盧利平 丁功濤 劉苗 張利 楊舜銓 高丹丹 臧榮鑫

摘要：以鳳岡綠茶為原料，探討并確定沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG提取的最佳工藝條件。在甲醇濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比4個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)，以沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量為指標(biāo)確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，各有效成分的最佳提取工藝條件為：甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時(shí)間40 min，料液比為1 ∶ 30（g/mL）;此工藝條件下得到鳳岡綠茶浸提液中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量分別為（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g，精密度、重復(fù)性和回收率的RSD均小于5%。該結(jié)果可為鳳岡綠茶的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)，也為開(kāi)拓其茶保健產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鳳岡綠茶;提取工藝;正交試驗(yàn);HPLC;沒(méi)食子酸;咖啡因;可可堿;EGC;EGCG

中圖分類號(hào)： TS272.2;TS201.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）13-0170-06

多酚類物質(zhì)是茶葉中主要的功效成分，包括兒茶素、黃酮醇及其配合物、無(wú)色花青素、酚酸及縮酚酸等[1]，兒茶素類物質(zhì)占茶多酚總量的60%～80%，主要包括兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）等單體物質(zhì)，具有抗氧化、抗突變、抗癌[2]、抗衰老、降血脂、抑菌和抑制病毒等功效[3-4]。沒(méi)食子酸是茶葉中一種重要的酚酸類物質(zhì)，可能與某些茶類的保健功效有密切關(guān)系[5]。生物堿主要包括咖啡因、可可堿和茶堿[6]，這些成分是茶湯重要的滋味物質(zhì)[7-9]，在茶葉的保健功效和分類品鑒上起到重要作用[10]。茶葉中的有效成分是評(píng)價(jià)和控制茶葉質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，可以快速鑒定茶葉品質(zhì)[11]。綜合國(guó)內(nèi)外對(duì)沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、兒茶素等的檢測(cè)方法分析得出[12-14]，高效液相色譜法因其應(yīng)用廣泛、靈敏度高、精確度好且技術(shù)成熟等成為主要的檢測(cè)方法[15-18]。

武陵山片區(qū)生態(tài)條件優(yōu)越，是優(yōu)質(zhì)茶葉的歷史產(chǎn)區(qū)，而且多以春茶采摘為主[19]。貴州省遵義市鳳岡縣茶葉生產(chǎn)已成為當(dāng)?shù)厣絽^(qū)茶農(nóng)的主要收入來(lái)源[20-21]，但茶資源利用率不高，有關(guān)鳳岡綠茶有效成分的提取技術(shù)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道[22]。本研究通過(guò)對(duì)鳳岡綠茶中的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，利用高效液相色譜（HPLC）同時(shí)測(cè)定沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量，為進(jìn)一步研究鳳岡綠茶的保健功效提供理論依據(jù)，同時(shí)為武陵山片區(qū)鳳岡綠茶深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG均為分析純，購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司;甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純，購(gòu)自?shī)W科生物技術(shù)有限公司;鳳岡綠茶，購(gòu)自貴州省鳳岡縣婁山春茶葉專業(yè)合作社;娃哈哈水，購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent Technologies 1200 高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器）、Lichrospher C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），購(gòu)自美國(guó)Agilent公司;HWS28型LCQ電熱恒溫水浴鍋、BWS-0505型恒溫水槽水浴鍋，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Dor Yang DA型電子分析天平，購(gòu)自渡揚(yáng)精密儀器（上海）有限公司;WJX-200型高速多功能粉碎機(jī)，購(gòu)自上海緣沃工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶粉的預(yù)處理 將茶葉在粉碎機(jī)中粉碎后過(guò) 40目篩，稱取一定質(zhì)量的茶粉于50 mL離心管中，加入預(yù)熱過(guò)的浸提溶劑5 mL，立即轉(zhuǎn)入水浴中浸提一定時(shí)間，冷卻至室溫，在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后收集上清液，重復(fù)浸提1次，合并所得上清液。準(zhǔn)確取上清液2 mL于5 mL容量瓶中，稀釋并定容至刻度，過(guò)0.22 μm膜，即為待測(cè)液。

1.3.2 高效液相色譜條件選擇[22-23] 利用高效液相色譜儀對(duì)待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（10 g/L），去離子水定容至1 L;流動(dòng)相 B：800 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA溶液（10 g/L），以去離子水定容至1 L，流動(dòng)相A、B液需過(guò)0.22 μm膜。綜合考慮測(cè)定波長(zhǎng)為278 nm、柱溫35 ℃、流速為1.0 mL/min，進(jìn)液量為10 μL。待流速和柱溫穩(wěn)定，基線跑平后，序列運(yùn)行并作空白對(duì)照，測(cè)試液以峰面積定量。梯度洗脫條件[24]見(jiàn)表1。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將25 mL EDTA溶液（10 g/L）、25 mL抗壞血酸溶液（10 g/L）、50 mL乙腈以去離子水定容至500 mL，制得穩(wěn)定溶液。準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g，以穩(wěn)定溶液溶解于 10 mL 容量瓶并定容至刻度，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為2 mg/mL;分別移取沒(méi)食子酸儲(chǔ)備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6個(gè)10 mL容量瓶中，用穩(wěn)定溶液溶解并定容至刻度，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0、40、80、120、160、200 μg/mL?？Х纫颉⒖煽蓧A、EGC、EGCG標(biāo)準(zhǔn)品溶液配法同上。

1.3.4 提取工藝條件的單因素試驗(yàn) （1）甲醇濃度對(duì)提取工藝的影響。在料液比為1 g ∶ 25 mL，浸提溫度為70 ℃，浸提時(shí)間為30 min，甲醇濃度（甲醇水溶液）分別為0、65%、70%、75%、80%、85%的條件下，利用HPLC檢測(cè)沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。（2）浸提溫度對(duì)提取工藝的影響。在料液比為1 g ∶ 25 mL，浸提時(shí)間為 30 min，甲醇濃度為70%，浸提溫度分別為55、60、65、70、75 ℃ 的條件下，利用HPLC檢測(cè)沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。（3）浸提時(shí)間對(duì)提取工藝的影響。在料液比為1 g ∶ 25 mL，甲醇濃度為70%，浸提溫度為70 ℃，浸提時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min的條件下，利用HPLC檢測(cè)沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。（4）料液比對(duì)提取工藝的影響。在甲醇濃度為70%，浸提溫度為70 ℃，浸提時(shí)間為40 min，料液比分別為1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35（g ∶ mL）的條件下，利用HPLC檢測(cè)沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析確定正交試驗(yàn)條件范圍，選取甲醇濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比作為工藝優(yōu)化的響應(yīng)值，工藝優(yōu)化試驗(yàn)選取甲醇濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）水平正交試驗(yàn)，分析各因素對(duì)沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG浸出量的影響，以期獲得沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG浸出量均高的組合，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.3.6 方法學(xué)考察 取1份待測(cè)茶樣，按上述提取工藝優(yōu)化條件操作，HPLC連續(xù)測(cè)定5次，評(píng)價(jià)方法的精密度;取同一批6份鳳岡綠茶茶粉，按照上述提取工藝優(yōu)化條件處理，進(jìn)行重復(fù)性考察，評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性;在已知各組分濃度的茶粉中加入不同濃度相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，評(píng)價(jià)方法的回收率。精密度、重復(fù)性及回收率均用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)衡量。

RSD=s/x×100%。

式中：s表示標(biāo)準(zhǔn)偏差;x表示平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2016軟件，制圖采用Oiginpro 8.0軟件。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值作為最終的測(cè)量值（SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)之間的顯著性差異）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在既定的高效液相色譜條件下，各標(biāo)準(zhǔn)溶液，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG相應(yīng)的峰面積值（y）與濃度（x）的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。可知，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的濃度與對(duì)應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均在0. 999以上。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 甲醇濃度對(duì)提取工藝的影響 由圖1可知，隨著甲醇濃度的增加，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量曲線先緩慢上升后趨于平緩，其中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC的增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)于EGCG較為平緩。當(dāng)甲醇濃度為0，即選擇純水做浸提溶劑時(shí)，雖然能檢測(cè)到各組分的浸出量，但是檢測(cè)量都比較低;當(dāng)甲醇濃度為70%時(shí)，EGC、EGCG含量達(dá)到最大值，這與國(guó)標(biāo)法GB/T 8318—2008《食品添加劑 生姜（精）油（蒸餾）》里提取劑為70%甲醇的條件[24]相一致。繼續(xù)增加甲醇濃度，各組分的浸出量略有下降，EGC的下降程度明顯高于其他物質(zhì)，可見(jiàn)甲醇濃度對(duì)EGC的影響較大。經(jīng)過(guò)綜合考慮單因素結(jié)果，選擇甲醇濃度為70%、75%、80%做正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.2 浸提溫度對(duì)提取工藝的影響 由圖2可知，在一定溫度范圍內(nèi)，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量隨著浸提溫度的升高不斷增加，咖啡因、EGC、EGCG的增長(zhǎng)趨勢(shì)較為明顯;當(dāng)浸提溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，EGCG浸出量達(dá)到最大值，為130.95 mg/g即約占13.10%;在同樣溫度下浸提道泉雅女茶EGCG含量最大為6.04%[25]，可見(jiàn)鳳岡綠茶中EGCG的含量相對(duì)較高;繼續(xù)升高溫度各組分含量增長(zhǎng)較為平緩且咖啡因、EGC、EGCG略微有下降趨勢(shì)。究其原因，茶葉提取工藝過(guò)程其實(shí)是各組分向浸提溶劑擴(kuò)散的過(guò)程，隨著溫度的升高，擴(kuò)散速度逐漸提高，但當(dāng)溫度高于某個(gè)特定值后，EGC、EGCG易發(fā)生氧化作用，測(cè)定值略有降低，繼續(xù)升高溫度對(duì)浸出量的影響不大。經(jīng)過(guò)綜合考慮單因素結(jié)果，選擇浸提溫度65、70、75 ℃做正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)提取工藝的影響 由圖3可知，當(dāng)浸提時(shí)間為10 min時(shí)，各組分浸出量都較低;浸提時(shí)間超過(guò)30 min后，可可堿和沒(méi)食子酸浸出量增加緩慢;當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，咖啡因、EGC、EGCG浸出量達(dá)到最大值，而后EGC、EGCG浸出量均有明顯的下降趨勢(shì)，可能隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)，EGC、EGCG部分發(fā)生氧化作用，測(cè)定值降低。經(jīng)過(guò)綜合考慮單因素結(jié)果，選擇浸提時(shí)間30、40、50 min做正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.4 料液比對(duì)提取工藝的影響 由圖4可知，隨著浸提溶劑的增加，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量先緩慢增加后趨于穩(wěn)定;當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶ 25 mL時(shí)，咖啡因、EGC、EGCG浸出量達(dá)到最大值;繼續(xù)添加浸提溶劑，各組分浸出量變化不大。究其原因，茶粉中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的含量是一定的，當(dāng)料液比到達(dá)一定值后，各組分浸出量已達(dá)到最大值，繼續(xù)添加浸提溶劑，部分EGC與EGCG由于高溫發(fā)生氧化作用而使測(cè)定值偏低[20]。經(jīng)過(guò)綜合考慮單因素結(jié)果，選擇料液比1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 35 mL做正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在L9（34）水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯觯绊戻P岡綠茶中沒(méi)食子酸浸出量的因素主次順序?yàn)锽>D>C>A，即浸提溫度>料液比>浸提時(shí)間>甲醇濃度;最佳浸提組合為A2B3C3D1，即甲醇濃度75%，浸提溫度75 ℃，浸提時(shí)間50 min，料液比 1 g ∶ 25 mL。影響咖啡因浸出量的因素主次順序?yàn)镈>A>C>B，即料液比>甲醇濃度>浸提時(shí)間>浸提溫度;最佳浸提組合為A1B2C2D1，即甲醇濃度70%，浸提溫度70 ℃，浸提時(shí)間40 min，料液比 1 g ∶ 25 mL。影響可可堿浸出量的因素主次順序?yàn)锳>B>C>D，即甲醇濃度>浸提溫度>浸提時(shí)間>料液比;最佳浸提組合為A1B1C3D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時(shí)間50 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。影響EGC浸出量的因素主次順序?yàn)锳>B>C>D，即甲醇濃度>浸提溫度>浸提時(shí)間>料液比;最佳浸提組合為A1B1C2D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時(shí)間40 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。影響EGCG浸出量的因素主次順序?yàn)镃>B>A>D，即浸提時(shí)間>浸提溫度>甲醇濃度>料液比;最佳浸提組合為A1B1C2D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時(shí)間40 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。

將甲醇濃度70%增大到75%，沒(méi)食子酸浸出量增加了0.07 mg/g，可見(jiàn)其影響并不明顯，故選取甲醇濃度為70%;在65、70、75 ℃的浸提溫度梯度內(nèi)，綜合考慮各組分浸出量變化結(jié)果，選取浸提溫度為65 ℃;浸提時(shí)間從40 min延長(zhǎng)至50 min，沒(méi)食子酸和可可堿在浸提溶劑中的含量分別相對(duì)持平，故選取浸提時(shí)間為40 min;單獨(dú)考慮1 g ∶ 25 mL到 1 g ∶ 35 mL料液比的變化，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量變化很小，且可可堿、EGC、EGCG在料液比為1 g ∶ 30 mL時(shí)取得較高浸出量，故最終考慮選取料液比為1 g ∶ 30 mL。綜合考慮選擇浸提的最佳工藝組合為A1B1C2D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時(shí)間 40 min，料液比1 g ∶ 30 mL。

2.4 樣品驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)確定的最優(yōu)浸提條件，即甲醇濃度為70%、浸提溫度為65 ℃、浸提時(shí)間為40 min、料液比為 1 g ∶ 30 mL，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量分別為（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g。在優(yōu)化工藝條件下，鳳岡綠茶中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的綜合提取率相對(duì)較高。張俊英等的研究表明浸提鳳岡鋅硒茶時(shí)甲醇濃度優(yōu)化結(jié)果為70%，這與本研究部分結(jié)果[22]相吻合。

2.5 方法學(xué)考察

由表5可以看出，對(duì)于精密度考察，HPLC檢測(cè)鳳岡綠茶中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.5%、0.4%、0.8%、0.4%、0.5%，符合國(guó)標(biāo)GB 5009.12—2017中規(guī)定的精密度要求[26]。對(duì)于重復(fù)性的考察，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.6%、1.3%、1.6%、1.6%、1.2%，表明此方法有較好的重復(fù)性。對(duì)于回收率的考察，沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.6%、1.5%、1.8%、2.3%、2.3%，表明此方法有較高的準(zhǔn)確性。精密度、重復(fù)性和回收率的RSD均小于5%，表明儀器精密度良好，方法重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確性高[22]。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)鳳岡綠茶中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定鳳岡綠茶中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的最佳浸提工藝參數(shù)：甲醇濃度為70%、浸提溫度為65 ℃、浸提時(shí)間為40 min、料液比為1 g ∶ 30 mL。在此優(yōu)化工藝條件下，HPLC測(cè)得沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量分別為（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g。該結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，相比較鳳岡鋅硒茶[22]，鳳岡綠茶中沒(méi)食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG溶出更徹底。精密度、重復(fù)性和回收率的RSD均小于5%，表示該方法測(cè)定效果良好，結(jié)果準(zhǔn)確有效，可為更全面地反映鳳岡綠茶品質(zhì)提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步研究相關(guān)茶保健品提供理論依據(jù)，對(duì)提高鳳岡綠茶的利用率具有重要意義。

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