李 軻 禹建鷹 李傳民 傅科杰 郭會清

（1.鄭州海關(guān)，河南鄭州，450003；2.河南捷信檢測認(rèn)證有限公司，河南鄭州，450003；3.寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波，315000）

白假絲酵母菌是最常見的致病性假絲酵母菌，是一類致病性、侵襲性強(qiáng)的深部感染真菌［1］。臨床研究中，白假絲酵母菌感染會引起人體皮膚、黏膜及內(nèi)臟的急、慢性炎癥等［2?3］，且病死率高［4?7］。筆者團(tuán)隊(duì)通過對紡織品生物安全的多年跟蹤研究，認(rèn)為白假絲酵母菌是紡織品污染重點(diǎn)關(guān)注對象［8］。前期研究中，根據(jù)白假絲酵母菌菌落特征已建立相應(yīng)定性、定量傳統(tǒng)方法［9］，在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（以下簡稱MALDI?TOF MS）技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)生化，構(gòu)建了白假絲酵母菌快速定量檢測方法［10］。研究發(fā)現(xiàn)，假絲酵母菌為單細(xì)胞酵母型真菌，菌落形態(tài)與一般細(xì)菌相似，通常假絲酵母菌為具有酵母相和菌絲相雙相菌［11?12］，因此傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和涂片鏡檢鑒別白假絲酵母菌容易造成假陰性結(jié)果。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究選取假絲酵母菌屬高度保守基因5.8S核糖體RNA基因（以下簡稱5.8SrDNA）設(shè)計(jì)假絲酵母菌通用引物，構(gòu)建出假絲酵母菌實(shí)時(shí)熒光PCR初篩模型，初篩提示陽性時(shí)，采用MALDI?TOF MS技術(shù)鑒定確認(rèn)，從亞種水平上對假絲酵母菌進(jìn)行分類，達(dá)到簡單、快捷和有效的鑒定白假絲酵母菌的目的。該研究可作為我國應(yīng)對紡織品白假絲酵母菌污染突發(fā)公共衛(wèi)生事件技術(shù)儲備，預(yù)計(jì)在公共衛(wèi)生和疫情防控中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

白假絲酵母菌ATCC 10231、近平滑假絲酵母菌ATCC 22019、光滑假絲酵母菌ATCC 15126、熱帶假絲酵母菌ATCC 1369、沙門氏菌CICC 21493、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、綠膿桿菌ATCC 10145、單增李斯特菌CMCC 54002、阪崎腸桿菌IQCC 10403、副溶血性弧菌ATCC 10782、大腸桿菌CMCC 44102、大腸桿菌O157 ATCC 700728。

1.2 主要試劑、儀器

WORT肉湯、BIGGY瓊脂、BHI肉湯，青島海博生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)溶劑（乙腈50%+水47.5%+三氟乙酸2.5%），Sigma?Aldrich公司；質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)，布魯克公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；FastFire快速定量PCR試劑（探針法），天根生化科技（北京）有限公司。BioSpec?nano超微量分光光度計(jì)，日本島津公司；CFX96熒光PCR儀，美國伯樂公司；MALDI Biotyper微生物快速鑒定系統(tǒng)，德國布魯克公司。

1.3 分子方法

1.3.1 增菌培養(yǎng)

將白假絲酵母菌ATCC 10231、近平滑假絲酵母菌ATCC 22019、光滑假絲酵母菌ATCC 15126、熱帶假絲酵母菌ATCC 1369接種WORT肉湯，25℃需氧培養(yǎng)；其他菌株接種BHI肉湯37℃需氧培養(yǎng)。觀察各培養(yǎng)物渾濁即可。

1.3.2 DNA提取

取1.3.1肉湯培養(yǎng)物1 mL～2 mL，4℃下12 000 r/min、15 min離心收集，前處理用玻璃珠，再用硅質(zhì)膜吸附，即可得到高純度的基因組，具體操作按真菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行。提取的DNA片段用超微量分光光度計(jì)檢測濃度與純度后密閉存放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物、探針設(shè)計(jì)及優(yōu)化

從EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫中提取帶注釋的假絲酵母菌5.8SrDNA序列，利用Clustal Omega進(jìn)行多重比較、分析。篩選出保守區(qū)域設(shè)計(jì)假絲酵母菌的通用引物和探針。primer blast檢驗(yàn)引物特異性。正向引物5.8S?QF1：5′?AACGCAGC?GAAATGCGATAC?3′。反向引物5.8S?QR1：5′?GACATCACGCTCAAACAGGC?3′。探針5.8S?P1：FAM?5′CATTGCGCCTTGGGG?TATTC3′?TAMRA。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3.4 熒光PCR體系建立

反 應(yīng) 總 體 系25μL，2×Fastfire qPCR Pre?Mix 12.5μL，正、反 向 引 物（10μmol/L）各0.75μL，探針（10μmol/L）0.5μL，模板DNA（20 ng/μL～200 ng/μL）2μL，其 余 用RNase?Free dd H2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：98℃、1 min預(yù)變性，95℃、5 s變性，60℃、15 s退火/延伸，共40個循環(huán)。

取1.3.2提取的假絲酵母菌DNA，采用1.3.3設(shè)計(jì)的引物和探針，設(shè)定模板上樣量為0.5μL、1.0μL、2.0μL、3.0μL、4.0μL，對模板上樣量進(jìn)行優(yōu)化，選取最適模板上樣量；退火溫度一般在55℃～70℃之間，先根據(jù)設(shè)計(jì)引物的GC量估算引物溶解溫度（T m），估算后兩條引物的T m值差異不大，以最低T m低于5℃為PCR反應(yīng)退火溫度起始，以2℃為梯度，設(shè)定56℃、58℃、60℃、62℃、64℃進(jìn)行優(yōu)化，確定最適退火溫度。每次試驗(yàn)重復(fù)3個平行試驗(yàn)。

1.4 M ALDI?TOF MS鑒定

1.4.1 菌株分純

取1.3.1肉湯培養(yǎng)物劃線接種BIGGY瓊脂，25℃需氧培養(yǎng)48 h。

1.4.2 菌落蛋白提取

用無菌棉簽挑取約5 mg菌落放入裝有300μL去離子水的1.5 mL EP管中，混勻；再取900μL無水乙醇加入，振蕩混勻；12 000 r/min離心2 min，吸棄上清，室溫下放置2 min；再向管中加入50μL 70%甲酸水溶液，混勻；再加入50μL純乙腈混勻，12 000 r/min離心2 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移到新EP管中備用。

1.4.3 點(diǎn)靶

吸取1μL 1.4.2提取好的菌落蛋白，按試驗(yàn)布控順序滴加到MALDI靶板測試點(diǎn)位（每個靶板有96個測試點(diǎn)位）上，室溫下晾干；取出質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)，恢復(fù)室溫后加入250μL標(biāo)準(zhǔn)溶劑，渦旋振蕩器混勻至完全溶解，離心，每個點(diǎn)位加1μL基質(zhì)溶液，室溫下自然蒸發(fā)溶劑。

1.4.4 MALDI?TOF MS數(shù)據(jù)采集分析

采用MALDI Biotyper微生物快速鑒定系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，正線性模式，采集蛋白圖譜質(zhì)量范圍2 000 D～20 000 D，激光轟擊點(diǎn)數(shù)100，加速電壓20 k V，提取時(shí)間150 ns。每次試驗(yàn)前均用校準(zhǔn)肽蛋白（質(zhì)量范圍2 000 D～20 000 D）進(jìn)行質(zhì)量校正。

將1.4.3靶板放入儀器，開啟Flex Con?trol3.4軟件采集細(xì)菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)，自動分析得到蛋白峰信息。打開MALDI Biotyper3.1軟件，選擇數(shù)據(jù)庫，調(diào)入上述細(xì)菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分析樣品譜圖與庫中標(biāo)準(zhǔn)特征譜圖匹配程度。

1.5 特異性驗(yàn)證

1.5.1 熒光PCR特異性驗(yàn)證

取1.3.2提取的DNA，按照1.3.4優(yōu)化好的PCR體系及擴(kuò)增條件進(jìn)行特異性驗(yàn)證，每個模板重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.5.2 MALDI?TOF MS特異性驗(yàn)證

取1.4.1分純好的菌落，按照1.4.2提取蛋白后，進(jìn)行MALDI?TOF MS鑒定，每個試驗(yàn)重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.6 靈敏度驗(yàn)證

取1.3.1增菌后的假絲酵母菌菌液各1 mL制成混合菌液，取混合菌液1 mL稀釋至108級，各取106級、107級、108級稀釋度1 mL菌液涂布接種BIGGY瓊脂平板，25℃需氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每個稀釋度的細(xì)菌濃度。取104級、105級、106級、107級、108級稀釋度菌液提取基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證熒光PCR方法靈敏度，每個稀釋度重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.7 重復(fù)性驗(yàn)證

1.7.1 樣品制作

收集130份不同來源、不同材質(zhì)的紡織品樣品（醫(yī)院護(hù)士服、病房床上用品各10份，酒店浴巾、床上用品各10份，火車臥鋪床上用品10份，飛機(jī)公用毛毯5份，照相館衣服、毛絨玩具各10份，捐贈衣物25份，試驗(yàn)用防護(hù)服、隔離衣、一次性口罩各10份），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4656.1—2016《進(jìn)出口紡織品生物安全檢驗(yàn)方法第1部分：白假絲酵母菌》檢測白假絲酵母菌，21份樣品檢測出白假絲酵母菌。109份白假絲酵母菌陰性的樣品，按SN/T 4656.1—2016 6.1制樣，取1.6中105級稀釋度假絲酵母菌菌液，分別加入制作好的樣品中，每個樣品1 mL，混勻隔夜放置。

1.7.2 樣品驗(yàn)證

對109份人工污染樣品按上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和MALDI?TOF MS鑒定，同時(shí)用SN/T 4656.1—2016第7節(jié)平行檢測。

對21份自然污染樣品按上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和MALDI?TOF MS鑒定。

2 結(jié)果分析

2.1 DNA純度結(jié)果

提取的DNA最后會殘留有蛋白質(zhì)、鹽和小分子物質(zhì)，DNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在260 nm處吸收峰最大，蛋白質(zhì)在280 nm吸收峰最大，鹽和小分子在230 nm吸收峰最大。因此，本試驗(yàn)用紫外分光光度計(jì)同時(shí)檢測DNA的OD260、OD280和OD230值，利用其比值來衡量DNA的純度，見圖1。OD260/OD280為1.87，適中；OD260/OD230為1.29，偏低，可能是洗脫時(shí)用去離子水代替了洗脫緩沖液造成比值偏低，但并不表明DNA純度不高。

圖1 DNA濃度和純度結(jié)果

2.2 熒光PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 模板上樣量優(yōu)化

模板上樣量優(yōu)化結(jié)果見圖2。從圖2不同上樣量的擴(kuò)增結(jié)果中可以看出，當(dāng)上樣量在0.5μL～2.0μL時(shí)，特異性和敏感性幾乎不受影響，擴(kuò)增效率保持穩(wěn)定，S型擴(kuò)增曲線比較明顯，但當(dāng)模板量較高時(shí)，敏感性和擴(kuò)增效率相應(yīng)降低。因此，最佳上樣量應(yīng)選擇為0.5μL～2.0μL。

圖2 模板上樣量優(yōu)化結(jié)果

2.2.2 退火溫度優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化結(jié)果見圖3。退火溫度較低（56℃）時(shí)，理論上能夠保證引物和目的序列有效退火，但同樣會產(chǎn)生非特異性結(jié)合影響擴(kuò)增效率；退火溫度過高（64℃）同樣影響引物和模板間的結(jié)合效率。因此在Tm值合適范圍內(nèi)，退火溫度選擇PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率最高的溫度點(diǎn)（60℃）。

圖3 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

2.3 特異性結(jié)果分析

2.3.1 熒光PCR特異性驗(yàn)證

熒光PCR特異性驗(yàn)證結(jié)果見圖4。只有假絲酵母菌出現(xiàn)S形典型陽性擴(kuò)增曲線，其他非假絲酵母菌未收集到熒光信號，說明該試驗(yàn)引物特異性高，符合試驗(yàn)要求。

圖4 熒光PCR特異性驗(yàn)證結(jié)果

2.3.2 MALDI?TOF MS特異性驗(yàn)證

取BIGGY瓊脂平板上具有假絲酵母菌特征菌落進(jìn)行MALDI?TOF MS特異性驗(yàn)證。典型及可疑假絲酵母菌用MALDI?TOF MS鑒定，分析出不同質(zhì)譜譜峰，成功得出白假絲酵母菌特征譜圖，見圖5。

圖5 假絲酵母菌質(zhì)譜鑒定圖譜

2.4 靈敏度結(jié)果分析

混合菌液各濃度接種BIGGY瓊脂平板培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，107級平板計(jì)數(shù)結(jié)果為40 CFU，依次推斷104級、105級、106級、107級、108級濃度計(jì)數(shù)結(jié)果理論值分別為4×104CFU/mL、4×103CFU/mL、400 CFU/mL、40 CFU/mL、4 CFU/mL，熒 光PCR擴(kuò)增后結(jié)果見圖6。當(dāng)菌液濃度理論值為4 CFU/mL時(shí)，熒光信號很弱，擴(kuò)增曲線不明顯，因此本試驗(yàn)靈敏度約為40 CFU/mL。

圖6 熒光PCR靈敏度結(jié)果

2.5 重復(fù)性結(jié)果分析

2.5.1 人工污染樣品結(jié)果

109份不同來源、不同材質(zhì)的紡織品樣品，人工污染后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和MALDI?TOF MS鑒定，同時(shí)用SN/T 4656.1—2016第7節(jié)平行檢測，結(jié)果熒光PCR擴(kuò)增全部陽性，見圖7，質(zhì)譜鑒定也全部陽性，結(jié)果和SN/T 4656.1—2016第7節(jié)檢測100%相符。

圖7 人工污染樣品熒光PCR結(jié)果

2.5.2 自然污染樣品結(jié)果

對21份檢測白假絲酵母菌為陽性的自然污染樣品增菌后提取DNA，熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果全部陽性，見圖8，分離后MALDI?TOF MS鑒定結(jié)果均為陽性，與SN/T 4656.1—2016第7節(jié)檢測完全一致。而SN/T 4656.1—2016測出陽性需要9天～10天，本方法3天即可出結(jié)果，檢測效率提高了3倍。

圖8 自然污染樣品熒光PCR結(jié)果

3 討論分析

本研究針對紡織品中白假絲酵母菌，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合MALDI?TOF MS技術(shù)，構(gòu)建出初篩模型并指引了最終鑒定方法。白假絲酵母菌是一種雙相態(tài)菌，受不同生存環(huán)境影響，酵母相和菌絲相可以互相轉(zhuǎn)變，隨著形態(tài)的轉(zhuǎn)變，其毒力基因很容易發(fā)生突變或基因交流［13］，因此，以毒力基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物，特異性和靈敏度很難得到理想效果。目前，常用的假絲酵母菌分類基 因 有5.8SrDNA、beta?tubulin、28SrRNA、5SrRNA、18SrRNA等［14］。而5.8SrDNA在假絲酵母菌種內(nèi)不同菌株之間高度保守［15］，更適合假絲酵母菌種屬鑒定。本研究從GeneBank數(shù)據(jù)庫中提取假絲酵母菌5.8SrDNA基因序列，利用Clustal Omega軟件設(shè)計(jì)出針對紡織品假絲酵母菌的實(shí)時(shí)熒光PCR通用引物，經(jīng)驗(yàn)證4種常見假絲酵母菌均能特異性擴(kuò)增，而其他幾種非假絲酵母菌屬均未見特異擴(kuò)增，適合假絲酵母菌初篩鑒定。初篩后采用MALDI?TOF MS技術(shù)鑒定，結(jié)果和傳統(tǒng)方法完全一致，而檢測效率提高了3倍。MALDI?TOF MS技術(shù)是一種基于強(qiáng)大數(shù)據(jù)庫的軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，廣泛用于病原菌分型鑒定，具有高自動化、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)。另外本研究選用了針對假絲酵母菌選擇性較強(qiáng)的WORT肉湯增菌、BIGGY瓊脂分離純化菌落，對以上結(jié)果有一定的貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合MALDI?TOF MS技術(shù)，創(chuàng)新建立了一種快速、高效鑒定紡織品中白假絲酵母的方法，經(jīng)驗(yàn)證靈敏度可達(dá)40 CFU/mL，通過對人工污染樣品和自然污染樣品檢測，結(jié)果和傳統(tǒng)方法100%符合。該方法將兩種成熟應(yīng)用的技術(shù)相結(jié)合，可操作性強(qiáng)，便于推廣應(yīng)用，為快速、準(zhǔn)確鑒定白假絲酵母菌打開了新思路。

雖然PCR技術(shù)和MALDI?TOF MS技術(shù)在各領(lǐng)域應(yīng)用相對成熟，但兩者標(biāo)準(zhǔn)化程度并未同步，而且相差甚遠(yuǎn)，PCR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化程度相對較高，MALDI?TOF MS技術(shù)目前只能搜索到標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33682—2017《基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》。MALDI?TOF MS技術(shù)依賴其強(qiáng)大的已知菌株譜圖庫，而其大部分?jǐn)?shù)據(jù)庫沒有我國自主知識產(chǎn)權(quán)，這也是該技術(shù)難以完全標(biāo)準(zhǔn)化的主要原因，而白假絲酵母菌基因易變異、重組，未知太多，鑒定準(zhǔn)確率必須要有大數(shù)據(jù)支撐，后續(xù)可深入研究，通過自建假絲酵母菌譜圖庫補(bǔ)充、完善現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫。相信隨著對MALDI?TOF MS技術(shù)深入研究，越來越多的相關(guān)成果會實(shí)現(xiàn)資源共享、數(shù)據(jù)共享，實(shí)現(xiàn)MALDI?TOF MS技術(shù)完全標(biāo)準(zhǔn)化。