華湯鋒 金紅芳 呂晨 郭小文

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接損傷和功能紊亂所引起，并由傷害性感受通路活動異常導致的一種慢性疼痛，是臨床亟待解決的常見病、難治病，而痛覺敏化是其特征性表現(xiàn)。既往研究提示，神經(jīng)組織慢性炎癥、神經(jīng)元凋亡和表觀遺傳學改變，可能在其發(fā)病機制中起著重要作用[1-2]。木犀草素（3,4,5,7－四羥基黃酮）是一種天然黃酮類物質，存在于多種植物性食物和中草藥中，有研究表明其具有抗氧化應激、抗炎、抗衰老和神經(jīng)保護功能[3-4]。在對其抗傷害性感受作用的研究中發(fā)現(xiàn)，木犀草素可顯著提高急性疼痛和化學刺激引發(fā)的痛閾水平，相關研究報道還證實其對慢性疼痛也有改善作用[5-7]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator1，sirt1）具有調控機體細胞凋亡、炎性反應、氧化應激等作用，其與叉頭轉錄因子1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）組成的sirt1/FOXO1信號通路可抑制炎性反應和細胞凋亡，在神經(jīng)、血管等組織退行性改變的病理過程中，起著重要的調控作用[8]，而黃酮類物質在多項研究中表現(xiàn)出潛在活化sirt1/FOXO1信號通路的作用[3，9]?；诖耍狙芯客ㄟ^慢性坐骨神經(jīng)結扎（chronic constriction injury，CCI）大鼠痛覺敏化模型，探討木犀草素調控sirt1/FOXO1通路對CCI大鼠慢性NP所致痛覺敏化的影響，為進一步臨床應用提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠72只，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2018-0016，體重240～260 g，喂飼普通飼料，自由飲水進食，自然節(jié)律采光。木犀草素粉劑（T1027）購自美國Target－Mol公司（純度＞98%）；兔源GAPDH一抗（ab181602）、兔源sirt1一抗（ab189494）、兔源FOXO1一抗（ab39670）、羊抗兔二抗（ab150077）均購自美國Abcam公司，乙?；疐OXO1一抗（CST9441）購自美國Cell signaling technology公司；sirt1抑制劑EX527粉劑（S1541）購自美國Selleck公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（D8418）購自美國Sigma公司；圖片灰度值分析及凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc）為美國BioRad公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 按隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組：假手術組（S組）、坐骨神經(jīng)結扎組（CCI組）、CCI聯(lián)合木犀草素腹腔給藥組（Lut組）、CCI聯(lián)合木犀草素和EX527腹腔給藥組（Lut+EX組），每組各18只。

1.2.2 CCI模型建立 CCI組、Lut組和Lut+EX組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉，消毒大鼠左下肢，切開左側大腿中部暴露坐骨神經(jīng)，在接近其分叉之前游離出約7 mm的神經(jīng)，用4根320鉻制羊腸線間隔1 mm進行松結扎，要求不阻斷神經(jīng)血供，然后逐層縫合切口。S組僅暴露坐骨神經(jīng)并游離連接組織，但不做CCI。

1.2.3 腹腔給藥 將木犀草素粉劑100 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2 ml中配制成50 mg/ml濃度混懸液備用，EX527粉劑20 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2 ml中配制成10 mg/ml濃度混懸液備用。模型建立后，S組和CCI組腹腔注射含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2.5 ml/kg；Lut組腹腔注射木犀草素混懸液（木犀草素劑量為100 mg/kg）2.0 ml/kg+含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液0.5 ml/kg；Lut+EX組腹腔注射木犀草素混懸液（木犀草素劑量為100 mg/kg）2.0 ml/kg＋EX527混懸液（EX527劑量為5 mg/kg）0.5 ml/kg。各組大鼠均連續(xù)給藥7 d。

1.3 疼痛敏化行為學檢測 分別于CCI前1天及CCI后第1、3、7、14天檢測各組大鼠機械性縮足反射閾值（MWT）和熱縮足潛伏期（TWL）。

1.3.1 MWT檢測 采用Von Frey細絲方法。機械測痛儀放置水平桌面，將大鼠放于儀器的有機玻璃箱中，待15min后適應環(huán)境。分別采用不同折力的Von Frey細絲刺激大鼠的足底部，觀察縮足反應情況，當折力達到一定閾值時，足底移開Von Frey細絲而出現(xiàn)快速的縮足反應，將此折力記錄為MWT，每次測量間隔2min，測量3次取平均值。

1.3.2 TWL檢測 采用熱輻射法。取輻射熱痛覺測試儀的聚光光源照射大鼠足底部，觀察和記錄由照射到出現(xiàn)縮足的時間作為TWL，最大閾值為25 s，測量3次取平均值。

1.4 脊髓背角標本采集、保存、組織裂解 各組大鼠于CCI前1天和CCI后第7、14天行為學測定結束后，采用隨機數(shù)字表法分別選取6只大鼠注射過量烏拉坦處死，分離左側（CCI同側）L4～5段脊髓組織，迅速置于液氮中保存。測定前加入蛋白裂解液充分裂解，用Bradford法測定蛋白質的濃度并調整為2μg/μl。

1.5 脊髓背角中sirt1、FOXO1、乙?；疐OXO1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。SDS-PAGE蛋白電泳，硝酸纖維素膜-電轉移系統(tǒng)轉印蛋白，TBS封閉后將硝酸纖維素膜與抗單克隆一抗（1∶1 000），辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗（1∶6 000，Abcam）進行免疫印跡反應。以GAPDH（1∶1 000）為參照，加入的底物DAB H2O2溶液顯色。采用BioRad圖像分析系統(tǒng)進行圖像處理和蛋白表達水平測定。

2 結果

2.1 各組大鼠MWT的比較 CCI前1天各組大鼠MWT相近（P＞0.05）；CCI后第1、3、7、14天，CCI組、Lut組、Lut+EX組MWT均低于S組（均P＜0.05）；CCI后第1、3、7、14天，Lut組MWT明顯高于CCI組（均P＜0.05），而Lut+EX組與CCI組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠M W T的比較（s）

2.2 各組大鼠TWL的比較 CCI前1天各組大鼠TWL相近（P＞0.05）；CCI后第1、3天，CCI組、Lut組、Lut+EX組TWL均低于S組（均P＜0.05），第7、14天時Lut組與S組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），而另兩組明顯低于S組（均P＜0.05）；CCI后第1、3、7、14天，Lut組TWL均明顯高于CCI組（均P＜0.05），而Lut+EX組與CCI組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠T WL的比較（s）

2.3 各組大鼠脊髓背角sirt1、FOXO1和乙?；疐OXO1蛋白水平的比較 與S組比較，各組大鼠CCI后第7、14天脊髓背角sirt1蛋白水平均下降（均P＜0.05），Lut組和Lut+EX組sirt1蛋白水平較CCI組均明顯增高（均P＜0.05）。與S組相比，各組大鼠在CCI后第7、14天脊髓背角FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白水平均上調（均P＜0.05）；與CCI組和Lut+EX組比較，Lut組在CCI后第7天FOXO1蛋白水平升高，第14天FOXO1蛋白水平降低，乙?；疐OXO1水平較前兩組降低更明顯（均P＜0.05）。見表3、4和圖1。

圖1 各組大鼠脊髓背角FOXO1和乙?；疐OXO1蛋白表達電泳圖[沉默信息調節(jié)因子1（sirt1），叉頭轉錄因子1（FOXO1），坐骨神經(jīng)結扎（CCI）]

表3 各組大鼠脊髓sirt1蛋白水平的比較（sirt1/GAPDH灰度值）

3 討論

NP是一種復雜的慢性疼痛，流行病學研究顯示，人群總體患病率高達3.0%～8.0%[1，10]，據(jù)此推算，我國有7 000萬左右患者，導致患者生活質量下降，醫(yī)療資源負擔增加。因其發(fā)病機制目前尚未完全闡明，故其治療效果和預后仍亟待提高。

CCI大鼠模型是一種經(jīng)典的慢性疼痛模型，其主要機制為外周損傷和嚴重炎癥反應誘發(fā)的神經(jīng)病理性改變，可表現(xiàn)出自發(fā)痛、觸誘發(fā)痛和痛覺過敏等，與臨床病理性疼痛特征十分相似。本研究參照Bennett等[11]方法建立CCI模型，因為此種方法非常類似臨床脊神經(jīng)根卡壓炎癥引發(fā)的NP，且操作創(chuàng)傷較小，不給予其它神經(jīng)毒性藥物，因此建模過程中，實驗大鼠均存活至研究結束。CCI大鼠建模后第1～14天，MWT和TWL均明顯低于S組，同時說明CCI模型構建成功。

木犀草素作為一種天然黃酮類物質，存在于多種蔬菜、水果和藥用植物中，并且具有各種藥理活性。而具有鎮(zhèn)痛藥效的中草藥如川穹、紫菀等均含有此類黃酮物質[3-4]。在多項動物研究中證實，木犀草素可以改善NP。不同的給藥方式（椎管內和顱內給藥）呈現(xiàn)不同的下游受體活化，包括GABA受體、阿片μ受體等，而且提示木犀草素抗傷害性疼痛和抗炎效能均很高，且呈劑量相關性[12]。本研究采用腹腔注射給藥，其優(yōu)點是腹膜面積大、血管和淋巴管分布豐富，吸收能力強；另一方面，木犀草素水溶性低，溶媒采用1%DMSO，而腹腔給藥，可降低其毒性反應。本研究結果同樣顯示，Lut組大鼠CCI后各個時點的MWT和TWL均顯著高于CCI組大鼠，而在CCI后第14天，MWT和TWL已接近S組。

行為學多項研究已證實木犀草素可有效改善NP程度，但對其機制的研究，則多集中在抗氧化和抗炎反應的下游蛋白和分子，如NF-κB、IL-1β、基質金屬蛋白酶（MMD-9）、趨化因子（CXCL2、CXCL9）等[13-14]，而對調節(jié)蛋白質表達的信號通路和表觀遺傳學調控，如乙?；?、泛素化的上游分子機制的研究尚不足。FOXO1是O-box子家族中叉頭轉錄因子的成員，其余還包括FOXO3、O4、O6等，它在炎癥、代謝、腫瘤、缺血再灌注等多種生理病理調解中，起著重要作用[8，15]。Oscar等[16]在對高齡小鼠椎間盤退行性變引發(fā)的后背痛的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加FOXO1表達下降，其下游靶點sestrin 3（SESN3）和超氧化物歧化酶表達水平也隨之降低。Chen等[17]采用生物信息學和微陣列芯片技術對神經(jīng)痛大鼠的脊髓背角進行研究，發(fā)現(xiàn)FOXO家族基因的mRNA表達增加在整個調控網(wǎng)中承擔關鍵的角色。本研究發(fā)現(xiàn)CCI后，脊髓背角FOXO1蛋白表達顯著增高，尤其乙?；疐OXO1表達上調更為明顯，這必然誘導其下游參與氧化應激和炎癥反應的蛋白和介質上調，而Lut組乙?；疐OXO1上調程度顯著降低，提示木犀草素可調控FOXO1的表達和乙酰化水平。

表4 各組大鼠脊髓FOXO1和乙?；疐OXO1蛋白水平的比較

FOXO1活性受乙?；?、磷酸化和泛素化調節(jié)，其中sirt1介導FOXO1脫乙?；饔煤?，F(xiàn)OXO1由細胞核向細胞質轉移，并降低其生物學活性[18]。而大鼠sirt1基因啟動子區(qū)域含有一個擬叉頭樣（forkhead-like，F(xiàn)KHD-L）結合位點，它與FKHD共有元件（TTGTTTAC）在8個堿基中的5個基序上反向排列，并且一組5個胰島素響應性核心重復基序，F(xiàn)OXO1通過與這些結合元件的結合直接激活sirt1轉錄，從而形成sirt1的自反饋通路[19]。sirt1/FOXO1信號通路是能量代謝和基因組穩(wěn)定的關鍵調節(jié)通路。本研究提示，在CCI組中，可以觀察到術后各時點脊髓背角組織中sirt1表達均下調，而乙酰化FOXO1的表達反向增高；而在Lut組中sirt1表達下調較少，同樣乙?；疐OXO1表達反向上調亦不顯。在EX527特異性拮抗sirt1效應后，F(xiàn)OXO1和乙酰化FOXO1表達再次出現(xiàn)顯著增加。由此證實，木犀草素可以部分逆轉CCI導致的脊髓背角sirt1和FOXO1表達和乙?；潭龋M而調控sirt1/FOXO1信號通路。

綜上所述，腹腔注射木犀草素能抑制CCI大鼠的機械痛敏和熱痛敏，通過增加脊髓sirt1表達并抑制FOXO1的乙酰化水平，調控sirt1/FOXO1信號通路，進而抑制下游炎癥、疼痛相關的基因表達，最終改善CCI大鼠的痛覺敏化。但木犀草素的藥理作用尚未完全清楚，在NP中的作用可能存在更為廣泛的分子靶點，長期使用是否存在神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重并發(fā)癥，這些仍需進一步的研究探討。