張玉秀 劉楊 劉培衛(wèi) 符傳坤 盧麗蘭 魏建和

摘 要：為尋找適用于中藥材莪術(shù)基原植物鑒定的DNA條形碼序列，探索快速高效的莪術(shù)基原植物鑒定的新方法，該文首先利用擴增成功率和測序成功率對中藥材莪術(shù)三種基原植物，9個樣本的7種DNA條形碼序列（ITS、ITS2、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、rpoB 和atpB-rbcL）進行評估，然后利用MEGA6.0軟件對獲得的高質(zhì)量的序列通過變異位點分析、遺傳距離計算和系統(tǒng)樹分析等進一步進行評估，最后將篩選到的DNA條形碼序列對未知基原的待測樣品進行基原鑒定。結(jié)果表明：（1）ITS、ITS2和matK等條形碼序列在莪術(shù)基原植物中的擴增或測序成功率較低，難以應用于實際鑒定;而psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB條形碼序列變異位點信息過少，不足于區(qū)分莪術(shù)的三種不同基原植物;只有atpB-rbcL條形碼序列的擴增和測序成功率較高，容易獲得高質(zhì)量的序列，同時序列長度（642～645 bp）理想，變異位點多（11個），可實現(xiàn)莪術(shù)的三種不同基原的區(qū)分鑒別。（2）待測樣品經(jīng)基于atpB-rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹鑒別為溫郁金。綜上所述，葉綠體atpB-rbcL序列能夠準確鑒定莪術(shù)不同基原植物，可以作為中藥材莪術(shù)基原植物鑒定的條形碼序列。

關(guān)鍵詞：莪術(shù)，DNA條形碼，篩選，atpB-rbcL，基原植物鑒定

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）08-1263-07

Abstract： In order to find a rapid and efficient identification method for three original species of Curcumae Rhizoma， identification efficiency of different DNA barcoding sequences were evaluated in present study. Totally nine samples of three different species of Curcuma were collected. After DNA extraction， PCR amplification and sequencing， seven kinds of DNA barcoding sequences， including ITS， ITS2， matK， psbA-trnH， trnL-trnF， rpoB and atpB-rbcL， were firstly compared in terms of success rate of PCR amplification and characteristics of sequences. Then， by means of variation site analysis and genetic distance calculation， these seven kinds of DNA barcoding sequences were further evaluated. Finally， the unidentified samples were identified by the phylogenetic tree based on the chosen DNA barcoding sequences. The results were as follows： （1） ITS， ITS2 and matK barcoding sequences were inapplicable due to the low success rate of PCR amplification and sequencing; The variation information of psbA-trnH， trnL-trnF and rpoB was insufficient to distinguish three different original species of Curcumae Rhizoma; Only atpB-rbcL barcoding sequence was 642-645 bp in length with 29.0%-29.9% GC content and 11 variation sites， for which， the three species of Curcumae Rhizoma could be distinguished only by atpB-rbcL barcoding sequence. （2） According to the phylogenetic tree based on atpB-rbcL sequence， the unidentified samples were identified as Curcuma wenyujin. In conclusion， atpB-rbcL sequence could be used as a standard sequence for the rapid and efficient identification of original species of Curcumae Rhizoma.

Key words： Curcumae Rhizoma， DNA barcode， screening ， atpB-rbcL， original plant identification

中藥材莪術(shù)由廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis）、蓬莪術(shù)（C. phaeocaulis）和溫郁金（C. wenyujin）的根莖加工而成，為我國常用中藥材，具有行氣破血、消積止痛等功效（中國藥典，2015）。現(xiàn)代研究表明，不同來源莪術(shù)的化學成分和藥效存在較大差異（吳伯英和李敏，2012）：莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯等主要有效成分含量在不同來源莪術(shù)中有明顯差異（毛春芹等，2013）;藥效實驗表明溫郁金治療胃癌和肝癌效果最好（唐德才等，2013;臧文華等，2014），婦科藥保婦康栓的主要成分莪術(shù)油主要來源于溫郁金（張永文和楊瑞琦，2010）。隨著國內(nèi)外市場對莪術(shù)需求量的日益增大，人工種植莪術(shù)已成為莪術(shù)藥材的主要來源（吳正強和趙小文，2003），為保證栽培選種正確，臨床用藥安全有效，莪術(shù)基原植物的準確鑒別亟待解決。

廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)和溫郁金均為姜黃屬（Curcuma L.）植物，該屬植物的傳統(tǒng)鑒別主要基于花或葉片等的形態(tài)特征（中國植物志，2004;Záveská et al.， 2012;沈荔荔等，2014）。莪術(shù)三種基原植物形態(tài)特征類似極易混淆，依靠形態(tài)特征的傳統(tǒng)鑒定和分類比較困難（中國植物志，2004;肖小河等，2004），而人工栽培以及各地相互引種等因素加劇了分類的不確定性，因此，有必要確定各地種植莪術(shù)的基原和種質(zhì)以保證正確種植。各學者分別運用顯微鑒別、理化鑒別、RAPD分析和化學指紋圖譜（肖小河等，2000，2001;沈艷等，2014;楊豐慶等，2005;劉雙利等，2016）等對莪術(shù)基原植物進行了研究，但上述方法在實際應用中仍存在不少困難或因序列太長而大大增加了應用的難度（曹暉等，2010）。

本研究通過對多種DNA條形碼序列進行篩選，建立了適用于莪術(shù)三種基原植物的DNA條形碼技術(shù)鑒定方法，同時也為姜黃屬植物的分類和鑒定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗共收集14份材料，包括9份試驗樣本和5份待檢樣本。蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)和溫郁金分別采自溫州、廣西、四川等道地產(chǎn)區(qū)，待測樣本采自海南和江西等引種地，具體信息見表1。材料由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所朱平老師鑒定。

1.2 方法

1.2.1 樣品 DNA 的提取、擴增和測序 每個樣品取100 mg新鮮葉片，參照植物基因組DNA提取試劑盒（OMEGA HP Plant DNA Kit，美國）提取DNA。提取后的總DNA用微量核酸蛋白測定儀（Thermo，美國）進行質(zhì)量檢測。PCR擴增使用的引物和擴增程序參照相關(guān)文獻（表2）。PCR反應體系為25 μL，其中，2x EcoTaq PCR SuperMix（Transgen， 中國） 12.5 μL，正反引物各1 μL，DNA模板20 ng。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。擴增成功的PCR產(chǎn)物送到華大基因公司純化，并雙向測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 利用 CodonCode Aligner V2.0 （CodonCode Co.，美國）對測序峰圖進行校對拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，應用相似性搜索法（BLAST）進行防錯，將正確的有效序列在GenBank注冊新序列號（表1）。運用MEGA6.0 進行多序列比對，計算種內(nèi)或種間 Kimura 2-parameter （ K2P）遺傳距離并構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增和測序

ITS、ITS2序列的PCR成功率雖可達到100%，但其測序峰圖表現(xiàn)為多位點的無規(guī)則套峰，無法得到準確單一的序列。matK的平均擴增成功率僅為18.75%。psbA-trnH、 rpoB、trnL-trnF和atpB-rbcL的PCR擴增效率和測序成功率都為100%，序列長度介于325～645 bp之間，psbA-trnH和ropB的變異位點為0，trnL-trnF有1個變異位點，atpB-rbcL在14個樣品間有11個變異位點（表3）。

2.2 atpB-rbcL序列特征分析

通過對atpB-rbcL序列比較發(fā)現(xiàn)，蓬莪術(shù)的atpB-rbcL序列長度為642 bp，溫郁金和廣西莪術(shù)的序列長度均為645 bp。廣西莪術(shù)與溫郁金相比，僅在550位點上存在一個C到T轉(zhuǎn)換，而與蓬莪術(shù)相比存在8處堿基的不同，例如在76位點C到T轉(zhuǎn)換，259位點T插入，310位點C到T轉(zhuǎn)換，397位點C到T轉(zhuǎn)換，430位點4個堿基T缺失等。待測樣品中，江西新余、海南澄邁和臨高的atpB-rbcL序列與溫州溫郁金的一致性為100%，只有海南瓊山與溫州溫郁金的atpB-rbcL序列存在一個堿基變異。

2.3 遺傳距離計算及基于atpB-rbcL序列的系統(tǒng)進化樹

應用MEGA6.0軟件，基于K2P距離模型計算莪術(shù)不同基原植物間的遺傳距離。其中廣西莪術(shù)種內(nèi)遺傳距離均為0，溫郁金的種內(nèi)遺傳距離為0.000 4，蓬莪術(shù)的種內(nèi)遺傳距離為0.006 3;溫郁金與廣西莪術(shù)種間的平均遺傳距離為0.001 8，溫郁金與蓬莪術(shù)之間的平均遺傳距離均為0.008 1，廣西莪術(shù)和蓬莪術(shù)種間的遺傳距離平均為0.009 5。待測樣品中，海南樣品和溫州產(chǎn)溫郁金的遺傳距離在0～0.001 6之間，平均遺傳距離為0.000 5，江西樣品和溫州產(chǎn)溫郁金的遺傳距離均為0。

應用MEGA6.0軟件構(gòu)建基于atpB-rbcL序列的廣西莪術(shù)、溫莪術(shù)和蓬莪術(shù)的NJ系統(tǒng)樹（圖1）。在NJ系統(tǒng)樹上，溫郁金3個居群、廣西莪術(shù)4個居群和蓬莪術(shù)2個居群分別聚為單系分支，其中溫郁金和廣西莪術(shù)合聚為一大支，蓬莪術(shù)單獨聚為一支，表明基于atpB-rbcL序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹可將溫郁金、廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)三個物種明顯分開，而溫郁金與廣西莪術(shù)的關(guān)系較近而與蓬莪術(shù)關(guān)系較遠。待測樣品都與溫州產(chǎn)溫郁金聚在同一分支（圖1）。

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼技術(shù)自2003年提出以來，已成為全球生物分類研究的熱點和方向（陳士林等，2013）。由于植物的核苷酸進化速率低于動物，且植物存在更多雜交和多倍化的進化事件，植物中沒有一個單獨的片段能像動物COI一樣成為高效和通用條形碼。因此，篩選一個或多個適合植物分類的DNA條形碼序列成為十分重要的研究內(nèi)容（Chen et al.，2010; Group et al.，2011）。本研究在ITS、ITS2、atpB-rbcL、matK、psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB等7條DNA條形碼候選序列中，從PCR擴增的難易程度，測序成功率和變異程度等方面，篩選到了一條適宜鑒定莪術(shù)基原植物DNA條形碼序列atpB-rbcL。

核基因ITS和ITS2在莪術(shù)類植物間的測序成功率很低，Chen et al.（2014）認為這主要是由于多倍體雜交和多年人工栽培造成的。雖可通過構(gòu)建單克隆載體的方式得到ITS2序列，但這無疑增加了成本和難度，且在姜黃屬內(nèi)能提供分辨率僅為46.7%（Chen et al.， 2014）。matK是植物DNA條形碼研究的核心條形碼序列之一（Leister et al.，1998），但它在本研究的樣本中PCR擴增效率最低（18.75%），類似的問題在其他植物中也多有報道（Sass et al.， 2007;Hollingsworth et al.， 2009;Chen et al.， 2014）。Chen et al.（2014）利用多對引物和多次摸索后，將姜黃屬matK序列擴增成功率提高至85.4%，卻發(fā)現(xiàn)姜黃屬matK序列不存在barcode gap（Chen et al.，2014）。我們利用其序列進行分析，發(fā)現(xiàn)matK序列不能將莪術(shù)不同基原植物分開。從PCR擴增效率和測序成功率考慮，我們認為matK、ITS和ITS2這三條序列不適宜作為莪術(shù)基原植物鑒定的候選序列。

psbA-trnH、ropB、trnL-trnF和atpB-rbcL這四條序列在本研究中的擴增和測序成功率均為100%，但前三個序列在這些樣本中極度保守、進化速率慢，其種間差異為零或差異極小，而atpB-rbcL存在豐富的變異。因此，我們將其作為莪術(shù)不同基原植物鑒定的適宜序列。在此基礎(chǔ)上，本研究基于atpB-rbcL序列，通過計算遺傳距離和構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹，將《中國藥典》中莪術(shù)的三種基原植物明顯區(qū)分開，同時鑒定結(jié)果說明海南和江西引種的樣品都為溫郁金。近年來海南種植莪術(shù)的規(guī)模越來越大，本文利用DNA條形碼技術(shù)，將海南引種的莪術(shù)基原植物鑒定為溫郁金，為其合理的開發(fā)和利用提供了保障。

本研究對莪術(shù)基原植物的DNA條形碼鑒定進行了初步的探討，篩選獲得的atpB-rbcL序列對莪術(shù)不同基原植物的快速準確鑒定具有重要意義，但莪術(shù)基原植物的栽培品種眾多，且分布范圍廣，因此，進一步擴大取樣范圍十分必要。本研究可為莪術(shù)基原植物的品種選育、引種栽培等提供可行的方法，同時，也為姜黃屬植物的分類和鑒定提供借鑒。

參考文獻：

CAO H， SASAKI Y， FUSHIMI H， et al.， 2010. Authentication of Curcuma species （Zingiberaceae） based on nuclear 18S rDNA and plastid trnK sequences [J]. Acta Pharm Sin， 45（7）： 926-933. [曹暉，佐佐木陽平，伏見裕利，等，2010. 基于核18S rDNA和葉綠體trnK序列鑒定姜黃屬植物 [J]. 藥學學報， 45（7）： 926-933.]

CHEN J， ZHAO J， ERICKSON DL， et al.， 2014. Testing DNA barcodes in closely related species of Curcuma （Zingiberaceae） from Myanmar and China [J]. Mol Ecol Resour， 5（2）：337-348.

CHEN SL，YAO H， HAN JP， et al.， 2010. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J]. PLoS ONE， 5（1）： e8613.

CHEN SL， YAO H， HAN JP， et al.， 2013. Principles for molecular identification of traditional Chinese materia medica using DNA barcoding [J]. Chin J Chin Mat Med， 38（2）：141-148. [陳士林， 姚輝， 韓建萍， 等，2013. 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則 [J]. 中國中藥雜志， 38（2）： 141-148.]

CHEN SL， 2015. Standard DNA barcodes Chinese for materia medica in Chinese Pharmacopoeia [M]. Beijing： Science Press. [陳士林， 2015. 中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列 [M]. 北京： 科學出版社.]

CHIANG T， 1998. Universal primers for amplification and sequencing a noncoding spacer between atpB and rbcL genes of chloroplast DNA [J]. Bot Bull Acad Sin， 39（4）： 245-250.

Chinese Pharmacopoeia Commission， 2015. Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China [M]. Beijing： China Medical Science Press. [國家藥典委員會， 2015. 中華人民共和國藥典 [M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社.]

Delectis Florae Reipublicae Popularis Sinicae Agendae Academiae Sinicae Edita， 2004. Flora Reipublicae Popularis Sinicae [M]. Beijing： Science Press. [中國科學院中國植物志編輯委員會， 2004. 中國植物志 [M]. 北京： 科學出版社.]

GROUP CB， LI DZ， GAO LM， et al.， 2011. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer （ITS） should be incorporated into the core barcode for seed plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 108（49）： 11964-19641.

HOLLINGSWORTH ML， ANDRA CA， FORREST LL， et al.， 2009. Selecting barcoding loci for plants： Evaluation of seven candidate loci with species-level sampling in three divergent groups of land plants [J]. Mol Ecol Resour， 9（2）： 439-457.

LEE SY， NG WL， MAHAT MN， et al.， 2016. DNA barcoding of the endangered Aquilaria ?（Thymelaeaceae） and its application in species authentication of agarwood products traded in the market [J]. PLoS ONE， 11（4）： e0154631.

LEISTER D， KURTH J， LAURIE DA， et al.， 1998. Rapid reorganization of resistance gene homologues in cereal genomes [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 95（1）： 370-375.

LIU SL， WANG XH， JIANG CX， et al.， 2016. RAPD-PCR analysis on different germplasm resources of Curcumae Rhizoma [J]. Chin Trad Herb Drugs， 47（17）： 3098-3102. [劉雙利， 王曉慧， 姜程曦， 等， 2016. 莪術(shù)種質(zhì)資源的RAPD-PCR分析 [J]. 中草藥， 47（17）： 3098-3102.]

MAO CQ， LU TL， JIANG GF， et al.， 2013. Determination of curdione， curcumol， germacrone， and β-elemene in processed Curcumae Rhizoma from different habitats [J]. Chin Trad Herb Drugs， 44（3）： 2834-2837. [毛春芹， 陸兔林， 姜國非， 等， 2013. HPLC法測定不同主產(chǎn)地莪術(shù)飲片中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯 [J]. 中草藥， 44（3）： 2834-2837.]

SASS C， LITTLE PD， STEVENSON WD， et al.， 2007. DNA Barcoding in the Cycadales： Testing the potential of proposed barcoding markers for species identification of cycads [J]. PLoS ONE， 2（11）： e1154.

SHEN LL， XU LZ， L JQ， et al.， 2014. Rhizome morphology and flowering characteristic of 5 species Curcuma plants [J]. J Zhongkai Univ Agric Eng， 27（4）： 11-14. [沈荔荔， 許麗珍， 呂錦權(quán)， 等， 2014. 5種姜黃屬植物的根莖形態(tài)及其相關(guān)特性與開花特性 [J]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院學報， 27（4）： 11-14.]

SHEN Y， LI Y， LIU TT， et al.， 2014. Microscopical and physicochemical identification of 3 sources of Curcumae Rhizoma [J]. Chem Res Appl， 26（2）： 267-270. [沈艷， 李羿， 劉婷婷， 等， 2014. 3種基源莪術(shù)的顯微及理化鑒定 [J]. 化學研究與應用， 26（2）： 267-270. ]

TANG DC， ZANG WH， FENG HH， 2013. Influences of medicated serum of different cultivars of Ezhu （ Rhizoma Zedoariae） on proliferation， apoptosis and nucleo-cytoplasmic ration human gastric carcinoma cells BGC823 [J]. J Beijing Univ Trad Chin Med， 36（4）： 254-257. [唐德才， 臧文華， 馮海紅， 2013. 莪術(shù)不同品種含藥血清對人胃癌細胞BGC823增殖、凋亡及核質(zhì)比的影響 [J]. 北京中醫(yī)藥大學學報， 36（4）： 254-257.]

WU BY， LI M， 2012. Study on the correlation between chemical composition and quality of Curcumae Rhizoma [J]. J Chengdu Univ TCM， 35（3）： 48-49. [吳伯英， 李敏， 2012. 多基原品種莪術(shù)化學成分與質(zhì)量的相關(guān)性研究 [J]. 成都中醫(yī)藥大學學報， 35（3）： 48-49.]

WU ZQ， ZHAO XW， 2003. A preliminary discussion about introduction of new varieties of Chinese herbal medicines from separate regions and their domestication from wildness [J]. J Agric Sci Technol， 5（3）： 57-59. [吳正強， 趙小文， 2003. 初論中草藥異地引種與野生馴化 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報， 5（3）： 57-59.]

XIAO XH， LIU FQ， SHI CH， et al.， 2000. RAPD polymorphism and authentication of medicinal plants from turmeric （Curcuma L.） in China [J]. Chin Trad Herb Drugs， 31（3）： 209-212. [肖小河， 劉峰群， 史成和， 等， 2000. 國產(chǎn)姜黃屬藥用植物RAPD分析與分類鑒定 [J]. 中草藥， 31（3）： 209-212.]

XIAO XH， XIA WJ， QIN SY， et al.， 2001. Pattern recognition of stereoscopic features of the leaves epidermis of medicinal Curcuma plants in China by image analysis [J]. Chin J Chin Mat Med， 26（8）： 523-528. [肖小河， 夏文娟， 秦松云， 等， 2001. 國產(chǎn)姜黃屬藥用植物葉表皮顯微圖像模式識別 [J]. 中國中藥雜志， 26（8）： 523-528.]

XIAO XH， ZHONG GY， SHU GM， et al.， 2004. Numerical taxonomy of medicinal plants of Curcuma in China [J]. Chin J Chin Mat Med， 29（1）： 15-24. [肖小河， 鐘國躍， 舒光明， 等， 2004. 國產(chǎn)姜黃屬藥用植物的數(shù)值分類學研究 [J]. 中國中藥雜志， 29（1）： 15-24.]

YANG FQ， LI SP， CHEN Y， et al.， 2005. The fingerprint of Ezhu by GC-MS [J]. Acta Pharm Sin， 40（11）： 1013-1018. [楊豐慶， 李紹平， 陳瑩， 等， 2005. 中藥莪術(shù)GC-MS指紋圖譜研究 [J]. 藥學學報， 40（11）： 1013-1018.]

ZANG WH， TANG DC， YIN G， et al.， 2014. Inhibition effects of compatibility of Astragali Radix and Curcumae Rhizoma and combination with cisplatin on orthotopic tumor in nude mice bearing human hepatocellular carcinoma [J]. Chin J Exp Trad Med Form， 20（5）： 131-136. [臧文華， 唐德才， 尹剛， 等， 2014. 黃芪-莪術(shù)配伍及聯(lián)合順鉑對人肝癌裸鼠原位移植瘤生長的抑制作用 [J]. 中國實驗方劑學雜志， 20（5）： 131-136.]

ZVESK E， FR T， DA O， et al.， 2012. Phylogeny of Curcuma （Zingiberaceae） based on plastid and nuclear sequences： Proposal of the new subgenus Ecomata [J]. Taxon， 61（4）： 747-763.

ZHANG YW， YANG RQ， 2010. Problems and proposals on the standards of Curcuma oil and its preparations [J]. Drug Stand Chin， 11（3）： 170-171. [張永文， 楊瑞琪， 2010. 莪術(shù)油及其制劑的質(zhì)量標準問題與建議 [J]. 中國藥品標準， 11（3）： 170-171.]

（責任編輯 李 莉）