宋亞華，安苗，秦赟，焦美艷，趙平,李銳

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是炎癥性腸病主要類型之一，臨床表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便、腹痛，其病理發(fā)展主要為腸道遷延性慢性炎癥反應(yīng)，容易反復(fù)發(fā)作[1]。影響UC發(fā)病及進(jìn)展的因素較多，包括年齡、性別、遺傳及飲食結(jié)構(gòu)等[2]。全球UC的發(fā)病率在逐年升高，每年在UC診治方面的費(fèi)用也越來越多，給社會及家庭造成巨大負(fù)擔(dān)。腸道菌群在UC發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用，腸道菌群失調(diào)嚴(yán)重影響UC的疾病進(jìn)展和治療[1]。白介素家族成員在UC發(fā)病中也曾有諸多研究，但以往的研究主要針對單一白介素家族成員進(jìn)行探討，缺乏對白介素家族成員與UC發(fā)病關(guān)系的系統(tǒng)性研究[3]。本研究通過檢測不同嚴(yán)重程度UC患者血清中白介素家族成員水平與糞便中腸道菌群的構(gòu)成和豐度，深入探討和分析白介素家族成員對UC及腸道菌群的影響。

1 資料與方法

1.1 患者資料

收集2019年1月至2020年6月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科住院初治的98例UC患者，其中男性47例，女性51例，平均年齡(47.5±9.7)歲。由2名具有豐富經(jīng)驗的內(nèi)鏡醫(yī)生參考《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018 年，北京)》[4]中的改良Mayo評分，共同對UC患者的內(nèi)鏡下嚴(yán)重程度進(jìn)行Mayo腸鏡評分，其中0分和1分為輕度，2分為中度，3分為重度；UC組中輕度49例，中度31例，重度18例。收集同期內(nèi)鏡室檢查無炎癥性腸病患者60例，其中男性28例，女性32例，平均年齡(46.9±9.4)歲。所有入組人員均在自愿原則下簽訂醫(yī)學(xué)臨床試驗知情同意書。UC組納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)內(nèi)鏡檢查；②年齡18～ 85歲；③參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年，北京)》，經(jīng)臨床、影像、內(nèi)鏡、實(shí)驗室檢查及病理組織學(xué)檢查等診斷手段，確診為UC。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重消化道并發(fā)癥；②有腸道腫瘤者；③合并有神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)等嚴(yán)重的原發(fā)性疾病者；④有自身免疫性疾病者；⑤哺乳或妊娠期婦女。本研究符合《赫爾辛基宣言》中所制定的醫(yī)學(xué)研究的道德倫理原則并獲得本醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 白介素家族成員檢測 清晨空腹時在同一時間段，分別取兩組受試者5 mL靜脈血，離心機(jī)離心處理后，留置上清液，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[5]測定血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A、IL-17C、IL-21、IL-22、IL-23、 IL-27及IL-35 水平。

1.2.2 腸道菌群的檢測 兩組受試人員均提取5.0 g新鮮糞便標(biāo)本置于無菌試管中，在1 h內(nèi)密封后送至實(shí)驗室，放置在-80 ℃冰箱中備查。提取樣本總DNA(按照寶生物糞便DNA提取方法提取)，用5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的基因組完整性。之后所有樣本的16SrDNA的V3區(qū)送至上海銳賽生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序[6]。測序文庫構(gòu)建及高通量測序由上海銳賽生物科技有限公司進(jìn)行。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，對統(tǒng)計過的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類處理(每一個聚類稱為一個物種操作單元OUT)，和分類學(xué)處理，最終得出物種類別信息，并進(jìn)行統(tǒng)計對比。基于OUT分析結(jié)果，得到各樣本物種豐度和均勻度信息等；基于分類學(xué)等信息，在“門”分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 UC嚴(yán)重程度對血清中白介素家族因子的水平的影響

與對照組相比，UC組患者血清中IL-1β、IL-8、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27及IL-6均明顯升高，且隨著UC嚴(yán)重程度的升高，因子的水平越高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，UC組患者血清中IL-12、IL-35明顯降低，且隨著UC嚴(yán)重程度的升高，因子的水平越低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，UC組患者血清中IL-17C明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但未見不同嚴(yán)重程度UC患者血清中的IL-17C水平存在差異(P>0.05)。見表1。

表1 UC嚴(yán)重程度對血清中白介素家族因子的水平的影響

2.2 UC嚴(yán)重程度對腸道菌群的影響

與對照組相比，在門水平上，UC組與對照組中均含有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、放線菌門及廣古菌門等 6 個菌門。與對照組相比，UC組腸道微生物菌群中還存在軟壁菌門、互養(yǎng)菌門，但擬桿菌門、厚壁菌門仍為主要菌種。與對照組相比，UC組中擬桿菌門和放線菌門豐度明顯下降(P<0.05)，且隨著疾病程度的升高，下降的程度越大，但重度組與中度組相比有下降的趨勢，并無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比，厚壁菌門和變形菌門豐度明顯上升(P<0.05)，且隨著疾病程度的升高，上升的程度越大，但重度組厚壁菌門與中度組相比有上升的趨勢，并無顯著性差異(P>0.05)，輕度組變形菌門與對照組相比有上升的趨勢，并無顯著性差異(P>0.05)。UC輕度組梭桿菌門比例明顯高于對照組(P<0.05)，但中度組和中度組未見明顯升高。見表2。

3 討論

UC是一種非特異性炎癥，具體發(fā)生機(jī)制不甚清楚，大腸是該病的好發(fā)部位，尤以直腸和乙狀結(jié)腸為多，病變區(qū)域呈連續(xù)性彌漫性，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及黏液膿血便[7]。UC癥狀不僅局限于結(jié)腸，炎癥反應(yīng)還會表現(xiàn)在結(jié)腸外部分，主要見于關(guān)節(jié)、眼和皮膚[8]。全球范圍內(nèi)，每百萬人中發(fā)病人數(shù)在5～250人之間，國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)程度與UC的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，調(diào)查顯示，發(fā)展中國家UC的發(fā)病率明顯低于發(fā)達(dá)國家，北美和西歐發(fā)病率高[9]。近年來，UC發(fā)病率在中歐和東歐中呈現(xiàn)升高趨勢。

表2 UC嚴(yán)重程度對腸道菌群的影響(%)

UC發(fā)病過程中，存在多種細(xì)胞因子的共同作用。根據(jù)所分泌細(xì)胞因子和介導(dǎo)免疫功能的不同，CD4+T細(xì)胞可分為I型輔助性T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)和Th2細(xì)胞，干擾素(IFN)-γ、IL-12等主要由Thl細(xì)胞分泌，IL-4、IL-10、IL-13等主要由Th2細(xì)胞分泌[10]。Thl/Th2細(xì)胞亞群失衡一直被認(rèn)為是炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制之一，而根據(jù)參與UC炎癥反應(yīng)過程的因子，UC屬于Th2型疾病。UC病理生理過程中存在促炎細(xì)胞因子主要有IL-1β、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)等，抗炎細(xì)胞因子主要有IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等。研究白細(xì)胞介素家族成員有助于探討UC的發(fā)病機(jī)制以及白細(xì)胞介素在UC診斷和治療中的作用。

Andus等[11]與Herbert等[12]的研究均證實(shí)IL-1β在UC患者中顯著升高，同時針對IL-1β的實(shí)驗性動物治療方面也顯示出較好的抗UC作用。在我們的研究中，IL-1β在患者血清中亦表現(xiàn)出高水平。同時，血清中IL-6、IL-8也顯示高水平，提示促炎細(xì)胞因子白介素家族成員對UC發(fā)生發(fā)展起到了重要作用[13]。IL-17A是IL-17分子家族中最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，并與隨后發(fā)現(xiàn)的IL-17B、IL-17C、IL-17D等共同組成IL-17分子家族[14-15]。IL-17A能夠刺激成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8等促炎因子。以往研究認(rèn)為，IL-17A在UC發(fā)病過程中具有雙相作用，即促炎作用與抗炎作用并存，但在UC小鼠模型的研究中，中和IL-17A，小鼠的UC程度降低，在IL-17A基因缺陷小鼠中，炎癥反應(yīng)降低[15]。在本研究中，血清IL-17A水平與UC嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與以往結(jié)果一致，且說明其對UC疾病發(fā)展過程具有較好指示作用。近年來，IL-21呈四螺旋束形態(tài)，該細(xì)胞因子來自于活化的CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)和NKT細(xì)胞，與IL-2、IL-4和IL-15具有高度同源性[16]。IL-22是IL-10細(xì)胞因子家族成員，多種慢性炎癥過程與自身免疫性疾病與其相關(guān)[17]。IL-23產(chǎn)生于造血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，IL-23促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖、穩(wěn)定，促進(jìn)后者轉(zhuǎn)化為完全的炎癥細(xì)胞[18-20]。在關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、骨腫瘤及多發(fā)性硬化患者血清中IL-21、IL-27均表現(xiàn)明顯升高，且我們的研究顯示，IL-21、IL-27與UC嚴(yán)重程度具有較好相關(guān)性。同時研究還顯示IL-6在輕中度UC中升高幅度較低，重度UC患者IL-6升高明顯[21]。IL-17C 刺激上皮組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，通過自分泌方式在上皮細(xì)胞固有免疫過程中發(fā)揮作用。文獻(xiàn)顯示，IL-17C 在維持黏膜屏障完整性方面起著至關(guān)重要的作用，但目前對IL-17C的研究尚停留在動物實(shí)驗水平。本研究顯示IL-17C在UC患者血清中是升高的，但針對UC發(fā)病過程及嚴(yán)重程度，并無明顯相關(guān)性。IL-12是Cys-X-Cys趨化因子，屬于內(nèi)源性誘導(dǎo)因子，同IL-17一樣，參與慢性炎癥發(fā)展過程，具有促炎作用[22]。IL-35是IL-12家族的成員因子[23]。我們的研究顯示，IL-12與IL-35在UC患者血清中并不升高，與UC嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。

腸道菌群在小腸中寄居，對未完全消化的食物進(jìn)行分解，將營養(yǎng)物質(zhì)和能量提供給被寄居者。腸道寄居菌群發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸降低了腸內(nèi)pH 值和氧化還原電勢，均衡各菌群生長速度，抑制致病菌菌落生長[24]。腸道菌群失調(diào)在炎癥性腸病發(fā)病過程中具有重要作用，且其參與如冠心病、糖尿病的發(fā)病過程[25]。臨床診療過程中，我們發(fā)現(xiàn)腸道菌群定值菌量最大的部位就是UC發(fā)病部位。同時，動物實(shí)驗也顯示UC動物飼養(yǎng)于無菌環(huán)境或給予抗生素注射，將促進(jìn)UC癥狀緩解。在我們的研究中，門水平上，UC患者的腸道菌群出現(xiàn)了明顯變化，但擬桿菌門、厚壁菌門占據(jù)優(yōu)勢，在UC中、重度組患者中，擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門豐度明顯下降，厚壁菌門、變形菌門豐度顯著升高，說明隨著UC發(fā)病狀態(tài)加重，造成UC組的腸道菌群豐度發(fā)生明顯變化。

綜上所述，白細(xì)胞介素家族成員對UC病情嚴(yán)重程度具有較好的診療指示作用，調(diào)理腸道菌群或在UC預(yù)防和治療中獲益。