華湯鋒 金紅芳 呂晨 郭小文
神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接損傷和功能紊亂所引起,并由傷害性感受通路活動異常導致的一種慢性疼痛,是臨床亟待解決的常見病、難治病,而痛覺敏化是其特征性表現(xiàn)。既往研究提示,神經(jīng)組織慢性炎癥、神經(jīng)元凋亡和表觀遺傳學改變,可能在其發(fā)病機制中起著重要作用[1-2]。木犀草素(3,4,5,7-四羥基黃酮)是一種天然黃酮類物質,存在于多種植物性食物和中草藥中,有研究表明其具有抗氧化應激、抗炎、抗衰老和神經(jīng)保護功能[3-4]。在對其抗傷害性感受作用的研究中發(fā)現(xiàn),木犀草素可顯著提高急性疼痛和化學刺激引發(fā)的痛閾水平,相關研究報道還證實其對慢性疼痛也有改善作用[5-7]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator1,sirt1)具有調控機體細胞凋亡、炎性反應、氧化應激等作用,其與叉頭轉錄因子1(forkhead box O1,F(xiàn)OXO1)組成的sirt1/FOXO1信號通路可抑制炎性反應和細胞凋亡,在神經(jīng)、血管等組織退行性改變的病理過程中,起著重要的調控作用[8],而黃酮類物質在多項研究中表現(xiàn)出潛在活化sirt1/FOXO1信號通路的作用[3,9]?;诖耍狙芯客ㄟ^慢性坐骨神經(jīng)結扎(chronic constriction injury,CCI)大鼠痛覺敏化模型,探討木犀草素調控sirt1/FOXO1通路對CCI大鼠慢性NP所致痛覺敏化的影響,為進一步臨床應用提供實驗依據(jù),現(xiàn)報道如下。
1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠72只,由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(滬)2018-0016,體重240~260 g,喂飼普通飼料,自由飲水進食,自然節(jié)律采光。木犀草素粉劑(T1027)購自美國Target-Mol公司(純度>98%);兔源GAPDH一抗(ab181602)、兔源sirt1一抗(ab189494)、兔源FOXO1一抗(ab39670)、羊抗兔二抗(ab150077)均購自美國Abcam公司,乙?;疐OXO1一抗(CST9441)購自美國Cell signaling technology公司;sirt1抑制劑EX527粉劑(S1541)購自美國Selleck公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(D8418)購自美國Sigma公司;圖片灰度值分析及凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc)為美國BioRad公司提供。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組 按隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組:假手術組(S組)、坐骨神經(jīng)結扎組(CCI組)、CCI聯(lián)合木犀草素腹腔給藥組(Lut組)、CCI聯(lián)合木犀草素和EX527腹腔給藥組(Lut+EX組),每組各18只。
1.2.2 CCI模型建立 CCI組、Lut組和Lut+EX組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉,消毒大鼠左下肢,切開左側大腿中部暴露坐骨神經(jīng),在接近其分叉之前游離出約7 mm的神經(jīng),用4根320鉻制羊腸線間隔1 mm進行松結扎,要求不阻斷神經(jīng)血供,然后逐層縫合切口。S組僅暴露坐骨神經(jīng)并游離連接組織,但不做CCI。
1.2.3 腹腔給藥 將木犀草素粉劑100 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2 ml中配制成50 mg/ml濃度混懸液備用,EX527粉劑20 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2 ml中配制成10 mg/ml濃度混懸液備用。模型建立后,S組和CCI組腹腔注射含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2.5 ml/kg;Lut組腹腔注射木犀草素混懸液(木犀草素劑量為100 mg/kg)2.0 ml/kg+含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液0.5 ml/kg;Lut+EX組腹腔注射木犀草素混懸液(木犀草素劑量為100 mg/kg)2.0 ml/kg+EX527混懸液(EX527劑量為5 mg/kg)0.5 ml/kg。各組大鼠均連續(xù)給藥7 d。
1.3 疼痛敏化行為學檢測 分別于CCI前1天及CCI后第1、3、7、14天檢測各組大鼠機械性縮足反射閾值(MWT)和熱縮足潛伏期(TWL)。
1.3.1 MWT檢測 采用Von Frey細絲方法。機械測痛儀放置水平桌面,將大鼠放于儀器的有機玻璃箱中,待15min后適應環(huán)境。分別采用不同折力的Von Frey細絲刺激大鼠的足底部,觀察縮足反應情況,當折力達到一定閾值時,足底移開Von Frey細絲而出現(xiàn)快速的縮足反應,將此折力記錄為MWT,每次測量間隔2min,測量3次取平均值。
1.3.2 TWL檢測 采用熱輻射法。取輻射熱痛覺測試儀的聚光光源照射大鼠足底部,觀察和記錄由照射到出現(xiàn)縮足的時間作為TWL,最大閾值為25 s,測量3次取平均值。
1.4 脊髓背角標本采集、保存、組織裂解 各組大鼠于CCI前1天和CCI后第7、14天行為學測定結束后,采用隨機數(shù)字表法分別選取6只大鼠注射過量烏拉坦處死,分離左側(CCI同側)L4~5段脊髓組織,迅速置于液氮中保存。測定前加入蛋白裂解液充分裂解,用Bradford法測定蛋白質的濃度并調整為2μg/μl。
1.5 脊髓背角中sirt1、FOXO1、乙?;疐OXO1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。SDS-PAGE蛋白電泳,硝酸纖維素膜-電轉移系統(tǒng)轉印蛋白,TBS封閉后將硝酸纖維素膜與抗單克隆一抗(1∶1 000),辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗(1∶6 000,Abcam)進行免疫印跡反應。以GAPDH(1∶1 000)為參照,加入的底物DAB H2O2溶液顯色。采用BioRad圖像分析系統(tǒng)進行圖像處理和蛋白表達水平測定。
2.1 各組大鼠MWT的比較 CCI前1天各組大鼠MWT相近(P>0.05);CCI后第1、3、7、14天,CCI組、Lut組、Lut+EX組MWT均低于S組(均P<0.05);CCI后第1、3、7、14天,Lut組MWT明顯高于CCI組(均P<0.05),而Lut+EX組與CCI組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。
表1 各組大鼠M W T的比較(s)
2.2 各組大鼠TWL的比較 CCI前1天各組大鼠TWL相近(P>0.05);CCI后第1、3天,CCI組、Lut組、Lut+EX組TWL均低于S組(均P<0.05),第7、14天時Lut組與S組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),而另兩組明顯低于S組(均P<0.05);CCI后第1、3、7、14天,Lut組TWL均明顯高于CCI組(均P<0.05),而Lut+EX組與CCI組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),見表2。
表2 各組大鼠T WL的比較(s)
2.3 各組大鼠脊髓背角sirt1、FOXO1和乙?;疐OXO1蛋白水平的比較 與S組比較,各組大鼠CCI后第7、14天脊髓背角sirt1蛋白水平均下降(均P<0.05),Lut組和Lut+EX組sirt1蛋白水平較CCI組均明顯增高(均P<0.05)。與S組相比,各組大鼠在CCI后第7、14天脊髓背角FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白水平均上調(均P<0.05);與CCI組和Lut+EX組比較,Lut組在CCI后第7天FOXO1蛋白水平升高,第14天FOXO1蛋白水平降低,乙?;疐OXO1水平較前兩組降低更明顯(均P<0.05)。見表3、4和圖1。
圖1 各組大鼠脊髓背角FOXO1和乙?;疐OXO1蛋白表達電泳圖[沉默信息調節(jié)因子1(sirt1),叉頭轉錄因子1(FOXO1),坐骨神經(jīng)結扎(CCI)]
表3 各組大鼠脊髓sirt1蛋白水平的比較(sirt1/GAPDH灰度值)
NP是一種復雜的慢性疼痛,流行病學研究顯示,人群總體患病率高達3.0%~8.0%[1,10],據(jù)此推算,我國有7 000萬左右患者,導致患者生活質量下降,醫(yī)療資源負擔增加。因其發(fā)病機制目前尚未完全闡明,故其治療效果和預后仍亟待提高。
CCI大鼠模型是一種經(jīng)典的慢性疼痛模型,其主要機制為外周損傷和嚴重炎癥反應誘發(fā)的神經(jīng)病理性改變,可表現(xiàn)出自發(fā)痛、觸誘發(fā)痛和痛覺過敏等,與臨床病理性疼痛特征十分相似。本研究參照Bennett等[11]方法建立CCI模型,因為此種方法非常類似臨床脊神經(jīng)根卡壓炎癥引發(fā)的NP,且操作創(chuàng)傷較小,不給予其它神經(jīng)毒性藥物,因此建模過程中,實驗大鼠均存活至研究結束。CCI大鼠建模后第1~14天,MWT和TWL均明顯低于S組,同時說明CCI模型構建成功。
木犀草素作為一種天然黃酮類物質,存在于多種蔬菜、水果和藥用植物中,并且具有各種藥理活性。而具有鎮(zhèn)痛藥效的中草藥如川穹、紫菀等均含有此類黃酮物質[3-4]。在多項動物研究中證實,木犀草素可以改善NP。不同的給藥方式(椎管內和顱內給藥)呈現(xiàn)不同的下游受體活化,包括GABA受體、阿片μ受體等,而且提示木犀草素抗傷害性疼痛和抗炎效能均很高,且呈劑量相關性[12]。本研究采用腹腔注射給藥,其優(yōu)點是腹膜面積大、血管和淋巴管分布豐富,吸收能力強;另一方面,木犀草素水溶性低,溶媒采用1%DMSO,而腹腔給藥,可降低其毒性反應。本研究結果同樣顯示,Lut組大鼠CCI后各個時點的MWT和TWL均顯著高于CCI組大鼠,而在CCI后第14天,MWT和TWL已接近S組。
行為學多項研究已證實木犀草素可有效改善NP程度,但對其機制的研究,則多集中在抗氧化和抗炎反應的下游蛋白和分子,如NF-κB、IL-1β、基質金屬蛋白酶(MMD-9)、趨化因子(CXCL2、CXCL9)等[13-14],而對調節(jié)蛋白質表達的信號通路和表觀遺傳學調控,如乙?;?、泛素化的上游分子機制的研究尚不足。FOXO1是O-box子家族中叉頭轉錄因子的成員,其余還包括FOXO3、O4、O6等,它在炎癥、代謝、腫瘤、缺血再灌注等多種生理病理調解中,起著重要作用[8,15]。Oscar等[16]在對高齡小鼠椎間盤退行性變引發(fā)的后背痛的研究中發(fā)現(xiàn),隨著年齡增加FOXO1表達下降,其下游靶點sestrin 3(SESN3)和超氧化物歧化酶表達水平也隨之降低。Chen等[17]采用生物信息學和微陣列芯片技術對神經(jīng)痛大鼠的脊髓背角進行研究,發(fā)現(xiàn)FOXO家族基因的mRNA表達增加在整個調控網(wǎng)中承擔關鍵的角色。本研究發(fā)現(xiàn)CCI后,脊髓背角FOXO1蛋白表達顯著增高,尤其乙?;疐OXO1表達上調更為明顯,這必然誘導其下游參與氧化應激和炎癥反應的蛋白和介質上調,而Lut組乙?;疐OXO1上調程度顯著降低,提示木犀草素可調控FOXO1的表達和乙酰化水平。
表4 各組大鼠脊髓FOXO1和乙?;疐OXO1蛋白水平的比較
FOXO1活性受乙?;?、磷酸化和泛素化調節(jié),其中sirt1介導FOXO1脫乙?;饔煤?,F(xiàn)OXO1由細胞核向細胞質轉移,并降低其生物學活性[18]。而大鼠sirt1基因啟動子區(qū)域含有一個擬叉頭樣(forkhead-like,F(xiàn)KHD-L)結合位點,它與FKHD共有元件(TTGTTTAC)在8個堿基中的5個基序上反向排列,并且一組5個胰島素響應性核心重復基序,F(xiàn)OXO1通過與這些結合元件的結合直接激活sirt1轉錄,從而形成sirt1的自反饋通路[19]。sirt1/FOXO1信號通路是能量代謝和基因組穩(wěn)定的關鍵調節(jié)通路。本研究提示,在CCI組中,可以觀察到術后各時點脊髓背角組織中sirt1表達均下調,而乙酰化FOXO1的表達反向增高;而在Lut組中sirt1表達下調較少,同樣乙?;疐OXO1表達反向上調亦不顯。在EX527特異性拮抗sirt1效應后,F(xiàn)OXO1和乙酰化FOXO1表達再次出現(xiàn)顯著增加。由此證實,木犀草素可以部分逆轉CCI導致的脊髓背角sirt1和FOXO1表達和乙?;潭龋M而調控sirt1/FOXO1信號通路。
綜上所述,腹腔注射木犀草素能抑制CCI大鼠的機械痛敏和熱痛敏,通過增加脊髓sirt1表達并抑制FOXO1的乙酰化水平,調控sirt1/FOXO1信號通路,進而抑制下游炎癥、疼痛相關的基因表達,最終改善CCI大鼠的痛覺敏化。但木犀草素的藥理作用尚未完全清楚,在NP中的作用可能存在更為廣泛的分子靶點,長期使用是否存在神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重并發(fā)癥,這些仍需進一步的研究探討。