屈曉一 王婷 白樂樂西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)呼吸內(nèi)科 70004;西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)全科 70004

目前,肺癌已成為導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。因?yàn)樵缙谌狈μ禺愋园Y狀和體征,肺癌患者診斷時往往處于中晚期,失去手術(shù)機(jī)會,這是肺癌病死率居高不下的主要原因。按照病理類型,肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)。其中,NSCLC可進(jìn)一步分為:腺癌(38.5%)、鱗狀細(xì)胞癌(30.0%)、大細(xì)胞肺癌(2.9%)[2]。近年來,部分肺腺癌患者的預(yù)后因?yàn)獒槍Ρ砥どL因子受體(epidemal growth factor receptor,EGFR)突變、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排等分子靶向藥物的廣泛使用而得以明顯改善[3]。然而,無上述突變的腺癌及鱗癌等類型因發(fā)病分子機(jī)制不明確、缺乏特異性治療靶點(diǎn),至今仍無顯著進(jìn)展[4]。因此,積極探索肺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中參與的分子機(jī)制,進(jìn)一步確定治療靶點(diǎn),有望改善肺癌治療效果,延長患者生存期。

S100A6作為S100蛋白家族中重要的一員,已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。S100蛋白是最早由Moore等從牛腦中分離出的一種高度酸性鈣結(jié)合蛋白[6]。目前,S100家族已知擁有25個成員,其中至少16個成員基因位于1號染色體長臂2區(qū)1帶(1q21)。該區(qū)段染色體穩(wěn)定性差,易發(fā)生多種染色體重排,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7-8]。在肺癌中,已證實(shí)S100A6在不同的肺癌亞型中存在差異表達(dá)。與單純支氣管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma,BAC)相比,S100A6在混合有BAC成分的肺腺癌亞型中有更高的表達(dá)。在免疫組織化學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中,與正常肺組織和局限性腫瘤組織相比,S100A6在侵襲性肺癌組織中表達(dá)更高。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)S100A6在肺癌患者腫瘤細(xì)胞裂解物、血漿及胸腔積液標(biāo)本中存在,高S100A6蛋白峰提示患者中位生存期較長[9]。在本研究中,我們將在細(xì)胞水平證實(shí)S100A6對肺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響,探究肺癌發(fā)生的可能分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 p LVX-AcGFP1-N1-S100A6、慢病毒載體的構(gòu)建及細(xì)胞感染 實(shí)驗(yàn)性研究。將肺癌細(xì)胞株Calu-6(購于中國科學(xué)院)培養(yǎng)擴(kuò)增1～2周后用pcDNA-S100A6聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法制備PLVX-AcGFP1-N1-S100A6。引物設(shè)計(jì)如下:正向引 物 為5′-CCCAAGCTTACCATGGCATGCCCCCTGGTCA-3′,反 向 引 物 為5′-CGGAATTCCGGTCAGCCCTTGAGGGCTTCATT-3′。然 后 應(yīng)用DNA測序來驗(yàn)證定位和插入序列。

p LVX-AcGFP1-N1-S100A6、pspax2和pmd2.G以2∶1∶1的比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。72 h后在顯微鏡下觀察熒光表達(dá),收集上清液,然后通過0.45μm PVDF過濾器(微孔)過濾,超離心(50 000 g,150 min,4℃)后獲得30倍的濃縮原料。將顆粒重新懸浮在PBS中,并在-80℃下儲存。

取對數(shù)期生長的Calu-6細(xì)胞,胰酶消化調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml鋪于6孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時,加入S100A6過表達(dá)慢病毒(MOI=10),空載體對照慢病毒(MOI=10)轉(zhuǎn)染Calu-6細(xì)胞,并設(shè)置空細(xì)胞組為空白對照,命名三組為:Calu-6/S100A6實(shí)驗(yàn)組(Calu-6/S100A6組)、Calu-6/空載體對照組(Calu-6/neo組)、Calu-6空細(xì)胞對照組(Calu-6組)。感 染48 h后 收 細(xì) 胞 樣 進(jìn) 行QPCR、Western blot方法檢測S100A6表達(dá)情況,驗(yàn)證過表達(dá)效果。

1.2 RNA提取和QPCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen,USA)進(jìn)行細(xì)胞裂解,收集離心上清液,在上清液中依次加入氯仿、2-丙醇和75%乙醇,分離RNA。提取RNA后,使用Nanodrop 2000(Thermo,USA)檢測RNA的濃度和純度。使用Revert Aid First Strand cDNA合成試劑盒(Thermo,USA)完成反轉(zhuǎn)錄過程,所有步驟均按說明書嚴(yán)格執(zhí)行。PCR的具體步驟和條件為:孵育(95℃、5 min)、變性(94℃、30 s共44周)、退火(55℃、30 s)、延伸(72℃、30 s)。此外,PCR中使用的引物信息如下:S100A6正向引 物(5′-GGGAGGGTGACAAGCACAC-3′)和S100A6反 向 引 物(5′-AGCTTCGAGCCAATGGTGAG-3′)；甘 油 醛-3-磷 酸 脫 氫 酶(GAPDH,內(nèi)源性對照)正向引物(5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′)和GAPDH反 向 引 物(5′-GGCTGT-TGTCATACTTCTCATGG-3′)。

1.3 Western-blot 感染48 h后,收集細(xì)胞并使用總蛋白提取試劑盒進(jìn)一步獲取細(xì)胞裂解物。對裂解液進(jìn)行離心澄清(14 000 r/min,10 min),然后將裝載樣品緩沖液添加到裂解液中,在95℃下加熱5 min,用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封堵硝化纖維過濾器,然后在4℃下與S100A6的一抗(MAB769Hu22,USCN生命科學(xué)公司,中國武漢,稀釋度1/500)孵育過夜。同時,將小鼠GAPDH抗體作為內(nèi)源性對照。隨后,沖洗膜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記聚合物的二抗(LAB769Hu71,USCN生命科學(xué)公司,中國武漢,1/5 000稀釋液),再次沖洗,然后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察成像。

1.4 MTT增殖曲線測定 取對數(shù)期細(xì)胞Clau-6,空載體細(xì)胞,過表達(dá)載體細(xì)胞離心制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至(5～10)×104/ml。將細(xì)胞懸液制備好后,輕輕混勻,吸取100μl細(xì)胞懸液接種于96孔板中,每種細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔,邊緣孔用無菌PBS填充。將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)24 h,36 h,48 h,60 h,72 h時間點(diǎn)取出酶標(biāo)儀測定吸光度。小心吸棄上清,加入90μl新鮮培養(yǎng)液,再加入10μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清,每孔加入100μl Formazan溶解液,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 取對數(shù)期生長的細(xì)胞,0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞,800 r/mim離心5 min,棄上清液,用無血清Dulbecco改良Eagle培 養(yǎng) 基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium,DMEM)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml。將3組單細(xì)胞重懸液各取100μl加入上室,下室中加入600μl含30%FBS的DMEM培養(yǎng)液。種板時注意下層培養(yǎng)基和小室中的聚碳酸酯膜間不要有氣泡產(chǎn)生,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。取出小室,小心吸去上室的培養(yǎng)液,PBS緩沖液輕洗3次,用消毒濕棉簽輕輕擦凈上室未遷移細(xì)胞,95%乙醇固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min,自來水沖洗3次以上,晾干,100倍光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲步驟類似,稍有不同的是后者所需六孔板涂有Matrigel基質(zhì)膠。

1.6 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)用來檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。取對數(shù)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度為3×105/ml。將細(xì)胞懸液制備好后,輕輕混勻,吸取2 000μl細(xì)胞懸液接種于6孔板中,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)行流式檢測。分組處理后離心5 min(1 000 r/min,4℃),收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌2次,再次離心5 min(1 000 r/min,4℃),收集細(xì)胞,調(diào)整濃度為(1～5)×105/ml。吸棄PBS,加入100μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。然后,加入5μl的Annexin VFITC和10μl的PI染色液,輕輕混勻。避光、室溫反 應(yīng)10～15 min。加 入400μl 1×Binding Buffer,混勻后置于冰上,樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

在流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期檢測過程中,離心后細(xì)胞需在75%乙醇中固定1 h,用PBS洗滌,用100μl RNase A溶液處理,重新懸浮,然后在37℃的水中浸泡30 min。在400μl PI染色液存在下,將細(xì)胞沉淀在4℃的黑暗中培養(yǎng)30 min,然后在488 nm的波長下用流式細(xì)胞儀分析混合物。我們使用Cell Quest和Mid Fit軟件來確定細(xì)胞周期,主要包括G1、S、G2三個階段。

1.7 動物實(shí)驗(yàn) 在小鼠實(shí)驗(yàn)中,15只8～10周齡Balb/c裸鼠被分為Calu-6組(n=4)、Calu-neo組(n=4)和Calu-6/S100A6組(n=7)。將2.5×106/L穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Calu-6/S100A6細(xì)胞(添加在200μl PBS中)注射到小鼠的右前背部。對照組同時注射等量的Calu-6空細(xì)胞和Calu-6/空載體細(xì)胞。每周測量每只小鼠的腫瘤體積,記錄數(shù)據(jù)。5周后,處死小鼠,取出腫瘤,然后拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表達(dá)。采用單因素方差分析比較符合正態(tài)分布的3組數(shù)據(jù)差異。涉及組間、時間點(diǎn)雙因素的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A6 m RNA和蛋白表達(dá)情況 根據(jù)是否被S100A6過表達(dá)慢病毒載體感染,將Calu-6肺癌細(xì)胞分為3組,分別為Calu-6/S100A6實(shí)驗(yàn)組,Calu-6/空載體對照組,Calu-6空細(xì)胞對照組(Calu-6組)。感染48 h后使用QPCR和Western blot方法檢測感染效果。與Calu-6/空載體對照組(Calu-6/neo組),Calu-6空細(xì)胞對照組相比,S100A6在Calu-6/S100A6實(shí)驗(yàn)組(Calu/S100A6組)中高表達(dá),蛋白(圖1A)及mRNA(圖1B)表達(dá)均呈上升趨勢,提示感染率高。

圖1 感染后S100A6在三組細(xì)胞中蛋白和m RNA表達(dá)

2.2 S100A6抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移 MTT和Transwell用來檢測細(xì)胞增殖能力、侵襲和遷移能力。感染S100A6后,相比于Calu-6/neo,Calu-6,Calu-6/S100A6實(shí)驗(yàn)組增殖能力下降,3組組間、時點(diǎn)間以及組間·時點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見表1。相比于對照組,Calu-6/S100A6實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力和遷移能力均下降(P＜0.05),分別見圖2、圖3。

圖2 Calu-6,Calu-6/neo及Calu-6/S100A6侵襲能力 A:Calu-6；B:Calu-6/neo；C:Calu-6/S100A6；D:柱狀圖

圖3 Calu-6,Calu-6/neo及Calu-6/S100A6遷移能力 A:Calu-6；B:Calu-6/neo；C:Calu-6/S100A6；D:柱狀圖

表1 3組細(xì)胞平均吸光值比較(±s)

表1 3組細(xì)胞平均吸光值比較(±s)

組別 小鼠(n) 平均吸光值24 h 36 h 48 h 60 h 72 h Calu-6 4 0.452±0.004 0.622±0.010 0.749±0.007 0.838±0.005 0.993±0.005 Calu-6/neo 4 0.457±0.002 0.614±0.004 0.740±0.009 0.822±0.008 0.985±0.004 Calu-6/S100A6 7 0.385±0.002 0.510±0.007 0.584±0.004 0.637±0.006 0.725±0.004組間 F=1 841.990，P＜0.01時點(diǎn)間 F=9 734.160，P＜0.01組間·時點(diǎn)間 F=193.110，P＜0.01

2.3 S100A6促進(jìn)Calu-6細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡能力及細(xì)胞周期變化。感染S100A6過表達(dá)慢病毒載體后,Calu-6/S100A6組 凋 亡 比 例 明 顯 升 高(P＜0.05)。Calu-6/S100A6組處于G1期的細(xì)胞比例顯著高于Calu-6對照組和Calu/neo組(P＜0.05)。與對照組比較,Calu-6/S100A6實(shí)驗(yàn)組G1期到S期轉(zhuǎn)化能力下降(P＜0.05)。見表2。

表2 3組細(xì)胞凋亡能力及細(xì)胞周期變化比較(%,±s)

表2 3組細(xì)胞凋亡能力及細(xì)胞周期變化比較(%,±s)

注:與Calu-6/S100A6組比較,a P＜0.05；與Calu-6/neo組比較,b P＜0.05

組別 小鼠(n) 細(xì)胞凋亡 G1期細(xì)胞 S期細(xì)胞Calu-6 4 8.86±0.61ab 60.98±0.74ab 21.08±0.70a Calu-6/neo 4 10.01±0.07a 58.97±0.18a 21.98±1.81a Calu-6/S100A6 7 13.88±0.04 75.16±0.78 8.69±0.84 F值 401.937 967.195 238.394 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.4 S100A6抑制Calu-6細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:從第2周開始,Calu-6/S100A6實(shí)驗(yàn)組與對照組腫瘤體積的差距逐漸擴(kuò)大。3組組間、時點(diǎn)間以及組間時點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

表3 3組動物腫瘤體積比較

3 討論

在本研究中,我們構(gòu)建了S100A6表達(dá)慢病毒載體,并將其感染Calu-6細(xì)胞,進(jìn)一步探討了S100A6在肺癌細(xì)胞系中的作用。通過比較三組(Calu-6、Calu-6/neo、Calu-6/S100A6)的細(xì)胞生物學(xué)行為,發(fā)現(xiàn)S100A6可抑制Calu-6肺癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移,抑制該細(xì)胞株凋亡并抑制細(xì)胞周期中G1期向S期改變,證實(shí)S100A6可能有抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展的作用。

近年來,S100蛋白家族中一些成員作為多種惡性腫瘤的輔助診斷和評估預(yù)后的生物標(biāo)志物越來越受到研究者的重視。這些蛋白通過結(jié)合Ca2+和激活Ca2+介導(dǎo)的信號通路參與許多細(xì)胞活動,如細(xì)胞增殖、分裂等[10]。S100A6作為該家族中一個重要而獨(dú)特的成員,在不同類型的腫瘤中也有不同的表達(dá)[11]。S100A6又稱為Calcylin蛋白,最初在Ehrlich腹水腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),也是S100蛋白家族中第一個被確定與細(xì)胞增殖有關(guān)的蛋白。研究發(fā)現(xiàn),與靜止細(xì)胞相比,S100A6在處于高增殖的細(xì)胞中有高表達(dá),例如,Luu等[12]的研究發(fā)現(xiàn),S100A6在骨肉瘤中表達(dá)明顯升高。Stulík等[13]研究正常結(jié)腸組織細(xì)胞、結(jié)腸腺瘤細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中S100A6的表達(dá),證實(shí)S100A6在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)升高。關(guān)于S100A6對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究則得出了矛盾的結(jié)論,即S100 A6在多種腫瘤中的升高可能會介導(dǎo)兩種相反的細(xì)胞生物學(xué)功能。例如,在胰腺癌中S100A6表達(dá)升高與促進(jìn)細(xì)胞分化及預(yù)后差有關(guān),m RNA和蛋白水平顯示S100A6誘導(dǎo)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)β-連環(huán)蛋白、N-黏連蛋白、波形蛋白表達(dá)增加,E黏連蛋白表達(dá)下降,而β-連環(huán)蛋白sh RNA可影響胰腺癌細(xì)胞內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的表達(dá),如E-黏連蛋白表達(dá)增加,N-黏連蛋白、波形蛋白表達(dá)下降。也就是說,S100A6蛋白通過激活β-連環(huán)蛋白而促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithlial-mesenchymal trans differentiation,EMT),進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的侵襲性,S100A6也有可能成為胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。但在骨肉瘤中,S100A6水平增高則提示著腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能性小[14]。

在肺癌中,De Petris等[9]檢測了S100A6在A549腫瘤細(xì)胞裂解物以及39例NSCLC患者的血清和胸水中的表達(dá)情況,證實(shí)翻譯后修飾的S100A6蛋白在上述標(biāo)本中均有表達(dá)。此外,研究進(jìn)一步證實(shí),S100A6陽性的病例傾向于擁有更長的生存時間,尤其那些P53表達(dá)陰性的病例[9]。相關(guān)免疫組織化學(xué)研究結(jié)果顯示:103例NSCLC組織中,25%S100A6表達(dá)陽性,且在腺癌中表達(dá)高于鱗癌(P＜0.01),S100A6表達(dá)陽性者生存期較陰性者長。上述研究與我們的研究得出的結(jié)論類似,即S100A6在肺癌細(xì)胞水平上被證實(shí)有抑癌作用。但也有一些學(xué)者得出相反的結(jié)論,He等[15]使用免疫組織化學(xué)方法檢測了177例肺鱗癌患者組織S100A6表達(dá)并根據(jù)其表達(dá)情況繪制生存曲線,發(fā)現(xiàn)S100A6高表達(dá)的患者生存期較短。關(guān)于其具體機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),S100A6的廣泛生物學(xué)功能源自其可能與其他蛋白質(zhì)結(jié)合并通過誘導(dǎo)構(gòu)象變化、干擾翻譯后蛋白的方式影響其他蛋白的功能。體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),S100A6蛋白可以綁定到p53的N端,在其磷酸化區(qū)域較非磷酸化區(qū)域有較高的親和力。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明S00A6可影響抑癌基因p53作用的發(fā)揮,這可能是通過p53上至少含有6個乙?；嚢彼岬膮^(qū)域—p300來實(shí)現(xiàn)的。Song等研究也發(fā)現(xiàn),在Hep G2細(xì)胞株中,S100A6表達(dá)增高的細(xì)胞內(nèi)p53的轉(zhuǎn)錄活性也增高,同時這些細(xì)胞凋亡的敏感性也更容易被過氧化氫誘發(fā)[16]。電泳遷移率變動分析顯示S100A6不影響p53與DNA結(jié)合,但另一方面,S100A6存在下p53易出現(xiàn)核堆積。故總的來說S100A6與p53相互作用并影響其生物活性[16]。

本研究證實(shí)S100A6可從多方面抑制Calu-6肺癌細(xì)胞株生長。但結(jié)合目前其他學(xué)者的研究結(jié)論,S100A6在肺癌中可能扮演較復(fù)雜角色,其發(fā)揮作用具體的機(jī)制也需要進(jìn)一步研究,在未來的實(shí)驗(yàn)中也希望將在多種肺癌細(xì)胞株及多層面探究S100A6在肺癌中所發(fā)揮的具體作用及具體分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突