劉偉志，洪 偉，李金龍

0 引言

結(jié)直腸癌(CRC)是全球常見癌癥，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-4]。結(jié)直腸癌在我國也是發(fā)病率較高的癌種，且發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增趨勢(shì)[5]，因此，通過改善結(jié)直腸癌的治療方案來降低結(jié)直腸癌患者的死亡率是目前的熱點(diǎn)問題。

靈芝是我國著名的中草藥之一，研究顯示，靈芝具有抗腫瘤作用，在前列腺癌、肺癌和乳腺癌等不同類型的癌癥中均被證實(shí)具有治療和改善預(yù)后作用[6-11]。靈芝多糖是靈芝的重要活性成分，是從靈芝活性成分中分離純化出的一種高分子化合物，是多糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合體[10-11]。臨床研究顯示，靈芝多糖同樣對(duì)多種腫瘤細(xì)胞起到抑制作用，尤其是在乳腺癌治療中效果明顯[12]。最近有研究指出，靈芝多糖可能具有預(yù)防結(jié)直腸癌的作用[13-14]，但目前針對(duì)靈芝多糖對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的具體生物學(xué)功能影響的資料較少。

本研究分別經(jīng)靈芝多糖和常用治療藥物卡培他濱作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞，對(duì)比不做任何處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞，檢測(cè)靈芝多糖對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力和細(xì)胞凋亡的影響，以此探究靈芝多糖在結(jié)直腸癌中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 準(zhǔn)備人結(jié)直腸癌細(xì)胞系T84(貨號(hào)：BNCC100495)和DiFi(貨號(hào)：BNCC339556)，購自北納生物細(xì)胞庫。分別置于Ham′S F12培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基的1∶1混合物培養(yǎng)基、含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中培養(yǎng)，每2 d傳代1次，在本次實(shí)驗(yàn)中均使用培養(yǎng)的第4代細(xì)胞。

1.2 制備GLP 使用破碎機(jī)將靈芝制成粉末,經(jīng)水浸泡24 h，然后進(jìn)行冷碾壓處理，對(duì)得到的碾壓液進(jìn)行層析，進(jìn)而分離特定區(qū)間分子量的靈芝多糖。稱量0.1 g靈芝多糖粉末,用100 ml超純水溶解。于70 ℃下離心(300 r/min) 12 h后，經(jīng)0.45 μm濾膜在砂芯過濾器中濾去不溶雜質(zhì)，收集濾液，通過50 kD超濾管在6 400 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min。最后收集超濾管內(nèi)濃縮藥液，使用H051冷凍干燥器(LaboGene，Lynge，Denmark)進(jìn)行冷凍干燥，獲得用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的靈芝多糖。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn) 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T84和DiFi結(jié)直腸癌細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶常規(guī)消化后,加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，然后在每孔中接種200 μl的細(xì)胞懸液，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，等到細(xì)胞貼壁后，根據(jù)試驗(yàn)要求分別設(shè)置空白組(即GLP和卡培他濱濃度為0的正常培養(yǎng)基)、GLP組、卡培他濱組3組，設(shè)置4個(gè)濃度梯度。在不同濃度梯度的GLP和卡培他濱作用24 h后，清除原培養(yǎng)基。加入新鮮培養(yǎng)基200 μl和10 μl MTT試劑，等待細(xì)胞貼壁2 h。于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200 μl DMSO溶液，避光置于搖床10 min進(jìn)行振蕩混勻，經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Multiskan MK3，Thermo)在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算結(jié)直腸癌細(xì)胞存活率及對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。增殖抑制率=(1-處理組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%，細(xì)胞存活率=處理組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 分為空白對(duì)照組、GLP組 (加入濃度為2 mg/ml GLP的培養(yǎng)基) 和卡培他濱組 (加入濃度為0.1 μmol/L卡培他濱的培養(yǎng)基)。器械進(jìn)行常規(guī)滅菌，胰蛋白酶消化細(xì)胞后,將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105個(gè)/ml，然后取2 ml T84和DiFi結(jié)直腸癌細(xì)胞,分別和3組培養(yǎng)基作用24 h后接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁6 h后，棄去培養(yǎng)基。用100 μl無菌移液管槍頭筆直刮擦其路徑上的細(xì)胞，用PBS洗滌3次清除被刮擦下來的細(xì)胞。在0 h、24 h后，在顯微鏡下拍照，記錄細(xì)胞劃痕區(qū)域變化，并通過Image J計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、GLP組 (加入濃度為5 mg/ml GLP的培養(yǎng)基) 和卡培他濱組 (加入濃度為50 nmol/L卡培他濱的培養(yǎng)基)。在Transwell小室中加入基質(zhì)膠，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，待基質(zhì)膠凝固后吸去殘余的液體，在上室中加入三組培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后的T84和DiFi結(jié)直腸癌細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，下室加入正常培養(yǎng)基。取出小室后，用濕潤的棉簽清除小室上室中殘留的細(xì)胞，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞約20 min，PBS再洗滌3次。晾干后置于倒置顯微鏡下，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù) 分為空白對(duì)照組、GLP組(加入濃度為5 mg/ml GLP的培養(yǎng)基) 和卡培他濱組(加入濃度為50 nmol/L卡培他濱的培養(yǎng)基)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T84和DiFi結(jié)直腸癌細(xì)胞，分別在3組培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后接種于6孔板中，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/孔，等細(xì)胞貼壁4 h后去除原培養(yǎng)基，然后經(jīng)不含EDTA的胰酶消化后，離心后用PBS清洗。根據(jù)FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)操作說明，用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。加入1 ml稀釋為1×的Binding Buffer，隨后沖懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到流式管里，然后將PI和Annexin V-FITC(5 μl)加入細(xì)胞懸浮液(100 μl)中，室溫下于避光條件下孵育15 min。離心5 min后棄上清液，加入5 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，并通過Guava EasyCyte流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 靈芝多糖抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度梯度的靈芝多糖和卡培他濱作用于T84和DiFi細(xì)胞時(shí)，相較于空白對(duì)照組，細(xì)胞在OD490nm的吸光值均顯著降低(圖1A)，指示結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖功能和細(xì)胞活力受到抑制，且隨著靈芝多糖和卡培他濱濃度增加，對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制率也明顯增加，細(xì)胞存活率降低(圖1B-C)。即靈芝多糖和卡培他濱的效果相近，能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力。

2.2 靈芝多糖抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靈芝多糖或卡培他濱作用后，T84和DiFi細(xì)胞的遷移速率相比空白對(duì)照組顯著降低(圖2A)，提示結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力受到靈芝多糖或卡培他濱抑制；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，經(jīng)靈芝多糖或卡培他濱作用后的T84和DiFi細(xì)胞，其侵襲能力和空白對(duì)照組相比明顯受到抑制(圖2B)。結(jié)果顯示，靈芝多糖能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖1 靈芝多糖抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力

圖2 靈芝多糖抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

2.3 靈芝多糖促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，靈芝多糖或卡培他濱作用后的T84和DiFi細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組(圖3)。結(jié)果顯示，靈芝多糖和卡培他濱的作用相似，能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。

圖3 靈芝多糖促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡

3 討論

結(jié)直腸癌是世界上最常見的癌癥和癌癥致死原因之一[15]，目前其主要治療手段包括手術(shù)切除和化療，然而由于療效的有限性和器官毒性，這些療法可能受到限制。尋找不良反應(yīng)小的抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的天然化合物成為目前研究的熱點(diǎn)。

最近研究顯示，靈芝多糖具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞活力的作用，可以通過Akt/ERK和MAPK/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡[16-17]。本研究顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞T84和DiFi經(jīng)靈芝多糖作用后，細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組，且與卡培他濱作用后的細(xì)胞凋亡率相近。即靈芝多糖可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，且效果與卡培他濱差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有作為結(jié)直腸癌治療中新型抑癌天然化合物的潛力。

此外，本研究結(jié)果顯示，靈芝多糖作用后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，隨著靈芝多糖濃度的增加，對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制率呈上升趨勢(shì)，結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力不斷下降，且靈芝多糖作用的總體趨勢(shì)和卡培他濱相近；在對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力影響上，靈芝多糖的抑制效果同樣與卡培他濱相近?？ㄅ嗨麨I用于結(jié)直腸癌的治療過程中，毒副作用較大，不良反應(yīng)率較高[18]，而在靈芝多糖提取和使用方法逐漸成熟的情況下[19]，將靈芝多糖用于結(jié)直腸癌的治療中具有一定的可行性。

綜上所述，靈芝多糖對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力有抑制作用，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，效果與卡培他濱接近，在結(jié)直腸癌治療上具有潛力，具有研究前景。