刁志龍，辛 毅，劉 坤，吳燕紅，高煥方

(1.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 400054； 2.重慶渝泓土地開發(fā)有限公司， 重慶 401120；3.重慶市生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院， 重慶 401147)

機(jī)油屬于眾多石油產(chǎn)品中的一種，其廣泛用作機(jī)械潤(rùn)滑劑、金屬防銹劑和乳化劑[1]。由于其用途廣泛且每年使用量巨大，廢機(jī)油也隨之產(chǎn)生。在廢機(jī)油的運(yùn)輸、儲(chǔ)存和處理過程中存在管理的不規(guī)范，不可避免的導(dǎo)致土壤和水體被廢機(jī)油污染，對(duì)環(huán)境造成重大的影響，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅[2]。

生物修復(fù)是一種高效、適應(yīng)性強(qiáng)和低成本的技術(shù)[3]。目前，許多研究表明土壤原著微生物對(duì)石油烴有較好的降解效果[4-7]。但石油烴的生物降解是一個(gè)復(fù)雜的過程，其過程容易受微生物種類、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素等條件的影響[8]。并且各因素之間存在相互作用，傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)無法準(zhǔn)確表達(dá)各因素的交互作用，往往不能達(dá)到預(yù)期的優(yōu)化效果；因此目前主要采用的是正交實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面法，但正交實(shí)驗(yàn)是線性模擬，不能直接給出圖形觀察其最優(yōu)條件以及自變量之間的交互作用[9-10]。響應(yīng)面法(RSM)是一種面向?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法[11]。該方法可以根據(jù)少量具有代表性的局部點(diǎn)實(shí)驗(yàn)建立各因素與結(jié)果的數(shù)學(xué)模型，利用多元二次回歸方程來擬合各因素與結(jié)果之間的函數(shù)關(guān)系，最終通過回歸方程預(yù)測(cè)其最佳條件，揭示各因素的內(nèi)在聯(lián)系[12-13]。

本研究從石油烴污染土壤中篩選出一株能夠降解機(jī)油的菌株并對(duì)其進(jìn)行了鑒定；以機(jī)油為降解對(duì)象，考察了菌液投加量、溫度、pH值、機(jī)油濃度對(duì)機(jī)油降解率的影響，利用響應(yīng)面法中Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化降解條件，得到最佳的降解條件，并分析了溫度、pH值、機(jī)油濃度3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)機(jī)油生物降解的影響；同時(shí)在優(yōu)化后條件下擬合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程；為石油烴污染土壤和水體的生物修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤來源

取自重慶某石油烴污染場(chǎng)地，采用多點(diǎn)取樣，采取表層10～20 cm處的石油烴污染土壤，裝于自封袋里密封冷藏保存作為篩選石油烴降解菌株的樣品。

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蒸餾水1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，瓊脂20 g(固體培養(yǎng)基用)，蒸餾水1 000 mL。

無機(jī)鹽含油培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基+機(jī)油。

培養(yǎng)基均于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

稱取0.1 g機(jī)油，用石油醚溶于100 mL容量瓶中，得到濃度為1 000 mg/L的機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別移取0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mL的機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，定容并搖勻，得到濃度為8、10、12、14、16 mg/L的機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用紫外可見分光光度計(jì)在230 nm處，用1 cm的石英比色皿以石油醚為空白對(duì)照測(cè)定每個(gè)濃度的吸光度，然后以機(jī)油濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2石油烴降解菌的分離篩選

1) 稱取30 g石油烴污染土壤然后按固液比1∶5加入150 g去離子水，放入搖床160 r/min振蕩30 min，隨后取出抽濾，然后加入2%的瓊脂放入滅菌鍋里滅菌。待滅菌結(jié)束，倒入平板中冷卻備用。

2) 取10 g石油烴污染土壤放入已滅菌的裝有100 mL無菌水的250 mL的三角瓶中，放入搖床160 rpm振蕩10 min，靜置分層，得到菌懸液，吸取1 mL菌懸液加入9 mL無菌水中，依次稀釋至10-7，采用稀釋平板法進(jìn)行分離，取100 μL稀釋液涂布于平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中，觀察并記錄，待菌落長(zhǎng)好后，選擇形態(tài)特征不同的菌落，在平板上進(jìn)行多次劃線進(jìn)行分離純化，得到純種菌株。

3) 將分離得到的純種菌株轉(zhuǎn)至含油的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中，觀察其是否能以機(jī)油為唯一碳源生長(zhǎng)。將能以機(jī)油為唯一碳源生長(zhǎng)且生長(zhǎng)速度較快的石油降解菌株用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，然后放入冰箱在4 ℃低溫保存。

1.3.3ITS測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將篩選出的菌株送往科學(xué)指南針(長(zhǎng)沙)進(jìn)行分類學(xué)鑒定，采用omega HP真菌DNA提取試劑盒提取真菌基因組的樣品；利用ITS1/ITS4引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用Sanger法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，PCR產(chǎn)物條帶大小約為500～750 bp，采用雙向引物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行拼接處理，將測(cè)序結(jié)果中的序列信息，輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)中的Blast比對(duì)系統(tǒng)中，搜索數(shù)據(jù)庫中相似的序列，得到序列比對(duì)結(jié)果。采用MEGA 5.1軟件進(jìn)行進(jìn)一步的多重序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.3.4單因素實(shí)驗(yàn)

在機(jī)油初始濃度為5 000 mg/L的無機(jī)鹽含油培養(yǎng)中，在不同菌液接種量(1%、3%、5%、7%、9%，體積分?jǐn)?shù)，下同)、不同pH值(利用1 mol/L的NaOH及HCl調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7、8、9)、溫度(20、25、30、35、40 ℃)和機(jī)油初始濃度(1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 mg/L)的條件下160 r/min培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)結(jié)束后取出測(cè)定機(jī)油的殘留濃度，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.3.5響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

選取pH值(A)、溫度(B)、機(jī)油初始濃度(C)作為自變量，以-1、0、1代表因素的3個(gè)水平，以機(jī)油降解率為響應(yīng)值為Y；利用響應(yīng)面法中Box-Behnken設(shè)計(jì)來對(duì)ML-1降解機(jī)油的過程進(jìn)行研究和優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3.6ML-1降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法篩選出來的最佳降解條件，接入5%的菌液，每隔12 h測(cè)定殘留機(jī)油的濃度，分析機(jī)油的降解速率，模擬ML-1菌株降解機(jī)油的動(dòng)力學(xué)方程。

1.4 分析方法

機(jī)油降解率的測(cè)定采用紫外分光光度法，以石油醚為參比，在波長(zhǎng)230 nm處測(cè)其吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算機(jī)油的濃度，進(jìn)而計(jì)算機(jī)油的降解率，機(jī)油降解率的計(jì)算公式如下：

(1)

式中：w為初始機(jī)油濃度(mg/L)；w1為殘留機(jī)油濃度(mg/L)。

利用Design Expert v8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，利用方差分析確定擬合方程中每項(xiàng)的顯著性，并評(píng)估每種情況下的擬合度。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴降解菌株的分離篩選及鑒定

2.1.1機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.036 85x-0.055 6，R2=0.999。

圖1 機(jī)油標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2石油烴降解菌株的分離篩選

通過富集培養(yǎng)、分離純化以及含油培養(yǎng)基的驗(yàn)證，篩選出一株能以機(jī)油為唯一碳源生長(zhǎng)且生長(zhǎng)得較快較好的菌株；其顏色為白色，菌落很大、疏松、干燥、不透明、呈絨毛狀，菌體可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長(zhǎng)，如圖2所示。將其作為后續(xù)的研究對(duì)象，命名為ML-1。

圖2 ML-1的菌落形態(tài)圖

2.1.3分子生物學(xué)鑒定

利用ITS1/ITS4引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，ML-1菌株與Rigidoporus sp.strain FBV40相似度達(dá)到99%，屬于硬孔菌屬(Rigidoporus)真菌。通過ITS區(qū)域測(cè)序，最終確定菌株ML-1為Rigidoporus vinctus。采用MEGA5.1軟件進(jìn)行進(jìn)一步的多重序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

圖3 ML-1系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1菌液投加量對(duì)機(jī)油降解的影響

由圖4可以看出：機(jī)油的降解率隨著菌液投加量的增加而增大，但當(dāng)菌液接種量大于5%時(shí)，機(jī)油的降解率增幅不大。這可能是因?yàn)榫和都恿窟^多時(shí)，菌株的大量繁殖導(dǎo)致培養(yǎng)基中的菌密度過大，從而造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的短缺，不利于新生菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響機(jī)油的降解率[9]。因此菌液投加量并不是越多越好，在滿足處理要求的前提下，選擇適宜的投加量達(dá)到最佳的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。因此，菌液投加量選擇5%。

圖4 菌液投加量對(duì)機(jī)油降解率的影響曲線

2.2.2pH值對(duì)機(jī)油降解的影響

當(dāng)溫度為30 ℃，機(jī)油初始濃度為5 000 mg/L時(shí)，pH值對(duì)ML-1降解機(jī)油的影響如圖5所示。

圖5 pH值對(duì)機(jī)油降解率的影響

機(jī)油的降解率隨著pH值的增加，呈先升高后下降的趨勢(shì)；pH值在7～8時(shí)，ML-1能夠較好的降解機(jī)油，其降解率達(dá)到了70%以上。在強(qiáng)酸強(qiáng)堿的情況下機(jī)油的降解率都不太理想，這可能是因?yàn)樯矬w內(nèi)的降解酶受到了抑制，降解酶無法與污染物分子結(jié)合，從而影響菌株對(duì)機(jī)油的降解效果[14]。

2.2.3溫度對(duì)機(jī)油降解的影響

當(dāng)pH值為8，機(jī)油初始濃度為5 000 mg/L時(shí)，溫度對(duì)機(jī)油降解率的影響如圖6所示。機(jī)油的降解率呈拋物線型，先升高后下降。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)降解率最高，達(dá)到了75.1%；可以看出菌株降解機(jī)油的適宜溫度在25～30 ℃。溫度過高或過低，菌株對(duì)機(jī)油的降解能力都顯著降低，都低于20%。這可能是因?yàn)闇囟瓤梢杂绊懮矬w內(nèi)酶的活性，在適宜的溫度下可以加快降解酶與污染物分子的反應(yīng)速率；溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致酶失活，甚至殺死菌株；溫度過低會(huì)使菌株的活動(dòng)變慢，從而影響機(jī)油的降解效率[15]。

圖6 溫度對(duì)機(jī)油降解率的影響曲線

2.2.4初始濃度對(duì)機(jī)油降解的影響

當(dāng)溫度為30 ℃，pH值為8時(shí)，機(jī)油初始濃度對(duì)機(jī)油降解的影響如圖7所示。當(dāng)機(jī)油的初始濃度為3 000 mg/L時(shí)機(jī)油的降解率達(dá)到最大值(83.76%)；機(jī)油的初始濃度過高或者過低都不利于機(jī)油的降解，初始濃度過低由于碳源太少，無法滿足菌株大量繁殖的條件，不利于菌株的大量生長(zhǎng)；初始濃度過高可能對(duì)菌株產(chǎn)生毒害的作用，抑制菌株的生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致菌株死亡，從而影響菌株對(duì)機(jī)油的降解效率。

圖7 機(jī)油初始濃度對(duì)機(jī)油降解率的影響曲線

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化ML-1降解機(jī)油的條件

2.3.1響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以pH值、溫度和機(jī)油初始濃度作為影響菌株ML-1降解機(jī)油的3個(gè)因素，設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。實(shí)際與預(yù)測(cè)降解率值的對(duì)應(yīng)關(guān)系圖如圖8所示。

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖8 實(shí)際與預(yù)測(cè)機(jī)油降解率曲線

從表2和圖8可以看出實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合較好，通過軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)的進(jìn)行擬合，最終得到編碼方程模型見式(2)：

Y=85.45-13.1A-26.29B+0.86C+

5.29AB-1.58AC-14.91BC-

14.62A2-29.28B2-7.80C2

(2)

式中：Y為機(jī)油降解率(%);A為pH值；B為溫度(℃)；C為機(jī)油濃度(mg/L)。

2.3.2方差分析

響應(yīng)面二次回歸方程的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果

從表3可以看出：模型F值為295.34，P<0.000 1，表示該模型是顯著的；失擬項(xiàng)的F值為6.26，P>0.05，表明模型擬合的缺失相對(duì)于純誤差不顯著，從而說明模型的擬合度很好，接近真實(shí)的響應(yīng)面曲面情況，模型建立合理。從表3可以看出：A、B、BC、A2、B2的影響非常顯著(P<0.000 1)，AB、C2為顯著變量(P<0.05)，C、AC的影響不顯著(P>0.05)。分析可得：影響ML-1降解機(jī)油的3個(gè)因素排序?yàn)闇囟?pH值>機(jī)油初始濃度。

表4為響應(yīng)面二次模型的可信度分析結(jié)果，確定系數(shù)R2為0.997 4，調(diào)整系數(shù)R2為0.994 0，偏差系數(shù)CV=3.63%<10%和精密度為48.773表明該模型的可靠性和準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值之間存在良好的相關(guān)性，回歸模型能夠很好的解釋自變量與響應(yīng)之間的關(guān)系。

表4 響應(yīng)面二次模型可信度分析結(jié)果

2.3.3各因素的交互效應(yīng)分析

響應(yīng)面可以分析機(jī)油降解率與各因素的關(guān)系，同時(shí)能夠直觀反映各因素之間存在的交互作用。其中等高線的形狀可以反映2個(gè)因素的交互作用是否顯著，等高線形狀為橢圓說明2個(gè)因素交互作用顯著，形狀為圓形說明2個(gè)因素交互作用不顯著[16]。從圖9～11可以看出：溫度與pH值，溫度與機(jī)油初始濃度之間的交互作用顯著，pH值與機(jī)油初始濃度之間的交互作用不顯著。

圖9 溫度和pH值對(duì)機(jī)油降解率的交互作用圖

通過實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃晚憫?yīng)面分析得到ML-1降解機(jī)油的最佳條件為溫度為26 ℃，pH值為7.4，機(jī)油初始濃度為4 600 mg/L。在此條件下得到ML-1降解機(jī)油的理論最大值為99.13%。通過驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為94.74%，與預(yù)測(cè)值偏差不大。可見響應(yīng)面法優(yōu)化得到的條件準(zhǔn)確，為后續(xù)處理石油烴污染土壤和水提供了依據(jù)。

圖10 溫度和機(jī)油濃度對(duì)機(jī)油降解率的相互作用圖

圖11 機(jī)油濃度和pH值對(duì)機(jī)油降解率的相互作用圖

2.4 ML-1的降解動(dòng)力學(xué)方程模擬

Abioye等[17]研究發(fā)現(xiàn)微生物降解機(jī)油的過程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，可用方程(3)表示。

lnc=-kt+a

(3)

式中：c為底物濃度，k為反應(yīng)速率常數(shù)，t為反應(yīng)時(shí)間。

如圖12所示，ML-1降解機(jī)油的降解動(dòng)力學(xué)與一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合效果良好，其過程遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，動(dòng)力學(xué)方程為：lnc=-0.941t+9.368，其R2為0.976 7，反應(yīng)速率常數(shù)為0.941 mg/(L·d-1)，半衰期為0.74 d。

圖12 降解動(dòng)力學(xué)特征曲線

3 結(jié)論

1) 從石油烴污染土壤中分離出一株高效石油烴降解菌株ML-1對(duì)其進(jìn)行了ITS測(cè)序，確定該菌株為Rigidoporus vinctus。

2) 通過響應(yīng)面法對(duì)pH值、溫度和機(jī)油初始濃度3個(gè)對(duì)機(jī)油的生物降解影響顯著的因素進(jìn)行優(yōu)化，最終得出3個(gè)因素對(duì)機(jī)油降解的影響排序?yàn)闇囟?pH值>機(jī)油初始濃度；響應(yīng)面法確定的最佳降解條件為pH值為7.4，溫度為26 ℃，機(jī)油初始濃度為4 600 mg/L，其在最佳降解條件下預(yù)測(cè)的降解率為99.13%，實(shí)際驗(yàn)證降解率為94.74%，兩者相差不大。

3) 在響應(yīng)面法確定的最佳條件下，ML-1降解機(jī)油的過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，其R2為0.976 7，反應(yīng)速率常數(shù)為0.941 mg/(L·d-1)，半衰期為0.74 d。