房寬 徐茜 劉建陽 林卿 宋江雨 林勇 黃仕亮 王秀國 林偉 劉通

摘?要：為指導煙稻輪作區(qū)稻田用除草劑2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的合理使用，通過室內盆栽與大田試驗，研究了兩種除草劑在土壤和煙株中的殘留和消解動態(tài)，以及煙株藥害癥狀和內源激素含量變化。結果表明：（1）兩種除草劑殘留均可導致煙株矮化，莖稈扭曲，煙葉卷曲黃化;（2）兩種除草劑殘留導致不同部位煙葉IAA和GA3含量顯著降低，ABA含量顯著升高（p<0.05）;（3）隨施用劑量和處理時間增加，兩種除草劑殘留對煙株農藝性狀的抑制作用增強，以株高或葉面積抑制率為10%～15%為標準，2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的致害閾值在土壤中分別為1.022和0.053 mg/kg，在葉片中分別為0.047 8和0.027 6 mg/kg;（4）結合致害閾值得出2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的田間安全間隔期分別為53 d和160 d。

關鍵詞：2，4-滴丁酯;氯氟吡氧乙酸;煙草;殘留;藥害

Abstract： In order to guide the rational use of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in paddy fields in tobacco-rice rotation areas， the residues and digestion dynamics of the two herbicides in soil and tobacco， tobacco plant phytotoxicity symptoms and endogenous hormone content changes were studied by indoor pot experiment and field experiment. The results showed that： （1） The residues of two herbicides could lead to dwarfing of tobacco plants， serious contortion of stems， curling and yellowing of tobacco leaves. （2） The residues of two herbicides significantly decreased the contents of IAA and GA3， and significantly increased the content of ABA in tobacco （p<0.05）. （3） With the increase of application dose and treatment time， the inhibition effect on agronomic traits of tobacco plants was enhanced. Taking the inhibition rate of 10%-15% for plant height or leaf area as the standard， the critical thresholds of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in soil were 1.022 mg/kg and 0.053 mg/kg， respectively， and the critical thresholds in leaves were 0.047 8 mg/kg and 0.027 6 mg/kg， respectively. （4） Combined with the critical threshold， the safety intervals of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in the field were estimated to be 53 days and 160 days， respectively.

Keywords： 2，4-D butyl ester; fluroxypyr; tobacco; residue; phytotoxicity

2，4-滴丁酯（2，4-D butyl ester）和氯氟吡氧乙酸（Fluroxypyr）作為兩種典型的激素類除草劑，具有內吸性強、傳導快且廣譜的特點，除草效果好且應用面積廣闊[1]。然而，由于不科學使用，藥害問題在全國大面積發(fā)生，藥害涉及到果樹、蔬菜等多種作物，嚴重影響其產質量[2-4]。

稻煙輪作是我國南方煙區(qū)主要的煙草栽培方式，稻田常用激素類除草劑殘留過量導致后茬煙草出現(xiàn)藥害的現(xiàn)象常有發(fā)生。林建麒等[5]研究表明，二氯喹啉酸在稻田殘留過量會導致后茬煙株出現(xiàn)生長遲緩，煙葉狹窄、下卷等癥狀;張國賓等[6]報道二甲四氯鈉殘留會嚴重抑制煙株株高、葉寬和葉長;楊森等[7]報道，麥草畏殘留會導致煙株矮小，新葉皺縮畸形。王鋼等[8]通過室內盆栽研究表明，2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸殘留可導致煙葉畸形，煙株發(fā)育受阻。然而，由于氣候等因素影響，室內盆栽試驗產生的藥害癥狀可能與田間不同，不利于藥害癥狀的精準識別[9]。此外，藥害的產生是由于除草劑在煙草體內殘留導致，因此，結合藥害癥狀，檢測藥害時發(fā)生的環(huán)境介質和煙草體內除草劑含量，對指導除草劑合理使用具有重要意義。

鑒于此，本研究以室內盆栽試驗與大田試驗相結合，研究了不同施藥劑量下2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸對煙草造成的藥害癥狀，檢測藥害發(fā)生時煙葉中激素含量和農藝性狀的變化，并結合除草劑在煙草體內的殘留量和在大田中的消解特征，計算致害閾值與安全施藥間隔期，為規(guī)避除草劑藥害發(fā)生，提高煙草生產質量提供指導。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

試驗供試煙草品種為K326;57% 2，4-滴丁酯乳油和200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油分別由山東僑昌現(xiàn)代農業(yè)有限公司和江蘇輝豐農化股份有限公司提供;2，4-滴丁酯標準品（98.7%）和氯氟吡氧乙酸標準品（99%）由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供。

1.2?試驗方法

1.2.1?田間煙株藥害癥狀及激素含量變化研究?（1）試驗設計：57% 2，4-滴丁酯乳油和200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油的推薦施用劑量分別為850和200 a.i. g/hm2，根據預試驗結果，在煙草團棵期設計1/8、1和5倍推薦劑量3個施藥濃度;在煙草旺長期設計1/4、2和10倍推薦劑量3個施藥濃度。施藥方法為：不同施藥劑量均兌水3000 mL稀釋，分別于團棵期和旺長期對煙株根部周圍土壤進行噴施，各濃度處理20株煙。

（2）調查與測定：對不同處理組的田間煙株定期拍照，記錄藥害癥狀。在施藥15 d后采集藥害癥狀較為明顯的煙株中上部和心葉部位煙葉，依據易勇等[9]的方法提取并測定生長素（IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）的含量。

1.2.2?2種農藥在煙田土壤中的殘留消解研究?（1）試驗設計：考慮到田間除草劑重復施藥現(xiàn)象，設推薦劑量的10倍為2種農藥田間消解試驗處理濃度，利用施藥器對土壤表面均勻噴施3次，每次施藥間隔10 d。（2）調查與測定：在第3次施藥后2 h，1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70和80 d取土壤樣品用于測定兩種農藥殘留量變化。（3）2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸殘留量測定：超高效液相色譜串聯(lián)質譜系統(tǒng)（UPLC-MS/MS）用來檢測為本研究中除草劑殘留，其中進樣量為5 L，流速為0.25 mL/min，液相色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18（2.1×100 mm，3.0 μm），柱溫為25 ℃。2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸定性離子分別為235.0/147.0（m/z）、253.05/195.10（m/z）;定量離子分別為235.0/217.0（m/z）、253.05/233.05（m/z）。使用QuEChERS方法提取殘留在土壤和煙葉中的2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸，提取劑為乙腈，凈化劑為C18和無水硫酸鎂，濃縮后經0.22 μm有機濾膜過濾，然后使用UPLC-MS/MS檢測分析。

1.2.3?煙株藥害及農藥殘留消解的盆栽研究?（1）試驗設計：據預試驗結果，分別設計57% 2，4-滴丁酯乳油推薦施用劑量的0（CK）、1/8、1/4、1/2、2、5和10倍，200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油推薦施用劑量的0（CK）、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2和1倍為施藥濃度梯度。施藥方法為：根據所需濃度將藥劑兌500 mL水進行稀釋，均勻噴施至10 kg土壤中，并將土壤含水量調整至土壤最大持水量的60%，藥劑處理后的土壤充分拌勻后裝入直徑32 cm、高25.5 cm的花盆中，每個濃度處理的土壤裝5個花盆。另設清水處理作為對照。

（2）調查與測定：分別于移栽后30、40、50和60 d測量煙株株高、葉面積等農藝性狀。分別于藥劑處理后2 h，1、3、5、10、15、20、30、40、50和60 d采集各處理組鮮煙葉和土壤樣品用于測定2種農藥殘留量變化，測定方法同1.2.2。

1.3?致害閾值及安全間隔期確定

1.3.1?致害閾值計算?首先根據農藝性狀結果計算葉面積抑制率和株高抑制率，具體公式參照文獻[10];再根據抑制率結果，使用方程X=PX0（Y-A2）/（A1-Y）計算2種除草劑對煙株株高和葉面積的半數抑制濃度，其中，A1表示最大反應值，即曲線上漸近線估計值;A2表示本底反應值，即曲線下漸近線估計值;P表示曲線的斜率;Y表示抑制率（%）;X0表示抑制濃度（a.i. g/hm2）;X表示半數抑制濃度（a.i. g/hm2）。

致害閾值取值：葉面積抑制率、株高抑制率為10%～15%時的施藥濃度，株高抑制率作為主要參考依據[11-12]。

1.3.2?安全間隔期確定?首先，2種除草劑降解動態(tài)采用一級動力學方程Ct=C0e-kt擬合，降解半衰期T1/2=ln2/k，其中，Ct和C0分別為時間為t時土壤中的農藥含量（mg/kg）和農藥的初始含量（mg/kg），k和T1/2分別為反應速率常數（d-1）和降解半衰期（d）。

然后，根據2種除草劑在盆栽煙株致害時間以及藥害程度，并結合其在盆栽土壤中的消解狀況，計算出致害臨界劑量，代入田間消解試驗動態(tài)方程，確定田間施藥安全間隔期。

1.4?數據分析

本研究所得數據使用Origin 2019、SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010分析處理。不同處理激素濃度采用最小顯著差異方法進行多重比較。

2?結?果

2.1?田間試驗2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的殘留消解及對煙株生長的影響

2.1.1?對煙株的藥害癥狀?根據試驗結果可知，煙草在團棵期經2，4-滴丁酯處理后，高劑量處理組（1倍和5倍劑量）出現(xiàn)明顯藥害癥狀，尤其是5倍劑量處理組出現(xiàn)煙株枯萎死亡現(xiàn)象（圖1Ⅰ），而低劑量處理組（1/8倍劑量）藥害癥狀輕微（圖1Ⅱ）。藥害癥狀主要表現(xiàn)為：煙葉出現(xiàn)卷曲、黃化現(xiàn)象并且部分煙葉邊緣呈鋸齒狀，頂部葉片厚度、顏色深度增加，煙株莖葉連接處受損，莖稈出現(xiàn)扭曲且底部產生腐爛壞死現(xiàn)象。煙草在旺長期經2，4-滴丁酯處理后，10倍劑量處理組首先表現(xiàn)出明顯的藥害癥狀，而1/4倍和2倍劑量處理組藥害癥狀不明顯，尤其是1/4倍劑量處理組無藥害癥狀出現(xiàn)。藥害癥狀主要表現(xiàn)為：與初期癥狀相似，煙葉變得細小狹長、出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象且部分煙葉邊緣呈鋸齒狀，頂部葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象并且厚度增加，煙株莖葉連接處受損，莖稈扭曲嚴重，腐爛壞死現(xiàn)象在底部產生（圖1 Ⅲ、Ⅳ）。

煙草在團棵期經氯氟吡氧乙酸處理后，1/8倍劑量處理組無藥害產生，1倍和5倍劑量處理組藥害癥狀嚴重。藥害癥狀主要表現(xiàn)為：葉片發(fā)黃并向后翻卷，頂部葉片顏色加深，心葉及葉片扭曲，葉脈有灼燒型藥斑，莖稈有灼燒跡象，煙株整體發(fā)黃、矮小嚴重、停止生長（圖1 V、VI）。煙草在旺長期經氯氟吡氧乙酸處理后，高劑量處理組（2倍和10倍劑量）首先表現(xiàn)出明顯藥害癥狀，而1/4倍劑量處理組藥害癥狀輕微。藥害癥狀主要表現(xiàn)為：心葉及葉片嚴重扭曲、發(fā)黃并向后翻卷，頂部煙葉停止生長且葉片顏色均比對照組深，煙株莖稈扭曲嚴重同時無法繼續(xù)生長，與初期癥狀相似（圖1 Ⅶ、Ⅷ）。

2.1.2?對煙株激素含量的影響?如圖2所示，經2，4-滴丁酯處理后，在心葉和葉片中，ABA含量比對照組分別顯著升高了1.27倍和1.60倍（p<0.05），GA3含量比對照組分別顯著降低了1.36倍和1.58倍（p<0.05），IAA含量比對照組分別顯著降低了2.39倍和3.87倍（p<0.05）。

經氯氟吡氧乙酸處理后，在心葉和葉片中，ABA含量比對照組分別顯著升高了1.26倍和1.52倍（p<0.05），GA3含量比對照組分別顯著降低了1.92倍和2.33倍（p<0.05），IAA含量比對照組分別顯著降低了2.65倍和3.28倍（p<0.05）。

兩種農藥對煙株體內內源激素的影響情況相似。然而，心葉和葉片中，氯氟吡氧乙酸對于煙株內GA3的影響程度均高于2，4-滴丁酯，說明氯氟吡氧乙酸對煙株的細胞伸長和分裂等功能影響更為顯著。

2.1.3?2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸在煙田土壤中的殘留及消解?據圖3所示，2，4-滴丁酯10倍推薦劑量在田間土壤中的初始殘留量為8.624 mg/kg，其降解率在施藥處理10 d后超過50%，施藥處理80 d后，最終殘留量為0.372 mg/kg。理論半衰期為18.2 d。氯氟吡氧乙酸10倍推薦劑量在田間土壤中的原始沉積量為3.219 mg/kg，其降解率在施藥處理20 d后超過50%，在施藥處理80 d后，最終殘留量為0.391 mg/kg。理論半衰期為27.7 d。

2.2?盆栽試驗中2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的殘留消解及對煙株農藝性狀的影響

2.2.1?2種農藥殘留對煙株農藝性狀的影響?如表1所示，2，4-滴丁酯不同處理組處理第30、40、50和60天后對株高的半數抑制濃度（EC50）分別為12 074、13 685、9788和11 935 a.i. g/hm2，對葉面積的EC50分別為6763、8577、53 368和287 959 a.i. g/hm2。且藥劑處理60 d后，10倍劑量處理組對株高和葉面積的抑制率分別超過30%和20%，說明該農藥對煙株株高的抑制作用高于對葉面積的抑制作用。

如表2，隨著施藥劑量和處理時間的增加，氯氟吡氧乙酸不同處理組對煙株的抑制作用越來越大。該農藥不同處理組處理30、40、50和60 d后對株高的EC50分別為942、148、61.6和80.7 a.i. g/hm2，對葉面積的EC50分別為65.7、71、53.3和35.8 a.i. g/hm2。在藥劑處理60 d后，1/2和1倍劑量處理組對葉面積和煙株高度的抑制率均在70%以上，其中對葉面積抑制率超過90%，說明該農藥對煙株葉面積的抑制作用高于對株高的抑制作用。

2.2.2?2種農藥在盆栽土壤中的殘留與消解?如圖4，在施藥處理15 d后，2，4-滴丁酯不同濃度處理組在盆栽土壤中的降解率均大于50%。各處理組的降解過程均符合一級動力學方程，其降解半衰期按施藥濃度由低到高依次為2.7、4.1、4.9、6.3、7.6和8.6 d;在藥劑處理30 d后，氯氟吡氧乙酸不同處理組在盆栽土壤中的降解率均大于50%。各處理組的降解過程均符合一級動力學方程，其降解半衰期按施藥濃度由低到高依次為2.2、5.0、11.5、12.0、23.0和18.0 d。

總體上，2種農藥在土壤中消解速率均較快，不易形成持久性殘留，同時氯氟吡氧乙酸在土壤中降解速率低于2，4-滴丁酯，推測這是氯氟吡氧乙酸對煙株產生藥害程度高于2，4-滴丁酯的原因之一。

2.2.3?2種農藥在盆栽煙葉中的殘留與消解?盆栽試驗中，不同濃度處理后，煙葉中2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸殘留量檢測結果如表3，其中前者1/8和1/4倍劑量處理組、后者1/32、1/16和1/8倍劑量處理組均未檢測到相應的除草劑殘留。兩種農藥其余劑量處理組在施藥處理30 d后，降解速度較慢，但整體隨時間推移呈降低趨勢，藥后60 d，施藥濃度越高，殘留量越大。

2.3?2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸對煙株的致害閾值及安全間隔期

根據2種除草劑在盆栽煙株致害時間以及藥害癥狀，并與其在盆栽土壤中的消解狀況相結合，計算出致害臨界劑量，并將臨界劑量代入田間消解試驗動態(tài)方程，就可對2種除草劑的大田安全間隔期進行評估。

盆栽試驗中，57% 2，4-滴丁酯乳油5倍推薦濃度施藥30 d后，對株高抑制率達到20.4%（大于10%～15%）[11-12]，同時，此濃度施藥30 d后，盆栽土壤和盆栽煙草葉片中2，4-滴丁酯殘留量分別為1.022、0.047 8 mg/kg。田間消解試驗中，該農藥在田間土壤中的消解動態(tài)方程為y=7.721 7e-0.038x，將產生藥害時土壤中該農藥含量（即y=1.022 mg/kg）代入，可得該農藥大田安全間隔期（x）為53 d。

同理，氯氟吡氧乙酸在盆栽土壤以及葉片中的致害閾值分別為0.053和0.027 6 mg/kg，大田安全間隔期為160 d。

3?討?論

稻田除草劑殘留導致后茬煙草產生藥害，已成為影響稻煙輪作區(qū)煙草發(fā)展的重要因素之一[13-14]。明確除草劑藥害癥狀可以為應對藥害提供有力依據。本研究表明，2，4-滴丁酯可使田間煙株葉片邊緣呈鋸齒狀，莖稈底部出現(xiàn)腐爛壞死;氯氟吡氧乙酸可使葉片發(fā)黃并向后翻卷，葉片褶皺。1/2倍推薦濃度2，4-滴丁酯和1/8倍推薦濃度氯氟吡氧乙酸在分別處理30 d和40 d后即可對盆栽煙株農藝性狀產生明顯的抑制效果，且兩種除草劑施藥劑量與藥害程度呈明顯的時間-劑量效應關系。與本研究結果一致，王鋼等[8]在研究玉米田中該二種農藥殘留對烤煙藥害癥狀時同樣出現(xiàn)了暴露時間越長、濃度越大，藥害程度越深的情況;楊森等[7]在研究激素類除草劑的麥草畏殘留對煙株藥害作用時同樣發(fā)現(xiàn)，麥草畏殘留可導致煙葉畸形，對煙株農藝性狀有顯著抑制作用。本研究表明兩種農藥在使用過程中藥害風險較高。

植物分泌的ABA、GA3、IAA等內源激素不僅對自身生長分化、結實落果等生命過程具有調節(jié)作用，其含量還會發(fā)生變化以適應環(huán)境變化[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在心葉和葉片中，兩種除草劑處理組中的IAA和GA3含量均比對照組顯著降低（p<0.05），說明兩種除草劑處理后，煙株的分裂分化、分蘗抽苔受到抑制，煙株衰老加速。袁祖麗等[17]也發(fā)現(xiàn)逆境脅迫影響下，煙株出現(xiàn)了IAA和GA3含量下降的結果，說明煙株通過延緩自身生長速度、節(jié)省能量來應對外界脅迫。值得注意的是，在心葉和葉片中，氯氟吡氧乙酸對于煙株內GA3的影響程度均高于2，4-滴丁酯，與氯氟吡氧乙酸處理組煙株農藝性狀受抑制程度高于2，4-滴丁酯處理組這一現(xiàn)象相吻合;ABA是植株衰老的正化學信號，在心葉和葉片中，兩種除草劑處理組中的ABA含量均比對照組顯著升高（p<0.05），因此，該結果說明兩種除草劑導致植株衰老加速、細胞程序性死亡來應對藥害脅迫，這與藥害癥狀觀察結果相符，與本研究相似，李祖紅等[18]、陳建國等[19]發(fā)現(xiàn)煙株受到逆境脅迫時，ABA含量會顯著上升，這會誘導或增強抗性基因的轉錄活性，增強對植株的保護作用。

兩種農藥在盆栽土壤中消解速率均較快，不易形成持久性殘留;同時，2，4-滴丁酯在盆栽土壤以及葉片中的致害濃度分別為1.022和0.047 8 mg/kg，大田安全間隔期為53 d;氯氟吡氧乙酸在盆栽土壤以及葉片中的致害濃度分別為0.053和0.027 6 mg/kg，大田安全間隔期為160 d。兩種農藥所引起的藥害一般在煙株生長后期出現(xiàn)，而一旦出現(xiàn)藥害癥狀，雖有補救措施，但還是會對煙草質量和產量造成影響。因此，明確除草劑致害濃度，在煙田規(guī)劃期對土壤中除草劑殘留量進行篩查，能夠有效預防除草劑殘留產生藥害[15]。

4?結?論

研究探明了目標除草劑施藥濃度與藥害程度的關系，揭示了藥害發(fā)生部位內源激素IAA、GA3和ABA含量的變化，并且探究了兩種除草劑的降解規(guī)律，結合降解規(guī)律和煙株農藝性狀變化確定了2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸在土壤中的致害閾值分別為1.022和0.053 mg/kg，超過此閾值則不得種植煙草，且施藥間隔應分別不少于53和160 d。

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