張玉秀 劉楊 劉培衛(wèi) 符傳坤 盧麗蘭 魏建和

摘 要：為尋找適用于中藥材莪術(shù)基原植物鑒定的DNA條形碼序列，探索快速高效的莪術(shù)基原植物鑒定的新方法，該文首先利用擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率對(duì)中藥材莪術(shù)三種基原植物，9個(gè)樣本的7種DNA條形碼序列（ITS、ITS2、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、rpoB 和atpB-rbcL）進(jìn)行評(píng)估，然后利用MEGA6.0軟件對(duì)獲得的高質(zhì)量的序列通過(guò)變異位點(diǎn)分析、遺傳距離計(jì)算和系統(tǒng)樹(shù)分析等進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)估，最后將篩選到的DNA條形碼序列對(duì)未知基原的待測(cè)樣品進(jìn)行基原鑒定。結(jié)果表明：（1）ITS、ITS2和matK等條形碼序列在莪術(shù)基原植物中的擴(kuò)增或測(cè)序成功率較低，難以應(yīng)用于實(shí)際鑒定;而psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB條形碼序列變異位點(diǎn)信息過(guò)少，不足于區(qū)分莪術(shù)的三種不同基原植物;只有atpB-rbcL條形碼序列的擴(kuò)增和測(cè)序成功率較高，容易獲得高質(zhì)量的序列，同時(shí)序列長(zhǎng)度（642～645 bp）理想，變異位點(diǎn)多（11個(gè)），可實(shí)現(xiàn)莪術(shù)的三種不同基原的區(qū)分鑒別。（2）待測(cè)樣品經(jīng)基于atpB-rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒別為溫郁金。綜上所述，葉綠體atpB-rbcL序列能夠準(zhǔn)確鑒定莪術(shù)不同基原植物，可以作為中藥材莪術(shù)基原植物鑒定的條形碼序列。

關(guān)鍵詞：莪術(shù)，DNA條形碼，篩選，atpB-rbcL，基原植物鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2021）08-1263-07

Abstract： In order to find a rapid and efficient identification method for three original species of Curcumae Rhizoma， identification efficiency of different DNA barcoding sequences were evaluated in present study. Totally nine samples of three different species of Curcuma were collected. After DNA extraction， PCR amplification and sequencing， seven kinds of DNA barcoding sequences， including ITS， ITS2， matK， psbA-trnH， trnL-trnF， rpoB and atpB-rbcL， were firstly compared in terms of success rate of PCR amplification and characteristics of sequences. Then， by means of variation site analysis and genetic distance calculation， these seven kinds of DNA barcoding sequences were further evaluated. Finally， the unidentified samples were identified by the phylogenetic tree based on the chosen DNA barcoding sequences. The results were as follows： （1） ITS， ITS2 and matK barcoding sequences were inapplicable due to the low success rate of PCR amplification and sequencing; The variation information of psbA-trnH， trnL-trnF and rpoB was insufficient to distinguish three different original species of Curcumae Rhizoma; Only atpB-rbcL barcoding sequence was 642-645 bp in length with 29.0%-29.9% GC content and 11 variation sites， for which， the three species of Curcumae Rhizoma could be distinguished only by atpB-rbcL barcoding sequence. （2） According to the phylogenetic tree based on atpB-rbcL sequence， the unidentified samples were identified as Curcuma wenyujin. In conclusion， atpB-rbcL sequence could be used as a standard sequence for the rapid and efficient identification of original species of Curcumae Rhizoma.

Key words： Curcumae Rhizoma， DNA barcode， screening ， atpB-rbcL， original plant identification

中藥材莪術(shù)由廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis）、蓬莪術(shù)（C. phaeocaulis）和溫郁金（C. wenyujin）的根莖加工而成，為我國(guó)常用中藥材，具有行氣破血、消積止痛等功效（中國(guó)藥典，2015）。現(xiàn)代研究表明，不同來(lái)源莪術(shù)的化學(xué)成分和藥效存在較大差異（吳伯英和李敏，2012）：莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯等主要有效成分含量在不同來(lái)源莪術(shù)中有明顯差異（毛春芹等，2013）;藥效實(shí)驗(yàn)表明溫郁金治療胃癌和肝癌效果最好（唐德才等，2013;臧文華等，2014），婦科藥保婦康栓的主要成分莪術(shù)油主要來(lái)源于溫郁金（張永文和楊瑞琦，2010）。隨著國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)莪術(shù)需求量的日益增大，人工種植莪術(shù)已成為莪術(shù)藥材的主要來(lái)源（吳正強(qiáng)和趙小文，2003），為保證栽培選種正確，臨床用藥安全有效，莪術(shù)基原植物的準(zhǔn)確鑒別亟待解決。

廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)和溫郁金均為姜黃屬（Curcuma L.）植物，該屬植物的傳統(tǒng)鑒別主要基于花或葉片等的形態(tài)特征（中國(guó)植物志，2004;Záveská et al.， 2012;沈荔荔等，2014）。莪術(shù)三種基原植物形態(tài)特征類(lèi)似極易混淆，依靠形態(tài)特征的傳統(tǒng)鑒定和分類(lèi)比較困難（中國(guó)植物志，2004;肖小河等，2004），而人工栽培以及各地相互引種等因素加劇了分類(lèi)的不確定性，因此，有必要確定各地種植莪術(shù)的基原和種質(zhì)以保證正確種植。各學(xué)者分別運(yùn)用顯微鑒別、理化鑒別、RAPD分析和化學(xué)指紋圖譜（肖小河等，2000，2001;沈艷等，2014;楊豐慶等，2005;劉雙利等，2016）等對(duì)莪術(shù)基原植物進(jìn)行了研究，但上述方法在實(shí)際應(yīng)用中仍存在不少困難或因序列太長(zhǎng)而大大增加了應(yīng)用的難度（曹暉等，2010）。

本研究通過(guò)對(duì)多種DNA條形碼序列進(jìn)行篩選，建立了適用于莪術(shù)三種基原植物的DNA條形碼技術(shù)鑒定方法，同時(shí)也為姜黃屬植物的分類(lèi)和鑒定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)共收集14份材料，包括9份試驗(yàn)樣本和5份待檢樣本。蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)和溫郁金分別采自溫州、廣西、四川等道地產(chǎn)區(qū)，待測(cè)樣本采自海南和江西等引種地，具體信息見(jiàn)表1。材料由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所朱平老師鑒定。

1.2 方法

1.2.1 樣品 DNA 的提取、擴(kuò)增和測(cè)序 每個(gè)樣品取100 mg新鮮葉片，參照植物基因組DNA提取試劑盒（OMEGA HP Plant DNA Kit，美國(guó)）提取DNA。提取后的總DNA用微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo，美國(guó)）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。PCR擴(kuò)增使用的引物和擴(kuò)增程序參照相關(guān)文獻(xiàn)（表2）。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中，2x EcoTaq PCR SuperMix（Transgen， 中國(guó)） 12.5 μL，正反引物各1 μL，DNA模板20 ng。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送到華大基因公司純化，并雙向測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 利用 CodonCode Aligner V2.0 （CodonCode Co.，美國(guó)）對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，應(yīng)用相似性搜索法（BLAST）進(jìn)行防錯(cuò)，將正確的有效序列在GenBank注冊(cè)新序列號(hào)（表1）。運(yùn)用MEGA6.0 進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算種內(nèi)或種間 Kimura 2-parameter （ K2P）遺傳距離并構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

ITS、ITS2序列的PCR成功率雖可達(dá)到100%，但其測(cè)序峰圖表現(xiàn)為多位點(diǎn)的無(wú)規(guī)則套峰，無(wú)法得到準(zhǔn)確單一的序列。matK的平均擴(kuò)增成功率僅為18.75%。psbA-trnH、 rpoB、trnL-trnF和atpB-rbcL的PCR擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率都為100%，序列長(zhǎng)度介于325～645 bp之間，psbA-trnH和ropB的變異位點(diǎn)為0，trnL-trnF有1個(gè)變異位點(diǎn)，atpB-rbcL在14個(gè)樣品間有11個(gè)變異位點(diǎn)（表3）。

2.2 atpB-rbcL序列特征分析

通過(guò)對(duì)atpB-rbcL序列比較發(fā)現(xiàn)，蓬莪術(shù)的atpB-rbcL序列長(zhǎng)度為642 bp，溫郁金和廣西莪術(shù)的序列長(zhǎng)度均為645 bp。廣西莪術(shù)與溫郁金相比，僅在550位點(diǎn)上存在一個(gè)C到T轉(zhuǎn)換，而與蓬莪術(shù)相比存在8處堿基的不同，例如在76位點(diǎn)C到T轉(zhuǎn)換，259位點(diǎn)T插入，310位點(diǎn)C到T轉(zhuǎn)換，397位點(diǎn)C到T轉(zhuǎn)換，430位點(diǎn)4個(gè)堿基T缺失等。待測(cè)樣品中，江西新余、海南澄邁和臨高的atpB-rbcL序列與溫州溫郁金的一致性為100%，只有海南瓊山與溫州溫郁金的atpB-rbcL序列存在一個(gè)堿基變異。

2.3 遺傳距離計(jì)算及基于atpB-rbcL序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

應(yīng)用MEGA6.0軟件，基于K2P距離模型計(jì)算莪術(shù)不同基原植物間的遺傳距離。其中廣西莪術(shù)種內(nèi)遺傳距離均為0，溫郁金的種內(nèi)遺傳距離為0.000 4，蓬莪術(shù)的種內(nèi)遺傳距離為0.006 3;溫郁金與廣西莪術(shù)種間的平均遺傳距離為0.001 8，溫郁金與蓬莪術(shù)之間的平均遺傳距離均為0.008 1，廣西莪術(shù)和蓬莪術(shù)種間的遺傳距離平均為0.009 5。待測(cè)樣品中，海南樣品和溫州產(chǎn)溫郁金的遺傳距離在0～0.001 6之間，平均遺傳距離為0.000 5，江西樣品和溫州產(chǎn)溫郁金的遺傳距離均為0。

應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建基于atpB-rbcL序列的廣西莪術(shù)、溫莪術(shù)和蓬莪術(shù)的NJ系統(tǒng)樹(shù)（圖1）。在NJ系統(tǒng)樹(shù)上，溫郁金3個(gè)居群、廣西莪術(shù)4個(gè)居群和蓬莪術(shù)2個(gè)居群分別聚為單系分支，其中溫郁金和廣西莪術(shù)合聚為一大支，蓬莪術(shù)單獨(dú)聚為一支，表明基于atpB-rbcL序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹(shù)可將溫郁金、廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)三個(gè)物種明顯分開(kāi)，而溫郁金與廣西莪術(shù)的關(guān)系較近而與蓬莪術(shù)關(guān)系較遠(yuǎn)。待測(cè)樣品都與溫州產(chǎn)溫郁金聚在同一分支（圖1）。

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼技術(shù)自2003年提出以來(lái)，已成為全球生物分類(lèi)研究的熱點(diǎn)和方向（陳士林等，2013）。由于植物的核苷酸進(jìn)化速率低于動(dòng)物，且植物存在更多雜交和多倍化的進(jìn)化事件，植物中沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)的片段能像動(dòng)物COI一樣成為高效和通用條形碼。因此，篩選一個(gè)或多個(gè)適合植物分類(lèi)的DNA條形碼序列成為十分重要的研究?jī)?nèi)容（Chen et al.，2010; Group et al.，2011）。本研究在ITS、ITS2、atpB-rbcL、matK、psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB等7條DNA條形碼候選序列中，從PCR擴(kuò)增的難易程度，測(cè)序成功率和變異程度等方面，篩選到了一條適宜鑒定莪術(shù)基原植物DNA條形碼序列atpB-rbcL。

核基因ITS和ITS2在莪術(shù)類(lèi)植物間的測(cè)序成功率很低，Chen et al.（2014）認(rèn)為這主要是由于多倍體雜交和多年人工栽培造成的。雖可通過(guò)構(gòu)建單克隆載體的方式得到ITS2序列，但這無(wú)疑增加了成本和難度，且在姜黃屬內(nèi)能提供分辨率僅為46.7%（Chen et al.， 2014）。matK是植物DNA條形碼研究的核心條形碼序列之一（Leister et al.，1998），但它在本研究的樣本中PCR擴(kuò)增效率最低（18.75%），類(lèi)似的問(wèn)題在其他植物中也多有報(bào)道（Sass et al.， 2007;Hollingsworth et al.， 2009;Chen et al.， 2014）。Chen et al.（2014）利用多對(duì)引物和多次摸索后，將姜黃屬matK序列擴(kuò)增成功率提高至85.4%，卻發(fā)現(xiàn)姜黃屬matK序列不存在barcode gap（Chen et al.，2014）。我們利用其序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)matK序列不能將莪術(shù)不同基原植物分開(kāi)。從PCR擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率考慮，我們認(rèn)為matK、ITS和ITS2這三條序列不適宜作為莪術(shù)基原植物鑒定的候選序列。

psbA-trnH、ropB、trnL-trnF和atpB-rbcL這四條序列在本研究中的擴(kuò)增和測(cè)序成功率均為100%，但前三個(gè)序列在這些樣本中極度保守、進(jìn)化速率慢，其種間差異為零或差異極小，而atpB-rbcL存在豐富的變異。因此，我們將其作為莪術(shù)不同基原植物鑒定的適宜序列。在此基礎(chǔ)上，本研究基于atpB-rbcL序列，通過(guò)計(jì)算遺傳距離和構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹(shù)，將《中國(guó)藥典》中莪術(shù)的三種基原植物明顯區(qū)分開(kāi)，同時(shí)鑒定結(jié)果說(shuō)明海南和江西引種的樣品都為溫郁金。近年來(lái)海南種植莪術(shù)的規(guī)模越來(lái)越大，本文利用DNA條形碼技術(shù)，將海南引種的莪術(shù)基原植物鑒定為溫郁金，為其合理的開(kāi)發(fā)和利用提供了保障。

本研究對(duì)莪術(shù)基原植物的DNA條形碼鑒定進(jìn)行了初步的探討，篩選獲得的atpB-rbcL序列對(duì)莪術(shù)不同基原植物的快速準(zhǔn)確鑒定具有重要意義，但莪術(shù)基原植物的栽培品種眾多，且分布范圍廣，因此，進(jìn)一步擴(kuò)大取樣范圍十分必要。本研究可為莪術(shù)基原植物的品種選育、引種栽培等提供可行的方法，同時(shí)，也為姜黃屬植物的分類(lèi)和鑒定提供借鑒。

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（責(zé)任編輯 李 莉）