠促進(jìn)番茄紅素的積 累［15，24-25］，證實(shí)細(xì)胞疏水環(huán)境對(duì)于長(zhǎng)鏈萜類合成至關(guān)重要。在單萜檸檬烯和倍半萜紫穗槐二烯等的合成上，非常規(guī)酵母產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于模式生物，可能是因?yàn)轶w內(nèi)輔因子NADPH和ATP代謝不平衡［26］。另外，在發(fā)酵條件上，解脂耶氏酵母通常以復(fù)雜培養(yǎng)基（YPD）培養(yǎng)細(xì)胞［18，27-28］，增加了生產(chǎn)成本。

表1 非常規(guī)酵母及模式生物合成部分萜類化合物（標(biāo)粗表示非常規(guī)酵母）Table 1 Terpenoids biosynthesis by model microorganisms and non-conventional yeasts（Bold ones are non-conventional yeasts）

圖2 甲羥戊酸途徑合成萜類化合物Fig. 2 Mevalonate（MVA）pathway for terpenoids biosynthesis

其他非常規(guī)酵母在萜類合成上的研究非常有限，目前，只在畢赤酵母［29-30］、克魯維酵母［31］、假絲酵母［32］等中實(shí)現(xiàn)了少數(shù)萜類化合物合成，并且由于缺乏遺傳操作平臺(tái)，代謝改造策略與最終產(chǎn)量均受到局限。

2.2 改造策略

為了在酵母中實(shí)現(xiàn)萜類等天然產(chǎn)物高效合成，需要發(fā)展代謝工程策略對(duì)細(xì)胞代謝進(jìn)行優(yōu)化，一般包括優(yōu)化天然產(chǎn)物本身生物合成途徑、強(qiáng)化前體供應(yīng)和輔因子、弱化副反應(yīng)以及區(qū)室化等代謝工程策略（表2）。這些代謝工程策略通用性強(qiáng)，適用于多種天然產(chǎn)物合成優(yōu)化，但是需要根據(jù)不同天然產(chǎn)物生物合成機(jī)制合理選擇改造策略，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物高效合成與細(xì)胞生長(zhǎng)平衡。

表2 非常規(guī)酵母合成天然產(chǎn)物改造策略Table 2 Engineering strategies for biosynthesis of natural products in non-conventional yeasts

2.2.1 MVA途徑關(guān)鍵基因調(diào)控 HMGR是MVA途徑的關(guān)鍵基因，它具有N-基端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜結(jié)構(gòu)域，研究表明只過(guò)表達(dá)C-基端的催化結(jié)構(gòu)域能夠顯著提高萜類化合物的產(chǎn)量，并且避免降解而更穩(wěn)定的存在于細(xì)胞中［58］。過(guò)表達(dá)解脂耶氏酵母HMGR［51］和tHMGR［46］使檸檬烯和β-紫羅蘭酮產(chǎn)量分別提升14倍和10倍。假絲酵母中發(fā)現(xiàn)截短的tHMGR比HMGR有更好的效果［32］；為了避免氧化還原狀態(tài)不平衡，在解脂耶氏酵母中表達(dá)彼得里鮑特氏菌NADH依賴的HMGR［18］，能夠使細(xì)胞利用含量更多的NADH。ERG12也是關(guān)鍵基因，過(guò)表達(dá)提高了相應(yīng)萜類化合物的合成［28，51］；另一個(gè)重要基因IDI1調(diào)控DMAPP和IPP之間的轉(zhuǎn)化，結(jié)合HMGR過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)萜類化合物的合成［28，59］。

2.2.2 強(qiáng)化前體和輔酶供應(yīng)與削弱副反應(yīng) 乙酰輔酶A是萜類合成的重要前體，其高效供應(yīng)是萜類高效合成的關(guān)鍵之一。在解脂耶氏酵母中，過(guò)表達(dá)檸檬酸裂解酶ACL1和 ACL2強(qiáng)化檸檬酸裂解提供乙酰輔酶A，結(jié)合弱化三羧酸（TCA）循環(huán)，將番茄紅素產(chǎn)量提升2-3倍［25］。NADPH是MVA途徑合成的關(guān)鍵輔酶，在解脂耶氏酵母中過(guò)表達(dá)甘露醇脫氫酶提高NADPH供給使角鯊烯積累量提高11%［52］。ERG20是調(diào)控不同碳原子數(shù)萜類化合物合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，不同的Erg20突變體能夠傾向性合成不同萜類化合物前體。野生型Erg20p偏向合成FPP，而突變體Erg20pF96W-N127W利于GPP合成［60］，Erg20pF96C能夠直接催化IPP和DMAPP形成GGPP［61］。當(dāng)以倍半萜為目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，融合表達(dá)Erg20～Fpps能夠顯著提升產(chǎn)量［18］，且能減少副產(chǎn)物角鯊烯的積累。

除此之外，為了使代謝流盡可能流向目標(biāo)產(chǎn)物，需要消除/弱副反應(yīng)。為了提高目標(biāo)萜類化合物產(chǎn)量，往往需要弱化胞內(nèi)甾醇的生物合成，而甾醇是合成細(xì)胞生長(zhǎng)必需物質(zhì)的前體，所以只能對(duì)副反應(yīng)進(jìn)行弱化。常用的方法包括弱化ERG9表達(dá)，在解脂耶氏酵母中，采用弱啟動(dòng)子PERG1，PERG11或截短PERG9的形式弱化ERG9表達(dá)，蝦青素的產(chǎn)量提升2-2.5倍［53］；另一可行策略是利用抑制型啟動(dòng)子，通過(guò)誘導(dǎo)物動(dòng)態(tài)調(diào)控基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)副反應(yīng)動(dòng)態(tài)弱化。這一策略在釀酒酵母中有較多嘗試，包括葡萄糖響應(yīng)的啟動(dòng)子PHXT1［62］、甲硫氨酸抑制的啟動(dòng)子PMET［63］，但是在非常規(guī)酵母中可利用的誘導(dǎo)型/抑制型啟動(dòng)子有限。有報(bào)道在解脂耶氏酵母中，嘗試角鯊烯抑制型啟動(dòng)子PERG1和葡萄糖抑制型啟動(dòng)子PICL1來(lái)弱化ERG9表達(dá)［64］，但是對(duì)番茄紅素的生產(chǎn)沒(méi)有明顯效果；而使用甘油強(qiáng)抑制型啟動(dòng)子PALK1導(dǎo)致工程菌在甘油培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受限。這些結(jié)果表明啟動(dòng)子挖掘和表征是非常規(guī)酵母細(xì)胞工廠的重要研究?jī)?nèi)容之一。

2.2.3 細(xì)胞區(qū)室化策略 將萜類合成途徑區(qū)室化也能夠有效避免副反應(yīng)發(fā)生，而且能夠有效削弱中間產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。過(guò)氧化物酶體是理想的區(qū)室化細(xì)胞器，一方面其區(qū)別于線粒體是細(xì)胞呼吸場(chǎng)所，系統(tǒng)改造不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成負(fù)擔(dān)；另一方面其中含有充足的乙酰輔酶A和NADPH前體，利于合成萜類化合物，且單層膜系統(tǒng)便于物質(zhì)穿梭運(yùn)輸。釀酒酵母中將MVA途徑靶向過(guò)氧化物酶體，單萜合成比細(xì)胞質(zhì)途徑提升125倍［33］，角鯊烯產(chǎn)量提高68倍［65］；在畢赤酵母中，將番茄紅素合成基因定位至過(guò)氧化物酶體顯著提高番茄紅素產(chǎn)量［43］。實(shí)際上，非常規(guī)酵母，特別是解脂耶氏酵母和甲醇酵母具有發(fā)達(dá)的過(guò)氧化物酶體，有望成為高附加值萜類化合物合成的理想場(chǎng)所。

如前所述，解脂耶氏酵母中豐富脂質(zhì)體為長(zhǎng)鏈萜類化合物的合成提供了良好的疏水區(qū)室化環(huán)境。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)抑制β-氧化和糖異生提高脂質(zhì)體含量后，番茄紅素產(chǎn)量顯著提升，且主要積累在脂質(zhì)體中［24］；此外過(guò)表達(dá)脂質(zhì)體合成關(guān)鍵基因DGA1顯著提高了角鯊烯［54］和番茄紅素［15］的合成。需要指出，油脂合成也是以乙酰輔酶A為前體，促進(jìn)其合成可能與萜類合成競(jìng)爭(zhēng)前體，因此平衡萜類與脂類合成至關(guān)重要。

3 非常規(guī)酵母合成黃酮類化合物

3.1 黃酮類化合物生物合成

黃酮類化合物是多酚類次級(jí)代謝產(chǎn)物的總稱，它們都具有兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)3個(gè)碳原子相互連接的結(jié)構(gòu)，即C6-C3-C6。黃酮類化合物因?yàn)闈撛诘目咕?、抗腫瘤、抗病毒、抗心腦血管疾病、抗衰老等活性備受關(guān)注，特別在2003年SARS病毒、2019年爆發(fā)的新型冠狀病毒COVID-19治療上，黃酮類化合物被證明具有減輕癥狀的效用［66］。

酵母體內(nèi)需要引入細(xì)菌來(lái)源酪氨酸途徑或植物來(lái)源的苯丙氨酸途徑，由轉(zhuǎn)氨酶催化形成對(duì)香豆酸后，再經(jīng)過(guò)4-香豆酰輔酶A連接酶4CL合成香豆酰輔酶A，再被柚皮素查爾酮合酶CHS催化合成柚皮素查爾酮，最后被P450酶、糖基化酶等修飾形成多種結(jié)構(gòu)各異的黃酮類化合物（圖3）。由于路徑復(fù)雜，目前非常規(guī)酵母中僅解脂耶氏酵母實(shí)現(xiàn)了黃酮類化合物從頭合成（表3）：表達(dá)矮牽牛來(lái)源的4CL，CHS，CHI和圓紅冬孢酵母的TAL實(shí)現(xiàn)了柚皮素的從頭合成［55］，在此基礎(chǔ)上表達(dá)外源P450氧化還原酶CPR、羥基化酶F3H，F(xiàn)3’H，進(jìn)一步合成了黃杉素和圣草酚。Palmer等［57］構(gòu)建的解脂耶氏酵母黃酮底盤細(xì)胞整合多種聚酮合酶，首次檢測(cè)到去甲基姜黃素、（E）-5-（4-hydroxyphenyl）-3-oxopent-4-enoic acid化合物。在解脂耶氏酵母中表達(dá)了外源TAL，ACL，VST基因，在添加2 mmol/L酪氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中白藜蘆醇產(chǎn)量達(dá)到52.1 mg/L［56］，而在釀酒酵母中表達(dá)相同酶在相同培養(yǎng)基條件下產(chǎn)量只有9.5 mg/L［67］，充分證實(shí)解脂耶氏酵母具有黃酮化合物高效合成的潛力。雖然多種黃酮化合物在非常規(guī)酵母中實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為底物的從頭合成（表3），但總體合成效率不高?？赡苁且?yàn)橥庠疵富盍τ邢?，后續(xù)高效酶挖掘和酶工程改造可能是研究重點(diǎn)。

表3 非常規(guī)酵母及模式生物合成部分黃酮類化合物（標(biāo)粗表示非常規(guī)酵母）Table 3 Flavonoids biosynthesis by model microorganisms and non-conventional yeasts（Bold ones are non-conventional yeasts）

圖3 黃酮類化合物生物合成途徑Fig.3 Flavonoids biosynthetic pathways

3.2 改造策略

黃酮生物合成與萜類生物合成既有相似之處，比如說(shuō)均需要乙酰輔酶A為前體；也有不同之處，比如黃酮直接前體芳香族氨基酸生物合成調(diào)控嚴(yán)格、復(fù)雜。因此，其代謝工程改造既要參考萜類合成的通用策略，又要根據(jù)其生物合成機(jī)制設(shè)計(jì)特異性的改造策略（表2）。

3.2.1 前體供給強(qiáng)化 乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A是黃酮化合物合成的重要前體（圖3），強(qiáng)化其供給將有利于產(chǎn)物積累。分別過(guò)表達(dá)解脂耶氏酵母的檸檬酸裂解途徑、丙酮酸旁路、丙酮酸脫氫酶（PDH）復(fù)合體（去除線粒體定位信號(hào)肽），不同程度促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A供給，并且發(fā)現(xiàn)PDH復(fù)合體、丙酮酸旁路途徑過(guò)表達(dá)能夠?qū)⒅舅岷铣纱x流流向乙酰輔酶A積累［17］。同時(shí)，為了減少油脂積累，增加前體合成，過(guò)表達(dá)PEX10調(diào)控過(guò)氧化物酶體促進(jìn)脂肪酸的β-氧化［57］，提高了黃酮化合物合成能力。另外柚皮素發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)pH會(huì)顯著降低，推測(cè)是乙酸堆積，通過(guò)過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A合酶進(jìn)一步提高了產(chǎn)量［55］。

丙二酸單酰輔酶A由乙酰輔酶A經(jīng)羧化酶ACC1催化形成。ACC1受到磷酸化調(diào)控，在釀酒酵母中通過(guò)表達(dá)解除調(diào)控的突變體ACC1S659A，S1157A，將脂肪酸產(chǎn)量提升了6倍［75］。但是在解脂耶氏酵母中，表達(dá)內(nèi)源野生型ACC1有更好的效果［55］。

3.2.2 合成途徑基因強(qiáng)化 黃酮化合物的直接前體是苯丙氨酸和酪氨酸，而它們的合成受到嚴(yán)格的反饋抑制調(diào)控（圖3）。在釀酒酵母中，催化第一步PEP和E4P合成DAHP的同工酶Aro3和Aro4是關(guān)鍵限速步驟，分別受苯丙氨酸和酪氨酸反饋抑制，將Aro4進(jìn)行氨基酸點(diǎn)突變K229L能夠消除抑制效應(yīng)［76］；分支酸異構(gòu)酶Aro7也是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，受酪氨酸反饋抑制，色氨酸激活，突變?yōu)锳ro7G141S后能夠解除這兩種反饋?zhàn)饔?。有?bào)道在解脂耶氏酵母中引入酪氨酸途徑，通過(guò)與釀酒酵母同源序列比對(duì)，鑒定并表達(dá)了解脂耶氏酵母自身突變體Aro4K221L，柚皮素產(chǎn)量提升了4倍［57］。白藜蘆醇合成中，通過(guò)表達(dá)解脂耶氏酵母自身和釀酒酵母外源的Aro4和Aro7突變體基因，產(chǎn)量提升了2.2倍［56］。

除此之外，合成途徑中其他基因強(qiáng)化也對(duì)產(chǎn)量提升至關(guān)重要。Lv等［55］過(guò)表達(dá)ARO1將柚皮素產(chǎn)量提高30%。氨基酸合成的前體是E4P和PEP，這些化合物在以葡萄糖為底物時(shí)濃度不高且含量不一致，但是它們作為PPP途徑的中間產(chǎn)物，在利用木糖時(shí)含量顯著提高，因此，構(gòu)建木糖響應(yīng)的柚皮素合成途徑能夠強(qiáng)化其合成效率［77］：第一個(gè)階段以葡萄糖利用為主，組成型啟動(dòng)子合成途徑發(fā)揮作用，48 h后開始利用木糖，這一階段木糖主要起到支持生長(zhǎng)的作用，第三階段木糖的消耗轉(zhuǎn)化為產(chǎn)量積累，在YPD+60 g/L木糖搖瓶培養(yǎng)下，產(chǎn)量達(dá)到715 mg/L。

3.2.3 外源基因表達(dá)水平調(diào)控 外源基因表達(dá)強(qiáng)度對(duì)產(chǎn)物合成至關(guān)重要：過(guò)低不利于產(chǎn)物的合成，過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞造成代謝負(fù)擔(dān)；此外，上下游基因表達(dá)強(qiáng)度不同會(huì)使中間代謝物積累，造成細(xì)胞毒性。對(duì)于黃酮類化合物的合成需要引入較多外源基因，最佳的表達(dá)配比最終決定了目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率。在解脂耶氏酵母中，將黃酮合成途徑分為柚皮素合成模塊和下游修飾酶模塊，通過(guò)逐一過(guò)表達(dá)各模塊基因，找出CHS拷貝數(shù)為5，CPR和F3H比例為1∶2時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高［55］。在白藜蘆醇合成時(shí)，交換4CL和VST基因的啟動(dòng)子會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量明顯下降［56］，說(shuō)明改造途徑中代謝流達(dá)到平衡狀態(tài)至關(guān)重要。

目前，在解脂耶氏酵母中對(duì)外源基因表達(dá)強(qiáng)度的調(diào)控均是通過(guò)逐一增加拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且蛋白之間存在空間距離會(huì)導(dǎo)致中間產(chǎn)物泄露。蛋白支架策略可能是今后調(diào)控外源基因表達(dá)強(qiáng)度的一個(gè)重要研究方向。蛋白支架能夠?qū)⒚付ㄎ坏酵粋€(gè)復(fù)合體，并且通過(guò)親和肽數(shù)目的改變來(lái)調(diào)節(jié)酶表達(dá)水平。目前，在大腸桿菌中利用蛋白支架調(diào)控釀酒酵母來(lái)源的ERG13，HMGR，使得甲羥戊酸的合成水平提高77倍［78］。

4 機(jī)遇與挑戰(zhàn)

非常規(guī)酵母細(xì)胞工廠在萜類和黃酮類化合物等天然產(chǎn)物合成方面已取得系列進(jìn)展，展現(xiàn)了巨大應(yīng)用潛力和重要研究?jī)r(jià)值。但是，和模式生物大腸桿菌、釀酒酵母等相比，仍面臨許多技術(shù)瓶頸和亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，主要表現(xiàn)在精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)和合成生物元件匱乏，生理特性認(rèn)知不足、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究滯后等，解決上述瓶頸問(wèn)題是實(shí)現(xiàn)構(gòu)建非常規(guī)酵母細(xì)胞工廠高效合成天然產(chǎn)物的重要前提。

4.1 基因操作平臺(tái)構(gòu)建

非常規(guī)酵母缺乏良好的基因組注釋和高效精準(zhǔn)的基因編輯工具，限制了大片段基因整合、內(nèi)源基因敲除、基因功能評(píng)估。表1和表3中的代謝工程改造大多采用整合質(zhì)粒［15-16，29，79］或非同源末端連接技術(shù)［18］，可能導(dǎo)致整合位點(diǎn)隨機(jī)性較高，基因拷貝數(shù)不確定，而且還可能需要較多篩選標(biāo)記。CRISPR-Cas9技術(shù)的快速發(fā)展，使非常規(guī)酵母實(shí)現(xiàn)高效基因編輯成為可能。

CRISPR-Cas9通過(guò)剪切特定位點(diǎn)能夠?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)高效的基因編輯，通過(guò)篩選不同來(lái)源的Cas9蛋白、調(diào)節(jié)CAS9和gRNA的表達(dá)強(qiáng)度，在多種非常規(guī)酵母中實(shí)現(xiàn)了平臺(tái)構(gòu)建［80］。但是和釀酒酵母以同源重組為主的修復(fù)方式不同，非常規(guī)酵母大多以非同源末端連接（NHEJ）形式參與斷裂雙鏈的修復(fù)，這種方式會(huì)導(dǎo)致基因編輯位點(diǎn)DNA片段隨機(jī)插入、缺失、重排［81］，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)代謝工程改造，使得構(gòu)建的工程細(xì)胞隨機(jī)性大。在NHEJ中，Ku70/80組成的蛋白復(fù)合體會(huì)結(jié)合在斷裂雙鏈末端，防止其被降解的同時(shí)招募核酸內(nèi)切酶和連接酶進(jìn)行修復(fù)［81］，而HR介導(dǎo)的修復(fù)方式則通過(guò)招募Rad51/52等關(guān)鍵蛋白發(fā)揮作用［82］（圖4）。通過(guò)對(duì)這些蛋白進(jìn)行調(diào)控，在非常規(guī)酵母中顯著提升HR修復(fù)效率［83-84］，為基因精確編輯提供技術(shù)支撐，并且能夠?qū)崿F(xiàn)大片段整合及多片段體內(nèi)重組［83-84］。此外，基因敲除或過(guò)表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞造成代謝負(fù)擔(dān)，限制了內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控及與外源代謝路徑適配。而CRISPR衍生的基因調(diào)控策略CRISPRi（抑制）及CRISPRa（激活）調(diào)控系統(tǒng)已在解脂耶氏酵母［85-86］、畢赤酵母［87］等中得到建立，將有助于溫和調(diào)控基因表達(dá)。

圖4 真核生物中的基因編輯技術(shù)及重組機(jī)制Fig. 4 Gene editing methods and recombination mechanisms in eukaryotes

另一方面，基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，能夠?yàn)榉浅Ｒ?guī)酵母提供完善的基因組注釋信息。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等技術(shù)從宏觀角度反映工程菌代謝網(wǎng)絡(luò)信息，揭示工程菌體內(nèi)調(diào)控模式，為代謝工程改造提供靶點(diǎn)。以甲醇酵母為例，由于對(duì)其生理生化特性認(rèn)識(shí)有限，在目前模式生物構(gòu)建一碳同化效率低［88-89］的背景下，從組學(xué)角度出發(fā)，可能能夠更好的探索和闡釋一碳同化機(jī)制，提高甲醇同化效率，為構(gòu)建高效甲醇酵母細(xì)胞工廠提供指導(dǎo)。

4.2 合成生物學(xué)元件挖掘

啟動(dòng)子和終止子是基因表達(dá)的關(guān)鍵元件。目前，非常規(guī)酵母中最常見的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)的PAOX1，解脂耶氏酵母銅離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子［90］，脂肪酸強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子［91］等。但是，總體來(lái)說(shuō)，目前非常規(guī)酵母相關(guān)元件信息十分匱乏，制約了代謝工程改造。后續(xù)挖掘不同強(qiáng)度的組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有助于突破非常規(guī)酵母元件限制，為構(gòu)建高效細(xì)胞工廠奠定良好基礎(chǔ)。特別是啟動(dòng)子能夠從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)，對(duì)于細(xì)胞毒性的天然產(chǎn)物，借助誘導(dǎo)型啟動(dòng)子將生長(zhǎng)與生產(chǎn)分隔開，能夠避免產(chǎn)物過(guò)早積累抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

4.3 代謝物與產(chǎn)物細(xì)胞毒性

產(chǎn)物的積累往往對(duì)細(xì)胞具有毒害作用。除了利用誘導(dǎo)/抑制型啟動(dòng)子進(jìn)行兩階段發(fā)酵生產(chǎn)之外，及時(shí)將目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞也是重要研究策略。研究表明，通過(guò)表達(dá)大腸桿菌來(lái)源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和Grosmania clavigera的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)超家族ABC-G1蛋白，能夠促進(jìn)甜沒(méi)藥烯外排［92］。

實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)進(jìn)化結(jié)合反向代謝工程是一種提高微生物特定表型的有效策略［93］。在釀酒酵母中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)進(jìn)化，提高了工程菌對(duì)中鏈脂肪酸的耐受性從而加強(qiáng)了生產(chǎn)能力［94］，證實(shí)連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)傳代能夠提高細(xì)胞對(duì)某一特定化合物的耐受能力。特別是，近年來(lái)組學(xué)技術(shù)蓬勃發(fā)展，將馴化后得到的菌株借助基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等多組學(xué)聯(lián)用分析，將強(qiáng)化非傳統(tǒng)酵母細(xì)胞工廠耐受性，并提供新的靶點(diǎn)和理論認(rèn)識(shí)。

4.4 復(fù)雜產(chǎn)物譜拓展

目前，非常規(guī)酵母合成天然產(chǎn)物主要集中在萜類化合物和黃酮類化合物（表1和表3），但隨著技術(shù)的不斷完善，更加復(fù)雜的天然產(chǎn)物合成將是未來(lái)重要的研究方向。其中，生物堿就是復(fù)雜天然產(chǎn)物的代表，它是一類具有復(fù)雜環(huán)結(jié)構(gòu)的含氮呈堿性的有機(jī)化合物（除氨基酸、維生素等化合物以外）。它們往往具有非常強(qiáng)的生物活性，比如可卡因具有麻醉作用、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿用于治療急性淋巴癌。由于生物堿的結(jié)構(gòu)多樣、種類眾多、合成途徑復(fù)雜，目前在非常規(guī)酵母中暫時(shí)未見報(bào)道。圖5對(duì)近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的并且在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)從頭合成的單萜生物堿、芐基喹啉生物堿和脫品生物堿的生物合成途徑進(jìn)行了歸納總結(jié)，可以看出，生物堿的生物合成和萜類、黃酮類化合物具有較多相同前體物質(zhì)，但需要更多的P450氧化還原酶等修飾酶。鑒于非常規(guī)酵母在合成復(fù)雜萜類及黃酮類化合物上表現(xiàn)優(yōu)異，相信隨著基因操作平臺(tái)工具的完善，非常規(guī)酵母在合成生物堿等復(fù)雜天然產(chǎn)物上將會(huì)大放異彩。

圖5 常見生物堿合成途徑Fig. 5 Common alkaloids biosynthetic pathways

總之，雖然模式生物釀酒酵母和大腸桿菌在高附加值天然產(chǎn)物的合成上取得良好進(jìn)展，但是非常規(guī)酵母由于其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有望成為天然產(chǎn)物合成的潛在底盤細(xì)胞。在目前基因操作嚴(yán)重受限條件下，非常規(guī)酵母細(xì)胞工廠在萜類化合物和黃酮類化合物的合成上展現(xiàn)較大的應(yīng)用潛力。相信隨著基因編輯工具的發(fā)展、基因元件的開發(fā)以及發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化，非常規(guī)酵母將在天然產(chǎn)物生物合成上扮演越來(lái)越重要的角色，為其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供堅(jiān)實(shí)技術(shù)支撐。