黃茂發(fā)，梁晶晶，趙祥秀，唐榕澤，高躍美，張文，羅廷榮，李曉寧

摘要：【目的】明確豬源腫瘤壞死因子α（TNF-α）多克隆抗體的特異性和反應(yīng)性，并探索豬瘟病毒（CSFV）感染對(duì)PK-15細(xì)胞分泌TNF-α的影響，為揭示CSFV的致病機(jī)理打下基礎(chǔ)?！痉椒ā刻崛SFV病料基因組RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增TNF-α基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-TNF-α并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，經(jīng)純化和濃縮后免疫SPF級(jí)昆明小鼠制備TNF-α多克隆抗體;同時(shí)構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α，分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞和PK-15細(xì)胞表達(dá)融合蛋白，通過(guò)Western blotting、ELISA和間接免疫熒光分析等方法檢測(cè)TNF-α多克隆抗體效價(jià)、反應(yīng)性及特異性?！窘Y(jié)果】以原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-TNF-α轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能表達(dá)出約43 kD的融合蛋白，且主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。以真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞可表達(dá)出25 kD的融合蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且均勻分布。制備獲得的TNF-α多克隆抗體能與轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白TNF-α及PK-15細(xì)胞的內(nèi)源蛋白TNF-α發(fā)生良好反應(yīng)，即具有較好的反應(yīng)特異性，其抗體效價(jià)高達(dá)1∶8000。CSFV能刺激PK-15細(xì)胞分泌蛋白TNF-α上調(diào)表達(dá)，且TNF-α與其下游因子（TRAF1）的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，即二者間存在一定關(guān)聯(lián)性?！窘Y(jié)論】制備獲得的TNF-α蛋白抗體具有效價(jià)高、反應(yīng)性好及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)CSFV感染后真核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1產(chǎn)生，參與TRAF1相關(guān)信號(hào)通路而發(fā)揮其生物學(xué)功能，CSFV感染PK-15細(xì)胞后TNF-α和TRAF1的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信號(hào)通路，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 豬;腫瘤壞死因子α（TNF-α）;多克隆抗體;豬瘟病毒（CSFV）

中圖分類號(hào)： S852.651? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）09-2572-10

Porcine TNF-α high level expression and preparation

of its polyclonal antibody

HUANG Mao-fa1，2， LIANG Jing-jing1，2， ZHAO Xiang-xiu1，2， TANG Rong-ze1，2，

GAO Yue-mei1，2， ZHANG Wen1，2， LUO Ting-rong1，2*， LI Xiao-ning1，2*

（1College of Animal Science and Veterinary Medicine，Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】To determine the specificity and reactivity of porcine tumor necrosisfactor α（TNF-α） polyclonal antibody，and the effects of CSFV infection on TNF-α secretion of PK-15 cells were investigated，to lay a foundation for revealing the pathogenic mechanism of classical swine fever virus（CSFV）. 【Method】The TNF-α gene was amplified by RT-PCR using RNA template extracted from CSFV infected PK-15 cells，to construct prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-TNF-α and transform BL21 competent cells to induce the expression of fusion protein. Purified and concentrated SPF level Kunming mice were immunized with TNF-α polyclonal antibody. At the same time，eukaryotic expression vector pcDNA3.0-TNF-α was constructed and transfected into HEK-293T cell and PK-15 cell to express TNF-α. Titer，reactivity and specificity of TNF-α polyclonal antibody was detected by Western blotting，ELISA andindirect immunofluorescence methods. 【Result】Prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-TNF-α transformed BL21 competent cells could express about 43 kD fusion protein induced by IPTG，and it was mainly expressed in the form of inclusion body. The eukaryotic expression vector pcDNA3.0-TNF-α transfected HEK-293T cells could express 25 kD fusion protein，which was mainly expressed in cytoplasm and evenly distributed. The prepared TNF-α polyclonal antibody could react well with the fusion protein TNF-α expressed in HEK-293T cells and the endogenous protein TNF-α in PK-15 cells，and had a good reaction specificity and the antibody titer was as high as 1∶8000. CSFV could up-regulate the expression of TNF-α secreted by PK-15 cells. The expression trend of TNF-α and its downstream factor （TRAF1） was basically consistent，therewas certain correlation between them. 【Conclusion】The TNF-α protein antibody has the characteristics of high effective valence，good reactivity and strong specificity，it can be used to detect the overexpression of TNF-α level in eukaryotic cells after CSFV infection. TNF-α can stimulate TRAF1 production and participate in TRAF1-related signaling pathway to play its biological function. The expression of TNF-α and TRAF1 is similar after CSFV infected PK-15 cells. These results suggest that CSFV can stimulate TNF-α and TRAF1 signaling pathways，and leads to the inflammatory reaction.

Key words： porcine; tumor necrosis factor α（TNF-α）; polyclonal antibody; classical swine fever virus（CSFV）

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0500104）; Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFBA281170）

0 引言

【研究意義】腫瘤壞死因子是由活化的巨噬或單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制作用，能促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬，抵抗細(xì)菌和病毒感染，參與自身免疫性疾病的病理?yè)p傷，從而引起發(fā)熱癥狀（呂志敢和郭政，2006;Kalliolias and Ivashkiv，2016）。腫瘤壞死因子分為T(mén)NF-α和TNF-β，二者均有致熱性，小劑量分泌呈單峰熱，大劑量則產(chǎn)生雙峰熱，不耐熱，70 ℃作用30 min即失去活性。TNF-α是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的小分子蛋白，對(duì)于腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性，是至今為止醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子（李蕊蕊等，2018;蘇韞等，2018）。TNF-α又稱惡液素，可誘發(fā)機(jī)體發(fā)生惡液質(zhì)（Amber et al.，2015），少量TNF-α具有殺滅癌細(xì)胞的作用，過(guò)量則無(wú)效或造成機(jī)體器官壞死。TNF-α還參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，是多種信號(hào)通路的關(guān)鍵因子。因此，開(kāi)展TNF-α與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）感染的相關(guān)性研究，對(duì)揭示CSFV的致病機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TNF-α存在2種生物活性形式，即跨膜TNF-α（tmTNF-α）和可溶性TNF-α（sTNF-α），最初作為一種25 kD的跨膜蛋白，可被TNF-α轉(zhuǎn)換酶分裂，釋放出1個(gè)17 kD的可溶性分子（Cruceriu et al.，2020）。tmTNF-α和sTNF-α需通過(guò)對(duì)應(yīng)的受體——腫瘤壞死因子受體（TNFR1和TNFR2）才能發(fā)揮生物活性作用，其中TNFR1在幾乎所有的細(xì)胞類型上均有表達(dá)，被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)經(jīng)典TNF-α功能的主要介質(zhì)，而TNFR2的表達(dá)僅限于免疫細(xì)胞（Ba et al.，2017）。sTNF-α的傳導(dǎo)主要通過(guò)結(jié)合TNFR1發(fā)揮作用，而tmTNF-α主要連接TNFR2發(fā)生效應(yīng)，均能誘導(dǎo)多種信號(hào)通路的激活，包括核因子NF-κB和MAPK及細(xì)胞凋亡相關(guān)通路（Sade-Feldman et al.，2013）。TNF-α的生物學(xué)作用在種屬間無(wú)明顯差異，已有研究證實(shí)人類TNF-α與小鼠TNF-α的氨基酸序列相似性為79%，而功能和作用暫未發(fā)現(xiàn)差異性（Caminero et al.，2011）。還有研究表明，通過(guò)基因工程技術(shù)修飾TNF-α，在N端缺失2個(gè)氨基酸殘基（1Val和2Arg）后，其生物學(xué)活性和抗腫瘤效應(yīng)更佳（Solmaza et al.，2011）。此外，Solmaza等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，將TNF-α的8Pro、9Ser、10Asp和157Leu分別替換為8Arg、? 9Lys、10Arg和157Phe，合成TNF-α較天然TNF-α在體外殺傷L929細(xì)胞的活性約增強(qiáng)1000倍。在炎性感染過(guò)程中，TNF-α水平的升高能促進(jìn)白三烯和氧自由基的生成，進(jìn)一步損傷腸黏膜，加劇黏膜充血、水腫及壞死，導(dǎo)致機(jī)體皮膚發(fā)紫和腸道糜爛等癥狀（楊季云等，2007）。von Rosen等（2013）研究發(fā)現(xiàn)CSFV感染豬體后，其血清TNF-α水平均有所升高，且表現(xiàn)為弱毒株較強(qiáng)毒株的TNF-α水平延遲2～3 d到達(dá)峰值。Li等（2016）研究表明，在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的感染過(guò)程中，整合素—金屬蛋白酶17（A disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM-17）參與TNF-α的產(chǎn)生。Bercier和Grenier（2019）研究發(fā)現(xiàn)，一些病原微生物入侵豬體時(shí)，可誘導(dǎo)其氣管上皮細(xì)胞分泌TNF-α，進(jìn)而破壞上皮屏障的完整性，使連接蛋白受損?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】TNF-α是一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，在針對(duì)細(xì)菌或病毒感染的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Ting and Bertrand，2016）。至今，有關(guān)人類及鼠等生物的TNF-α已得到深入研究（Caminero et al.，2011），但針對(duì)豬TNF-α的研究相對(duì)較少。此外，研究病毒感染過(guò)程中豬體內(nèi)TNF-α的變化規(guī)律及其作用機(jī)制需應(yīng)用豬源TNF-α抗體，但目前生物制品市場(chǎng)尚缺乏此類抗體?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆豬TNF-α基因并進(jìn)行原核表達(dá)及純化，免疫昆明小鼠制備TNF-α多克隆抗體，采用Western blotting、ELISA及間接免疫熒光分析等方法驗(yàn)證豬源TNF-α多克隆抗體的特異性和反應(yīng)性，并探索CSFV感染對(duì)PK-15細(xì)胞分泌TNF-α的影響，為揭示CSFV的致病機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、Flag標(biāo)簽鼠單克隆抗體、表達(dá)載體pGEX-4T-1和pcDNA3.0、PK-15細(xì)胞系、HEK-293T細(xì)胞系、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒及CSFV石門(mén)株均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供;4周齡SPF級(jí)昆明小鼠（平均體重18 g/只）購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

在GenBank上搜索豬TNF-α基因序列（登錄號(hào)JF831365.1）的完整編碼區(qū)（CDS）序列，根據(jù)試驗(yàn)需求設(shè)計(jì)特異性引物（表1），并委托華大基因生物科技（深圳）有限公司合成。

1. 3 豬源TNF-α多克隆抗體制備

1. 3. 1 原核表達(dá)載體構(gòu)建 提取CSFV病料基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，采用TNF-α-F/TNF-α-R引物對(duì)擴(kuò)增TNF-α基因，并克隆至pMD18-T載體上獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-TNF-α，然后與原核載體pGEX-4T-1分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后以T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，以鑒定原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-TNF-α是否構(gòu)建成功。

1. 3. 2 融合蛋白TNF-α表達(dá)及純化 以原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-TNF-α轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性菌落在37 ℃下?lián)u床（200 r/min）培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8，加入終濃度為0.05或0.50 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)6 h。取誘導(dǎo)菌液進(jìn)行超聲波破碎，4 ℃下12000 r/min離心10 min，分別收集上清液、沉淀和總菌進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blotting檢測(cè)，以確定融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件及其表達(dá)形式;并對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)一步優(yōu)化，確定大量表達(dá)融合蛋白的最佳條件。最后，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，經(jīng)KCl染色后取相應(yīng)位置的凝膠進(jìn)行切膠，PBS反復(fù)凍融，最后稀釋出的液體即為純化融合蛋白。

1. 3. 3 免疫小鼠及收集血清 將純化融合蛋白與弗氏佐劑乳化成混合物，采用背部皮下多點(diǎn)注射對(duì)SPF級(jí)昆明小鼠進(jìn)行免疫，免疫周期按1、7、21和35 d進(jìn)行4次免疫，每只小鼠每次注射的融合蛋白免疫劑量約500 μg，4次免疫后第7 d摘除小鼠眼球采血，收集血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 豬源TNF-α真核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pMD18-T-TNF-α經(jīng)F-TNF1/F-TNF2引物對(duì)擴(kuò)增TNF-α基因，然后克隆至真核載體pcDNA3.0上，通過(guò)PCR挑選陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，以鑒定真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α是否構(gòu)建成功。HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，參考脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，按脂質(zhì)體∶質(zhì)粒為2 μL∶0.8 μg的比例，以真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞總蛋白，采用Flag標(biāo)簽鼠單克隆抗體（1∶1000）進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

1. 5 TNF-α多克隆抗體反應(yīng)性及特異性鑒定

采用12孔板培養(yǎng)PK-15細(xì)胞至70%～80%融合時(shí)，棄上清液后感染1 MOI的CSFV，于感染后0、12、24、36、48和72 h分別收集細(xì)胞總蛋白，同時(shí)收集1.4中真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞樣品，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。一抗為制備的TNF-α多克隆抗體，用PBS或牛奶封閉液稀釋1000、2000、4000、8000和16000倍;二抗為HRP標(biāo)記馬抗小鼠IgG。此外，將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，以真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12 h后進(jìn)行間接免疫熒光分析，觀察TNF-α在PK-15細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。

1. 6 TNF-α多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

以真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞樣品為抗原，用抗原包被液進(jìn)行稀釋并包被ELISA酶標(biāo)板底，然后以制備的TNF-α多克隆抗體為一抗、HRP標(biāo)記馬抗小鼠IgG為二抗，以未免疫的小鼠血清為陰性對(duì)照，利用間接ELISA測(cè)定TNF-α多克隆抗效價(jià)。

1. 7 TNF-α真核表達(dá)檢測(cè)

以真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染0、6、9、12、24、36和48 h后收集細(xì)胞樣品，去除培養(yǎng)基，加入800 μL的RNA細(xì)胞裂解液，常溫裂解5 min，吹打若干次后收集于1.5 mL EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加入200 μL RIPA裂解液及2 μL蛋白酶抑制劑，冰浴10 min，轉(zhuǎn)移至EP管中，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定及Western blotting檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 豬TNF-α基因片段測(cè)序分析結(jié)果

GenBank已收錄的豬TNF-α基因序列（登錄號(hào)JF831365.1）全長(zhǎng)699 bp，共編碼232個(gè)氨基酸殘基;編碼蛋白分子量為25 kD，其親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1所示，抗原表位平均峰值均大于1.55，說(shuō)明具有良好的抗原表位，可對(duì)基因全長(zhǎng)進(jìn)行原核表達(dá)。

2. 2 豬源TNF-α基因擴(kuò)增結(jié)果

采用特異性引物TNF-α-F/TNF-α-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得699 bp的TNF-α基因目的條帶（圖2-A）。膠回收目的片段后與載體pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定結(jié)果如圖2-B所示;對(duì)陽(yáng)性菌進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pMD18-T-TNF-α構(gòu)建成功。

2. 3 豬源TNF-α基因原核/真核表達(dá)載體構(gòu)建情況

對(duì)構(gòu)建獲得的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-TNF-α和真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α分別進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示。送至生工生物工程（上海）股份有限公司的測(cè)序結(jié)果也均表明，原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-TNF-α和真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α構(gòu)建成功。

2. 4 融合蛋白TNF-α誘導(dǎo)及其表達(dá)形式鑒定結(jié)果

以原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-TNF-α轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，采用終濃度為0.05或0.50 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6 h，SDS-PAGE分析（圖4-A）和Western blotting檢測(cè)（圖4-B）結(jié)果顯示，重組菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能表達(dá)出約43 kD的融合蛋白，融合蛋白主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，且以終濃度為0.05 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)效果較優(yōu)。

2. 5 融合蛋白TNF-α的純化鑒定結(jié)果

由于融合蛋白TNF-α主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，且載體設(shè)計(jì)時(shí)人工添加His標(biāo)簽序列，與Ni-NTA親和層析柱結(jié)合較差，因此使用切膠純化方法進(jìn)行純化。對(duì)融合蛋白TNF-α進(jìn)行SDS-PAGE分析，以KCl染色后取目的蛋白條帶進(jìn)行切膠純化，純化的融合蛋白TNF-α再進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示在43 kD處有1條清晰的目的條帶（圖5），說(shuō)明成功獲得較高純度的融合蛋白TNF-α。

2. 6 真核表達(dá)蛋白TNF-α鑒定結(jié)果

使用12孔板培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞至70%～80%融合時(shí)，分別轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.0及攜帶Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞總蛋白，以Western blotting檢測(cè)HEK-293T細(xì)胞中融合蛋白TNF-α的表達(dá)情況，結(jié)果（圖6）顯示，除了在25 kD處觀察到融合蛋白TNF-α外，在17 kD的位置還有少量的可溶性TNF-α。

2. 7 TNF-α多克隆抗體與真核表達(dá)蛋白的反應(yīng)性

TNF-α多克隆抗體按1∶1000、1∶2000、1∶4000和1∶8000的比例進(jìn)行稀釋，通過(guò)Western blotting檢測(cè)TNF-α多克隆抗體與真核表達(dá)蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果（圖7）顯示，1∶8000倍稀釋TNF-α多克隆抗體時(shí)仍可檢測(cè)到HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)的融合蛋白TNF-α，表明制備獲得的TNF-α多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性。

2. 8 TNF-α多克隆抗體與CSFV感染PK-15細(xì)胞分泌蛋白TNF-α的反應(yīng)性

采用12孔板培養(yǎng)PK-15細(xì)胞至70%～80%融合時(shí)，棄上清液后感染1 MOI的CSFV，于感染后0、12、24、36、48和72 h收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果（圖8）顯示，CSFV感染后24 h其病毒蛋白開(kāi)始表達(dá)，且呈上調(diào)趨勢(shì);而PK-15細(xì)胞分泌蛋白TNF-α從感染后36 h開(kāi)始上調(diào)表達(dá)，于感染72 h時(shí)達(dá)峰值，其變化趨勢(shì)與病毒蛋白基本一致，即CSFV能刺激PK-15細(xì)胞分泌蛋白TNF-α上調(diào)表達(dá)。

2. 9 TNF-α多克隆抗體特異性檢測(cè)結(jié)果

以真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，真核載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染12 h后分別用Flag標(biāo)簽單克隆抗體（1∶500）和制備的TNF-α多克隆抗體（1∶300）為一抗孵育轉(zhuǎn)染的PK-15細(xì)胞，以FITC熒光標(biāo)記馬抗鼠IgG抗體為二抗，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光信號(hào)并拍照分析。結(jié)果（圖9）顯示，真核載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染的PK-15細(xì)胞未檢測(cè)到熒光信號(hào)，而經(jīng)真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染后其細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，可清楚觀察到細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核熒光較細(xì)胞質(zhì)稍暗，說(shuō)明融合蛋白TNF-α主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且均勻分布，也表明TNF-α多克隆抗體與真核細(xì)胞表達(dá)TNF-α具有較好的反應(yīng)特異性，可用于間接免疫熒光分析。

2. 10 TNF-α多克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

收集真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞樣品為抗原，以制備的TNF-α多克隆抗體和未免疫小鼠血清為一抗，利用間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為T(mén)NF-α多克隆抗體孔的OD450 nm與未免疫小鼠陰性血清對(duì)照孔的OD450 nm比值差異顯著（P/N）>2.1，鑒定為陽(yáng)性的最高稀釋度即為其抗體效價(jià)。由圖10可知，當(dāng)TNF-α多克隆抗體1∶8000稀釋時(shí)，P為0.276，N為0.107，P/N=2.579>2.1;當(dāng)TNF-α多克隆抗體1∶16000稀釋時(shí)，P為0.230，N為0.119，P/N=1.932<2.1，因此確定TNF-α多克隆抗體效價(jià)為1∶8000。

2. 11 真核表達(dá)TNF-α及其下游因子（TRAF1）的變化

使用12孔板培養(yǎng)PK-15細(xì)胞至70%～80%融合時(shí)，分別轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α和真核載體pcDNA3.0，在轉(zhuǎn)染0、6、9、12、24、36和48 h后收集PK-15細(xì)胞總蛋白和RNA樣品，對(duì)TNF-α基因及TRAF1的表達(dá)變化進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α后，TNF-α基因表達(dá)變化倍數(shù)在轉(zhuǎn)染6 h時(shí)達(dá)74.8倍，轉(zhuǎn)染12 h時(shí)達(dá)峰值（354.4倍），隨后逐漸下降，至轉(zhuǎn)染48 h時(shí)降至51.9倍;而真核載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染組只有2.0～4.0倍的上升幅度（圖11-A）。在TNF-α存在的條件下，PK-15細(xì)胞中的TRAF1表達(dá)受到影響，TRAF1表達(dá)變化倍數(shù)在轉(zhuǎn)染12 h時(shí)可達(dá)3.4倍，變化趨勢(shì)與TNF-α基因基本一致，但變化幅度不明顯（圖11-B）。Western blotting檢測(cè)結(jié)果（圖11-C）表明，TNF-α從轉(zhuǎn)染12 h時(shí)開(kāi)始表達(dá)，至轉(zhuǎn)染24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值;隨著TNF-α的表達(dá)，TRAF1的水平從轉(zhuǎn)染12 h時(shí)開(kāi)始上調(diào)，于轉(zhuǎn)染24 h時(shí)達(dá)峰值后逐漸下調(diào)?？梢?jiàn)，TNF-α與TRAF1的變化趨勢(shì)基本一致，即二者間存在一定關(guān)聯(lián)性。

3 討論

CSFV感染能引起宿主皮膚、脾臟、腎臟及淋巴結(jié)等器官組織廣泛性出血和淤血。CSFV進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后，最早侵害的是血管內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1、IL-6和IL-8等促炎因子，由于入侵的數(shù)量相對(duì)較少，引起的炎癥反應(yīng)不強(qiáng)烈（范學(xué)政等，2013）。當(dāng)CSFV在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并釋放到細(xì)胞外感染其他細(xì)胞時(shí)，則再次啟動(dòng)新一輪的促炎因子分泌，隨著感染細(xì)胞數(shù)量的不斷增加，炎癥反應(yīng)也愈加強(qiáng)烈，血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變性、壞死，甚至脫落，而導(dǎo)致出血（Bensaude et al.，2004）。von Rosen等（2013）研究證實(shí)，CSFV感染豬只后其體內(nèi)的TNF-α、INF-α和IL-8等促炎因子水平明顯升高。本研究的Western blotting檢測(cè)結(jié)果也表明，CSFV感染可引起PK-15細(xì)胞的TNF-α表達(dá)水平上調(diào)。此外，CSFV感染后能刺激核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB產(chǎn)生，從而引起腸道炎癥反應(yīng)，致使結(jié)腸黏膜損傷（Hiscott et al.，2001）。NF-κB是一類與某些基因啟動(dòng)子區(qū)特定核苷酸序列結(jié)合的蛋白，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程（Dong et al.，2013）。NF-κB廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞中，在多條信號(hào)通路中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，且激活后可與不同基因一起調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程，尤其在腫瘤的形成和發(fā)展中扮演著重要角色（劉金輝等，2008）。TRAF1是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族的重要成員之一，也是TNF-α下游的重要因子，在TNF-α誘導(dǎo)NF-κB的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TNF-α和TRAF1均屬于NF-κB通路相關(guān)蛋白，但其具體作用機(jī)制尚未明確。

由于豬TNF-α基因編碼蛋白親水性較好，抗原表位平均峰值均大于1.55，全長(zhǎng)都具有良好的抗原表位，無(wú)信號(hào)肽，因此本研究以豬TNF-α基因全長(zhǎng)進(jìn)行原核表達(dá)。融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致包涵體形成，但包涵體在純化時(shí)需使用變性劑將其溶解，充分暴露出His標(biāo)簽，以便與Ni-NTA層析柱結(jié)合而達(dá)到純化蛋白的目的（李延生等，2014;陳東榮等，2021）。雖然Ni-NTA層析法具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但其電泳、透析及染色等過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，致使蛋白純化效率降低，純化成本增高。本研究選用KCl染色切膠純化蛋白的方法，在保證不改變?cè)械鞍咨锘钚缘那疤嵯?，參考NaAc染色切膠純化法，以KCl取代NaAc染色蛋白及反復(fù)凍融后，并通過(guò)快速離心等步驟取代原來(lái)的電泳后過(guò)夜透析等步驟，結(jié)果顯示，KCl染色切膠純化獲得的融合蛋白TNF-α經(jīng)SDS-PAGE分析和Western blotting檢測(cè)，證實(shí)其純度和濃度均滿足免疫要求，將融合蛋白TNF-α與弗氏佐劑乳化后對(duì)SPF級(jí)昆明小鼠進(jìn)行4次免疫，制備獲得的TNF-α多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性，其效價(jià)為1∶8000。

為了驗(yàn)證TNF-α多克隆抗體的反應(yīng)性，本研究利用真核載體pcDNA3.0成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0-TNF-α，分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞和PK-15細(xì)胞后均可表達(dá)出接近于天然結(jié)構(gòu)的融合蛋白，且具有完整的空間結(jié)構(gòu)，與真核細(xì)胞表達(dá)蛋白呈高度親和性。間接免疫熒光分析結(jié)果也證實(shí)TNF-α多克隆抗體可檢測(cè)在PK-15細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的TNF-α，且有較強(qiáng)的特異性熒光;通過(guò)Western blotting還能檢測(cè)到CSFV感染PK-15細(xì)胞后產(chǎn)生的內(nèi)源性TNF-α?？梢?jiàn)，本研究制備獲得的TNF-α多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性。此外，PK-15細(xì)胞感染CSFV后，TNF-α的表達(dá)呈明顯上調(diào)趨勢(shì);在PK-15細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TNF-α?xí)r，其下游因子TRAF1的mRNA和蛋白水平均呈上調(diào)趨勢(shì)，即TNF-α能上調(diào)TRAF1的表達(dá)。TNF-α和TRAF1均能刺激NF-κB產(chǎn)生，而NF-κB普遍存在于多種組織細(xì)胞中，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，并發(fā)揮多種生物學(xué)功能（Devergne et al.，1996）。CSFV感染PK-15細(xì)胞后，TNF-α和TRAF1的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明CSFV入侵動(dòng)物機(jī)體后同時(shí)刺激TNF-α和TRAF信號(hào)通路，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

制備獲得的TNF-α蛋白抗體具有效價(jià)高、反應(yīng)性好及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)CSFV感染后真核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1產(chǎn)生，參與TRAF1相關(guān)信號(hào)通路而發(fā)揮其生物學(xué)功能，CSFV感染PK-15細(xì)胞后TNF-α和TRAF1的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明CSFV能同時(shí)刺激TNF-α和TRAF1信號(hào)通路，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）