陳聰 倪樂宜 陳育梅

卵巢子宮內(nèi)膜樣癌是來源于子宮內(nèi)膜和卵巢表面上皮的卵巢上皮性惡性腫瘤，占卵巢上皮性腫瘤的10%[1]。子宮內(nèi)膜異位癥和上皮性卵巢癌之間的相關(guān)性一直有所報(bào)道，有學(xué)者認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥可能是上皮性卵巢癌的癌前病變[2]；子宮內(nèi)膜異位癥患者的卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)增加[3]。子宮內(nèi)膜異位癥是一種與免疫及炎癥反應(yīng)相關(guān)的慢性疾病，發(fā)生機(jī)制與多因素相關(guān)，其中涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活等[4]。近年來生物信息學(xué)分析方法為腫瘤發(fā)生機(jī)制、早期診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)等研究提供了思路[5]。本研究通過高通量基因表達(dá)（gene expression databases，GEO）數(shù)據(jù)庫識(shí)別由正常子宮內(nèi)膜向卵巢子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)展?jié)撛诘拿庖呦嚓P(guān)生物標(biāo)志物，進(jìn)行生物學(xué)功能和信號(hào)通路分析，探討其相互作用網(wǎng)絡(luò)，以期為卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù) 從GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）搜索關(guān)鍵詞“卵巢子宮內(nèi)膜樣癌”，樣本滿足以下條件：（1）使用從人體組織獲得的樣本；（2）芯片同時(shí)包含健康樣本和卵巢子宮內(nèi)膜樣癌腫瘤組織；（3）樣本總數(shù)≥10，且數(shù)據(jù)處理合格。獲得滿足條件的GSE57545芯片數(shù)據(jù)微陣列數(shù)據(jù)集，GSE57545數(shù)據(jù)集中包含29份正常子宮內(nèi)膜樣本和18份卵巢子宮內(nèi)膜樣癌樣本。

1.3 差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析 本研究使用DAVID6.8在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）[6]對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析提高結(jié)果的可靠性，GO分析（http：//geneontology.org）包括分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組成3個(gè)部分，KEGG（http：//www.kegg.jp）是一個(gè)存儲(chǔ)基因組、疾病、生物化學(xué)信息等大量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，用來研究與差異表達(dá)基因相關(guān)的潛在信號(hào)通路，當(dāng)P＜0.05和節(jié)點(diǎn)數(shù)≥10認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明基因呈顯著富集。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為研究差異表達(dá)基因之間關(guān)鍵通路的相互作用，利用STRING在線分析工具（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape3.7.2軟件計(jì)算連接度最高的10個(gè)基因作為關(guān)鍵基因。

1.5 差異表達(dá)基因富集途徑分析 pathview（https://pathview.uncc.edu/analysis）可以將信號(hào)通路可視化，可基于KEGG富集分析結(jié)果將基因的表達(dá)、調(diào)控和相關(guān)功能帶入路徑中。

1.6 關(guān)鍵基因的生存分析 Kaplan-Meier繪圖儀（http://kmplot.com/analysis/）生物信息分析平臺(tái)中共含有1 435例卵巢癌患者的數(shù)據(jù)，隨訪時(shí)間為250個(gè)月，可基于對(duì)本研究篩選出的10個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行在線生存分析檢驗(yàn)生物標(biāo)志物，并計(jì)算出95%CI和P值，評(píng)估卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的免疫相關(guān)關(guān)鍵基因的預(yù)后價(jià)值。

2 結(jié)果

表1 卵巢子宮內(nèi)膜樣癌差異表達(dá)基因

2.2 差異表達(dá)基因的GO分析和KEGG富集分析結(jié)果 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析（表2）和KEGG富集分析（表3），GO分析表明，差異表達(dá)基因主要富集在“免疫反應(yīng)”“IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路”“炎癥反應(yīng)”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“先天免疫反應(yīng)”“細(xì)胞黏附”“RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控”的生物學(xué)過程中，細(xì)胞成分主要富集在“質(zhì)膜外側(cè)面”“質(zhì)膜”“細(xì)胞外基質(zhì)”“細(xì)胞表面”“膜”“原生質(zhì)膜的組成成分”“細(xì)胞外泌體”“膜的整體成分”“細(xì)胞外區(qū)域”，分子功能主要富集在“受體結(jié)合”和“蛋白質(zhì)結(jié)合”。KEGG富集分析表明差異基因主要在“結(jié)核病”“金黃色葡萄球菌感染”“吞噬體”“抗原處理和呈遞”“Toll樣受體信號(hào)通路”“細(xì)胞黏附分子”等信號(hào)通路富集。這些差異表達(dá)基因的富集途徑表明它們主要參與機(jī)體的免疫與炎癥反應(yīng)。

表2 差異表達(dá)基因的G O富集分析

表3 差異表達(dá)基因的K EGG富集分析

2.3 差異表達(dá)基因的PPI分析結(jié)果 將篩選出的差異表達(dá)基因提交到STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建出具有84個(gè)節(jié)點(diǎn)和599條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1），并用Cytoscape進(jìn)行可視化，基于該網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用CytoHubba插件從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出連接度最高的10個(gè)關(guān)鍵基因，分別是細(xì)胞黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）、C-X-C趨化因子配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、C-X-C基序趨化因子配體10（C-XC motif chemokine ligand 10，CXCL10）、IL-18、C-X-C基序趨化因子配體1（C-X-C motif ligand 1，CXCL1）、C-X-C基序趨化因子配體2（C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）、C-X-C基序趨化因子配體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）（表4），根據(jù)關(guān)鍵基因確定差異表達(dá)基因之間的相互作用模式。

表4 10個(gè)連接度最高的關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)分?jǐn)?shù)

圖1 差異表達(dá)基因的蛋白互作（PP I）網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 富集途徑中重疊差異表達(dá)基因的調(diào)控 使用pathview繪制富集途徑，展現(xiàn)差異表達(dá)基因發(fā)揮的作用，“吞噬體”信號(hào)通路中TLR2等許多上調(diào)基因誘導(dǎo)了Toll樣受體基因的活化（圖2，見插頁），從而激活“Toll樣受體信號(hào)通路”中PI3K-Akt信號(hào)通路，引起免疫基因的高表達(dá)，CXCL12編碼免疫調(diào)節(jié)和參與炎癥過程有關(guān)的分泌蛋白IL-12，產(chǎn)生促炎癥反應(yīng)效應(yīng)（圖3，見插頁）?！翱乖幚砗统蔬f”信號(hào)通路中免疫物質(zhì)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ的高表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子激活免疫細(xì)胞，通過T細(xì)胞受體信號(hào)通路活化CD4+T細(xì)胞（圖4，見插頁）。通過確定差異表達(dá)基因的全面途徑和網(wǎng)絡(luò)分析展示了導(dǎo)致炎癥和免疫應(yīng)答發(fā)生的路徑。

2.5 10個(gè)關(guān)鍵基因的生存分析結(jié)果 為了確定10個(gè)關(guān)鍵基因的預(yù)后價(jià)值，使用Kaplan-Meier繪圖儀生物信息分析平臺(tái)評(píng)估1 435例卵巢癌患者的總生存時(shí)間和無復(fù)發(fā)生存時(shí)間，發(fā)現(xiàn)TLR2、CXCL10、CXCL12、IL-18的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后不良相關(guān)，CXCL8、GAPDH、CXCL1的高表達(dá)是卵巢癌患者良好預(yù)后的相關(guān)因素，ICAM1、CXCL2、PTGS2于總體生存分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

雖然有很多研究認(rèn)為卵巢子宮內(nèi)膜樣癌與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)，但其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。近年來隨著基因組測序、高通量測序等技術(shù)的不斷改進(jìn)，生物信息學(xué)分析方法被廣泛應(yīng)用于對(duì)芯片數(shù)據(jù)集的分析。故探索卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的潛在關(guān)鍵免疫基因和生物標(biāo)志物為了解其發(fā)病機(jī)制，做到早期診斷和預(yù)后判斷提供了有效的方法[7]。本研究通過對(duì)GSE57545數(shù)據(jù)集中18個(gè)卵巢子宮內(nèi)膜樣癌組織樣本和29個(gè)正常子宮內(nèi)膜組織樣本分析，共篩選出了87個(gè)差異表達(dá)基因，其中54個(gè)上調(diào)基因和33個(gè)下調(diào)基因。通過GO富集分析顯示免疫相關(guān)差異表達(dá)基因主要參與“免疫反應(yīng)”“IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路”“炎癥反應(yīng)”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“先天免疫反應(yīng)”“細(xì)胞黏附”“RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控”等生物學(xué)過程，有研究表明免疫功能紊亂、細(xì)胞-基質(zhì)黏附的變化可促進(jìn)細(xì)胞的變異以及腫瘤微環(huán)境的形成[8]，這可能與卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。KEGG信號(hào)通路富集分析中差異表達(dá)基因主要涉及“吞噬體”“抗原處理和呈遞”“Toll樣受體信號(hào)通路”“細(xì)胞黏附分子”等信號(hào)通路，其中“Toll樣受體信號(hào)通路”在多種癌癥中起關(guān)鍵作用[9]，“細(xì)胞黏附分子”信號(hào)通路在細(xì)胞的黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移、增生等過程中也發(fā)揮重要作用[10]。10個(gè)關(guān)鍵基因（ICAM1、TLR2、CXCL8、GAPDH、CXCL10、IL-18、CXCL1、CXCL2、CXCL12、PTGS2）在信號(hào)通路圖中顯示多條通路中多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)可導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞的激活。本研究主要涉及到TLR2和CXCL12免疫基因的異常表達(dá)，其中PI3K-Akt信號(hào)通路的激活引起卵巢癌的發(fā)生已在多項(xiàng)研究得到驗(yàn)證[11]。生存分析表明TLR2、CXCL10、CXCL12、IL-18的高表達(dá)和CXCL8、GAPDH、CXCL1的低表達(dá)可能是判斷卵巢子宮內(nèi)膜樣癌預(yù)后的免疫相關(guān)生物標(biāo)志物。

TLR2編碼的蛋白質(zhì)是Toll樣受體家族的成員，研究表明TLR的激活會(huì)導(dǎo)致Toll樣受體信號(hào)通路上調(diào)從而調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應(yīng)[12]；誘導(dǎo)TLR2的耐受可抑制自身免疫炎癥[13]。也有文獻(xiàn)報(bào)道指出上調(diào)TLR2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能激活炎癥過程的非經(jīng)典途徑并減弱腫瘤的免疫抑制作用，同時(shí)與IL-12結(jié)合可刺激產(chǎn)生與卵巢癌相關(guān)的CD4+和CD8+效應(yīng)T細(xì)胞[14]，與本研究信號(hào)通路中所涉及的關(guān)鍵基因相一致，因此推斷TLR2的過表達(dá)形成腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，促進(jìn)了卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生、發(fā)展。CXCL12編碼間分泌家族的基質(zhì)細(xì)胞衍生的α趨化因子成員，CXCL12及其受體的相互作用可激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在免疫監(jiān)視、炎癥反應(yīng)、組織穩(wěn)態(tài)以及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等許多不同的細(xì)胞功能中發(fā)揮作用[15]，有文獻(xiàn)報(bào)道CXCL12通過與其特異性受體CXCR4相互作用來介導(dǎo)炎癥因子的作用，在子宮內(nèi)膜異位癥模型中CXCR4-CXCL12軸的激活會(huì)增加癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]，由此推測CXCL12的高表達(dá)與卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為其治療提供了新的方向。

綜上所述，慢性炎癥是腫瘤發(fā)生的重要影響因素之一，本研究所選用的數(shù)據(jù)集中在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜上異常表達(dá)的炎癥、免疫相關(guān)基因，這些基因表達(dá)可能增加全身性炎癥反應(yīng)，細(xì)胞通過富集、黏附形成逃逸免疫的腫瘤微環(huán)境從而影響卵巢子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)生、發(fā)展過程。本研究通過生物信息學(xué)方法篩選了87個(gè)差異表達(dá)基因并初步探索了與卵巢子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物和信號(hào)通路；結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在“吞噬體”“抗原處理和呈遞”“Toll樣受體信號(hào)通路”“細(xì)胞黏附分子”等信號(hào)通路來調(diào)控卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生、發(fā)展。盡管已經(jīng)鑒定出幾個(gè)關(guān)鍵基因可作為卵巢子宮內(nèi)膜樣癌判斷發(fā)病機(jī)制、早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，但本研究仍有以下局限性，首先這是一項(xiàng)生物信息學(xué)分析研究，缺乏實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證；其次，無法消除不同組織學(xué)類型對(duì)結(jié)果的影響，不同樣本之間的測量也可能存在差異。