藍(lán)宇萍，何圣清，陳利芬，曾蘭芳

(深圳市龍崗中心醫(yī)院體檢科，廣東 深圳 518116)

結(jié)腸癌是人類常見(jiàn)惡性腫瘤之一，隨著我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)變化，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響國(guó)民生命建康[1-2]。結(jié)腸癌臨床早期癥狀較為隱匿，患者多表現(xiàn)為消化不良、腹脹、腹痛等消化道癥狀，中晚期則有疼痛難忍、便血或腹腔積液等癥狀，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，預(yù)后不佳[3]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療對(duì)結(jié)腸癌預(yù)后，提高生存率，延長(zhǎng)生存周期具有重要意義。結(jié)腸癌病變分為多個(gè)階段，如良性腺瘤向惡性腺癌轉(zhuǎn)變、腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等過(guò)程[4-5]。研究證實(shí)，在結(jié)腸癌病變、癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤相關(guān)的細(xì)胞因子水平變化對(duì)疾病分期診療具有重要指導(dǎo)意義[6-7]。有報(bào)道指出[8-9]，腫瘤組織中白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、VEGF和MMP-7等物質(zhì)參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答、組織血管新生、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖等過(guò)程，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致癌變惡化，常作為腫瘤疾病的輔助診療標(biāo)志物。本課題組前期研究報(bào)道[10]結(jié)腸癌患者外周血中IL-8和VEGF的變化，但癌變組織中IL-8、VEGF和MMP-7水平與結(jié)腸癌腫瘤分期有何關(guān)系尚未深入研究。我們檢測(cè)了結(jié)腸癌組織及外周血IL-8、VEGF和MMP-7水平，探索其與腫瘤分期的相關(guān)性，為結(jié)腸癌臨床診療提供一定指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)[10-11]：①經(jīng)病理級(jí)內(nèi)鏡檢查確診為結(jié)腸癌患者；②行結(jié)腸癌手術(shù)切除治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它消化道疾病者；②合并先天性心臟病等嚴(yán)重疾病及肝、腎功能不全者；③有精神系統(tǒng)疾病及無(wú)法配合者。

1.2 一般資料

選取我院2013年6月至2015年6月收治的90例結(jié)腸癌患者設(shè)為觀察組，其中男49例，女41例；年齡43～69歲，平均(52.38±4.76)歲；體重52～77kg，平均(64.33±5.46)kg；根據(jù)Dukes分期分為A、B、C、D四期[8-9]，A期患者20例，B期患者32例，C期23例，D期15例。選擇同期在本院進(jìn)行健康體檢的30例健康者作為對(duì)照組，其中男15例，女15例；年齡42～71歲，平均(53.82±4.51)歲；體重53～76kg，平均(66.02±5.28)kg。兩組研究對(duì)象性別比例、年齡及體重等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者及家屬簽署知情同意書(shū)后展開(kāi)。

1.3 檢測(cè)觀察指標(biāo)

(1)ELISA檢測(cè)外周血清IL-8、VGEF、MMP-7水平。手術(shù)前1d，空腹采集患者靜脈血(4mL)，3 000轉(zhuǎn)離心10min取上層血清，分裝后凍存于-20℃?zhèn)溆谩２捎秒p抗體夾心法測(cè)定血清IL-8(購(gòu)自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司)、VEGF(購(gòu)自上海研輝生物技術(shù)有限公司)和MMP-7水平(購(gòu)自上海研輝生物技術(shù)有限公司)

(2)免疫組化SP法測(cè)定腸癌組織和癌旁正常組織IL-8、VGEF、MMP-7。取患者結(jié)腸癌變組織及癌旁>5cm處正常組織進(jìn)行病理組織檢測(cè)。石蠟包埋后切片(4μm)、脫蠟、酒精梯度脫洗，PBS沖洗后再抗原修復(fù)。室溫避光條件下，滴加過(guò)氧化氫溶后再血清封閉孵育20min；然后棄去血清，分別滴加IL-8、VGEF、MMP-7一抗，冰箱4℃孵育過(guò)夜；次日，PBS沖洗3次后滴加二抗孵育1h。最后，PBS再次洗滌3次，分別DAB顯色、蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固，于恒溫顯色封片光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

(3)IL-8、VGEF、MMP-7的陽(yáng)性表達(dá)評(píng)估。免疫組化染色后，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：<5%(0分)、5%～25%(1分)、25%～50%(2分)、50%～75%(3分)、>75%(4分)；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色(0分)、淺棕黃色(1分)、棕黃色(2分)、褐棕色(3分)。根據(jù)兩者評(píng)分乘積評(píng)估：0～4分為陰性，5～12分為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(200倍或400倍)，計(jì)算IL-8、VGEF、MMP-7陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

觀察組血清IL-8、VEGF及MMP-7均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

2.2 不同Dukes分期結(jié)腸癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

如表2所示，結(jié)腸癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平隨Dukes分期加重逐漸升高。C期、D期患者的血清IL-8、VEGF及MMP-7水平顯著高于A期及B期患者，組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同Dukes分期結(jié)腸癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

2.3 結(jié)腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果比較

結(jié)腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7免疫組化結(jié)果如圖1～3(封三)所示，可見(jiàn)明顯棕黃色陽(yáng)性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，結(jié)腸癌組織中IL-8、VEGF及MMP-7陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.67%，92.22%及82.22%，顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織IL-8、VEGF及MMP-7陽(yáng)性表達(dá)比較

2.4 結(jié)腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7與Dukes分期的相關(guān)性

結(jié)腸癌A期患者中IL-8、VEGF及MMP-7陽(yáng)性發(fā)表率分別為80.00%、90.00%、80.00%，B期患者分別為84.34%、87.50%、81.25%，C期患者分別為95.65%、100.00%、86.96%，D期患者分別為86.67%、93.33%、80.00%。見(jiàn)表4。

表4 結(jié)腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7與臨床Dukes分期相關(guān)性

2.5 患者結(jié)腸癌組織、血清IL-8與VEGF、MMP-7的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，患者血清IL-8與VEGF、MMP-7顯著正相關(guān)(r=0.880，P<0.05；r=0.774，P<0.05)；結(jié)腸癌組織中IL-8也與VEGF、MMP-7顯著正相關(guān)(r=0.622，P<0.05；r=0.473，P<0.05)。

3 討 論

隨著我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)變化，結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅國(guó)民生命建康[1-2]。臨床上治療多采取腫瘤切除術(shù)，大量臨床實(shí)踐表明早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高患者預(yù)后的有效方法，且結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌治療和預(yù)后的重要因素，也是促使腫瘤患者死亡的重要原因[4-5]。因此，密切關(guān)注結(jié)腸癌腫瘤轉(zhuǎn)移一直是臨床研究的熱點(diǎn)。目前，臨床結(jié)直腸癌患者的預(yù)后主要通過(guò)Dukes分期進(jìn)行評(píng)估，需要更簡(jiǎn)單有效的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)患者腫瘤轉(zhuǎn)移，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤組織轉(zhuǎn)移對(duì)臨床預(yù)后判斷及指導(dǎo)治療有非常重要的意義。

關(guān)于腫瘤組織轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確闡述，目前多被認(rèn)為是由腫瘤組織上皮細(xì)胞過(guò)度增生，同時(shí)從原發(fā)部位脫落及轉(zhuǎn)移，獲得生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后誘發(fā)腫瘤組織新生血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織增殖及分化，完成腫瘤組織轉(zhuǎn)移[12-13]。該過(guò)程中腫瘤組織內(nèi)新生血管的生成與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為腫瘤的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及血氧需求，兩者相輔相成加速腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散[14]。腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移依賴于新生腫瘤血管，為腫瘤組織生長(zhǎng)提供所需的血氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。IL-8作為CXC基因家族因子，廣泛存在于腫瘤組織中。本文結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者組織中IL-8陽(yáng)性率顯著高于癌旁正常組織，且在血清IL-8也有較高表達(dá)(P<0.05)；隨著Dukes分期加重，結(jié)腸癌組織和血清中IL-8表達(dá)也逐漸上調(diào)(P<0.05)，這表明IL-8大量釋放，參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

IL-8以旁分泌方式與白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CXCR受體結(jié)合，促使白細(xì)胞趨化進(jìn)入腫瘤組織和引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖形成新生血管，促進(jìn)腫瘤組織轉(zhuǎn)移[15-16]。VEGF和MMP-7被認(rèn)為與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分裂相關(guān)，提高腫瘤生長(zhǎng)速率及侵襲和轉(zhuǎn)移潛力，可作為判斷結(jié)腸癌惡性程度的標(biāo)志物。觀察組患者結(jié)腸癌組織中VEGF及MMP-7陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁正常組織有明顯升高(P<0.05)，同時(shí)血清中VEGF及MMP-7變化和組織中具有一致性。作為促血管生成因子，VEGF可加速內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分裂，增強(qiáng)毛細(xì)血管上皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)新生血管的形成[17-18]；而MMP-7則能降解和破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)和基膜，加速腫瘤細(xì)胞向周圍組織的浸潤(rùn)[19-20]，VEGF和MMP-7協(xié)調(diào)加速了腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力。因此，患者結(jié)腸癌組織和血清中VEGF及MMP-7表達(dá)越高，Dukes分期就越嚴(yán)重。

隨腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，患者結(jié)腸癌組織及血清中IL-8表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，VEGF、MMP-7含量也明顯增加，Pearson相關(guān)性分析顯示IL-8水平與VEGF、MMP-7含量顯著正相關(guān)(P<0.001)，IL-8可作為輔助臨床診療的重要評(píng)估指標(biāo)之一。IL-8在結(jié)腸癌中通過(guò)哪一條信號(hào)通路，直接或間接激活VEGF、MMP-7上調(diào)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展尚未完全明確，具體機(jī)制有待后續(xù)動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，IL-8、VEGF及MMP-7在結(jié)腸癌組織和血清中均有高表達(dá)，與腫瘤Dukes分期密切相關(guān)；同時(shí)結(jié)腸癌組織及血清中IL-8表達(dá)與VEGF及MMP-7明顯正相關(guān)，在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。IL-8、VEGF及MMP-7可作為臨床診療及預(yù)后的重要評(píng)估指標(biāo)，輔助指導(dǎo)臨床治療。