李 明, 王 洋, 賈 翔, 吳 磊, 王 超, 高興愛, 李忠和*

(1.吉林建筑大學市政與環(huán)境工程學院, 松遼流域水環(huán)境教育部重點實驗室，長春 130118；2.遼寧省環(huán)保集團有限責任公司，沈陽 110000；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，長春 130124)

近年來，微藻和微生物在污水處理領域研究的深入，菌藻復合生物膜在水處理方面的研究在中外得到了普遍關注[1]。與傳統(tǒng)污水處理技術相比，菌藻復合生物膜污水處理技術具有脫氮除磷效果顯著等優(yōu)點，是備受關注的新型綠色能源技術[2-3]。

菌藻之間互利共生、共棲是菌藻生物膜微生態(tài)群落持續(xù)穩(wěn)定的基礎。藻類光合作用產(chǎn)生的氧氣比曝氣產(chǎn)氧可以被菌體有效利用，這樣細菌對污染物質(zhì)的去除顯著提高，且能耗降低、節(jié)約成本。同時，微藻在新陳代謝過程中通常會釋放生物大分子，如氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂類和碳水化合物等。細菌新陳代謝呼出的二氧化碳氣體還會被藻類所利用，從而形成了一種互利共生的關系，從而提高藻類對營養(yǎng)物質(zhì)(氮磷等)的去除[4]。此外，細菌會釋放維生素、酶等促進藻類生長。所以，利用菌藻之間的互利共生原理，通過菌、藻微生物構建復合系統(tǒng)將菌藻各自的功能有機整合，從而提升對污水中氮磷營養(yǎng)物和有機物污染物降解能力，這為開發(fā)低碳、高效的生活污水處理技術提供了新的思路[5]。

隨著分子生物學、代謝組學和轉錄學等技術的發(fā)展，菌藻關系的研究逐漸深入。然而，菌藻復合生物膜中的真菌也是其可不忽視的組成部分，但是相關的報道卻十分有限[6]。因此，本研究擬采用高通量測序技術，分析菌藻復合生物膜反應器中的真菌群落結構，這對進一步研究菌藻生物膜的形成和演替機理以及污染物的去除機制具有一定的指導意義，同時為提升菌藻生物膜污水處理技術提供理論依據(jù)。

1 實驗過程

1.1 菌藻生物膜樣本采集

在菌藻復合生物膜反應器中，使用無菌聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)管隨機采集生物膜樣本3份，合并混勻為一份，存放至-80 ℃的冰箱中，待提取檢測分析[7]。

1.2 DNA的提取與質(zhì)量評估

使用DNA SPIN extraction kits(MP Bio, USA)試劑盒提取DNA。使用紫外可見分光光度計(Quawell Q5000, USA)檢測DNA濃度，利用D260/D280值檢測DNA的純度；并通過脂糖凝膠電泳和成像檢測DNA的完整性[8]。

1.3 真菌DNA擴增測序

使用菌藻復合生物膜中提取的DNA原液作為真菌的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增模板，使用ITS5(GGA AGTAAAAGTCGTA ACAAGG)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)引物為對真菌ITS1區(qū)進行PCR擴增。擴增30個循環(huán)，參數(shù)為:預變性(98 ℃，2 min)，變性(98 ℃，15 s)，退火(55 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，5 min)。反應結束后，PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后使用對菌藻生物膜樣本中的真菌進行測序(Illumina MiSeq)。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理與分析

為了整合原始雙端測序數(shù)據(jù)，①通過滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列進行質(zhì)量篩查(從5’端第一個堿基位置開始移動，窗口為10 bp，步長為1 bp，且要求≥ 99%的堿基平均測序準確率)；②使用FLASH軟件，配對連接質(zhì)量初篩過的雙堿基，兩條堿基序列Read 1與Read 2的重疊長度應≥10 bp，并根據(jù)樣本所對應的Index信息分配入對應樣本；③使用QIIME軟件，對所獲得的相似序列為97%的堿基序列進行歸并和可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)劃分，對于低于總測序總量0.001%豐度值的OUT剔除。

使用Origin軟件繪制堿基序列長度分布圖、以及每個測序深度下的OTU稀疏曲線、OUT分類鑒定圖，以及生物膜中真菌的類水平特征、物種豐度和多樣性分布圖。

2 結果與分析

2.1 測序篩選與OUT劃分

研究以菌藻生物膜中的真菌為研究對象，通過原始真菌的測序序列進行拼接過濾，去除嵌合體和非靶區(qū)域序列，經(jīng)質(zhì)量篩查、有效序列Index匹配，最終獲得真菌有效序列為44 323條。如圖1所示，菌藻生物膜樣本中真菌的序列長度覆蓋了150～400區(qū)間，主要集中在150～330之間，特別是200～270之間。

圖1 序列長度分布

對樣品中真菌序列豐度低于菌藻生物膜樣本中測序總量0.001%的真菌OUT進行剔除，之后再對真菌在門、綱、目、科、屬、種的OTU劃分(圖2)得出，樣本中的真菌125門、115綱、111目、92科、76屬、139種，未分類(指未能歸屬到任何已知分類單元的OTU數(shù))23。

圖2 OTU劃分和分類地位鑒定

2.2 多樣性分析

OTU豐富等級曲線用于分析物種的多樣性物種豐度以及物種的均勻度這兩個特征[9]。如圖3所示，在水平方向上，OTU豐富等級曲線的寬度代表真菌物種的豐度情況，從110～160水平方向上范圍最大，說明這區(qū)間樣品中真菌物種的豐度越高；在OTU豐富等級曲線垂直方向上的平緩程度體現(xiàn)了樣本中真菌物種的均勻度，從60水平之后曲線趨于平緩，這說明物種分布逐漸均勻。

圖3 OTU豐度等級曲線

將真菌序列數(shù)與其對應觀察的物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)關系，如圖4所示。在序列數(shù)<2 000時，隨著樣本測序量的增加，香農(nóng)指數(shù)急劇增加；序列數(shù)>2 000 時，隨著樣本測序量的增加，香農(nóng)指數(shù)已經(jīng)平衡。香濃指數(shù)是評價群落多樣性的重要指標之一，數(shù)值與群落的多樣性正相關，菌藻生物膜中真的香濃指數(shù)為2.59。當序列數(shù)<20 000時，觀察到的物種數(shù)量隨著樣本測序量的加而增加，新的真菌不斷出現(xiàn)；當測序條帶數(shù)量>20 000時，觀察到的物種數(shù)量增加較少，稀疏曲線趨于飽和新的真菌不再增加，這說明本研究無需加大樣本測序的深度，可以涵蓋到菌藻生物膜樣品中的整個真菌菌群，已經(jīng)反映菌藻生物膜中真菌群落組成。

圖4 真菌稀疏曲線

2.3 分類學組成分析

根據(jù)菌藻生物膜中真菌分類地位鑒定結果，如圖5所示，從而獲得菌藻生物膜中真菌在門、綱、目、科、屬、種組成的不同分類水平的具體組成。研究中菌藻復合生物膜樣品中真菌OUT分類屬于8個門、16個綱、31個目、34個科、41個屬和76個種。

圖5 真菌分類鑒定

進一步對OUT分類序列利用QIIME軟件對與數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對，從而獲取每個OTU對應的真菌分類學信息，對于相對豐度小于0.01%和未鑒定的OUT統(tǒng)稱為未分類。

研究在菌藻生物膜樣品中鑒定到真菌門類為4個，如圖6所示。相對豐度比例最大為球囊菌門(Glomeromycota)為40.00%，其為菌藻生物膜中真菌的優(yōu)勢門。球囊菌門為真菌的主要門類之一，在土壤環(huán)境和水環(huán)境中普遍存在[10-11]。子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度比例比較接近為次優(yōu)勢門類，相對豐度比例分別約24.90%和24.80%。壺菌多處于水生環(huán)境中[10]，特別是寄生于藻類、原生動物以及其他真菌上，具有促進壞死部分分解的作用，而研究壺菌門(Chytri-diomycota)相對豐度比例比最低，為3.10%，這很可能因為菌藻生物膜中的群落狀態(tài)良好，從而導致其缺乏生長與附著條件。

圖6 真菌門水平相對豐度

為了進一步深入分析菌藻生物膜中真菌組成特征，對樣本進行屬水平真菌群落分類鑒定，如表1所示，其中未確定屬和豐度小于0.01%的屬水平真菌定義為未鑒定(unidentified)。球囊菌門(Ascomycota)在屬水平數(shù)量最多，有6個屬，其中:盤菌屬Peziza相對豐度最大為23.5%，而黑酵母菌屬(Aureobasidium)0.2%，曲霉菌屬(Aspergillus)、蘇吉雅瑪酸乳桿菌屬(Capnobotryella)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)不足1%，unidentified為0.6%。擔子菌門(Basidiomycota)在屬水平上次之，有4個屬。其中:未命名屬(Paratritirachium)為2.30%，布勒彈孢酵母屬(Bullera)為0.40%，未命名屬(Colacogloea)為0.40%，亡革菌屬(Thanatephorus)為0.30%，未確定屬(unidentified)為21.40%。球囊菌門(Glomeromycota)在屬水平上只有兩個屬，其中雷德克拉屬(Redeckera)相對豐度最高，達39.80%，但無梗囊霉屬(Acaulospora)相對豐度較低，僅為0.20%。

表1 真菌屬水平相對豐度

3 結論

菌藻復合生物膜污水處理反應器中真菌的序列長度覆蓋了150～400區(qū)間，主要集中在150～330之間，特別是200～270之間。菌藻復合生物膜樣品中真菌OUT分類屬于4個門和12個屬。在門水平上，真菌優(yōu)勢門球囊菌門為(Ascomycota)豐度約為40.00%，次優(yōu)勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度為24.90%和24.80%。在屬水平上，真菌優(yōu)勢屬雷德克拉屬(Redeckera)豐度最高為39.80%，次優(yōu)勢屬為泡質(zhì)盤菌(Peziza)23.50%。研究結果對進一步深入研究菌藻生物膜污水反應器中真菌群落功能和污水機制具有重要的理論和指導意義。