鄒芬 何烈干 賴金美 李湘民 黃瑞榮 馬輝剛

摘要：為明確江西省絲瓜果實腐爛病病原菌種類及病原菌寄主范圍，從江西省南昌市和贛州市絲瓜種植區(qū)采集具有典型癥狀的腐爛病病果并進(jìn)行病原菌分離，采用形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定和分子生物學(xué)技術(shù)對其種類進(jìn)行鑒定，并接種7種作物幼苗以明確其寄主范圍。結(jié)果表明，從絲瓜爛果病病樣中共分離到2株菌株，分別命名為SG-1和 SG-2，2株菌株形態(tài)特征一致，菌落呈圓形，氣生菌絲發(fā)達(dá)，有膨大的孢子囊，孢子囊萌發(fā)有泡囊產(chǎn)生，有性生殖還可見雄器和藏卵器。在以ITS、Cox2、β-tubulin3個基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株SG-1、SG-2和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）聚在同一個分支，結(jié)合上述結(jié)果，將此次采集的絲瓜果實腐爛病病原鑒定為瓜果腐霉。將該病原菌接種葫蘆科的黃瓜，茄科的辣椒、茄子，十字花科的白菜、西蘭花，錦葵科的秋葵等代表性作物幼苗，結(jié)果表明其還可以引起幼苗猝倒病。

關(guān)鍵詞：絲瓜果實腐爛病;病原鑒定;瓜果腐霉;寄主范圍;Cox2基因;β-tubulin基因

中圖分類號：S436.429 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0090-05

絲瓜（Luffa cylindrica）隸屬葫蘆科絲瓜屬，主要種植于熱帶和亞熱帶，如中國、泰國、印度、馬來西亞等[1]。絲瓜是我國常見的瓜類蔬菜之一，分為普通絲瓜和有棱絲瓜2個栽培種[2]，營養(yǎng)價值豐富，果肉中不僅富含蛋白質(zhì)、維生素、鈣磷鐵等元素，還具有抗衰老和抗過敏等保健作用和藥用價值[3-4];成熟的絲瓜由于其發(fā)達(dá)的網(wǎng)狀纖維且天然易降解還可替代海綿作為一種環(huán)保的洗刷灶具[5]。絲瓜在江西省多個縣（市、區(qū)）均有種植，據(jù)調(diào)查，絲瓜約占江西省瓜類蔬菜資源總量的18.3%[6]。作者2019年7—8月到田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有部分絲瓜發(fā)生爛果現(xiàn)象，對產(chǎn)量和品質(zhì)造成了較大影響，由于尚不清楚各地區(qū)絲瓜果實腐爛病由何種病原菌引起，因此對病原菌進(jìn)行系統(tǒng)分離鑒定，并明確其寄主范圍，對生產(chǎn)上防治該病害具有重要意義。關(guān)于枯萎病、炭疽病、病毒病、蔓枯病等絲瓜生產(chǎn)上常見病害的病原鑒定已有較多報道。彭家柱等根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和ITS序列分析相結(jié)合的方法將絲瓜枯萎病病原鑒定為尖孢鐮刀菌[7];孫蕾對吉林省絲瓜、黃瓜、西瓜等11種葫蘆科作物炭疽病病原進(jìn)行了鑒定，通過聯(lián)合ITS、CHS1和GAPDH多基因測序分析，確定絲瓜、黃瓜等的病原為圓刺盤孢（Colletotrichum orbiculare），西瓜炭疽病的病原有2種，分別為C. orbiculare和C. incanum，苦瓜炭疽病的病原為C. incanum，表明不同寄主病原不盡相同[8]。牛二波對山西省絲瓜病毒病病原檢測結(jié)果表明，絲瓜受小西葫蘆黃化葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）復(fù)合侵染[9]。目前對絲瓜果實病害病原鑒定的研究較少，對絲瓜果實腐爛病的研究主要見于常規(guī)發(fā)生和防治介紹，尚未發(fā)現(xiàn)對絲瓜果實腐爛病病原菌分子系統(tǒng)學(xué)方面的研究。本研究擬通過對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定，結(jié)合核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ基因（Cox2）和β微管蛋白基因（β-tubulin）部分序列的多核苷酸序列系統(tǒng)學(xué)分析等方法，對引起江西省絲瓜果實腐爛病的病原菌進(jìn)行鑒定，同時對該病原菌進(jìn)行寄主范圍測定，以期為生產(chǎn)上該病害的防治及不同作物的選育種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別于2019年7—8月從江西省南昌市和贛州市采集絲瓜果實腐爛病典型病樣，帶回實驗室進(jìn)行分離。絲瓜、黃瓜、番茄、茄子、白菜、西蘭花、秋葵種子購自當(dāng)?shù)胤N子市場。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。V8培養(yǎng)基：罐裝V8汁330 mL、CaCO3 3.3 g，4層紗布過濾，按體積比1 ∶ 9加入純水進(jìn)行稀釋，如配固體培養(yǎng)基再按1.5%加入瓊脂粉。

TaKaRa Taq，購自寶生物工程（大連）有限公司;DL2000 Marker，購自湖南擎科生物技術(shù)有限公司;PCR回收試劑盒，購自美國Axygen公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

MyCycler PCR儀，購自美國Bio-Rad公司;JC600電泳儀，購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;Alpha 5500型凝膠掃描儀，購自美國Alpha Innotech公司;PGX-330A-3HM 型生化培養(yǎng)箱，購自寧波萊福科技有限公司;IX53顯微鏡，購自奧林巴斯（中國）有限公司。

1.2 病原菌的分離與純化

按常規(guī)組織分離法分離病原菌[10]。用無菌水沖洗具有典型絲瓜果實腐爛病癥狀的病果，于病健交界處切取5 mm×5 mm大小的組織塊，用70%乙醇浸泡消毒30～60 s，隨后用無菌水漂洗3次，置于含50 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL利福平的PDA平板上，置于溫度為25 ℃的生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，待菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)移至新的V8平板上培養(yǎng)，隨后單孢分離純化菌株，并將菌株接種于V8斜面培養(yǎng)基上，置于13 ℃培養(yǎng)箱中保存。

1.3 致病性測定

1.3.1 原寄主致病性測定 按照科赫氏法則，取健康的絲瓜作為接種材料，將絲瓜先用自來水洗凈，再用75%乙醇擦拭表面并晾干。將分離獲得的菌株在V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，直接接種到健康絲瓜果實上，以接種無菌培養(yǎng)基為對照，接種樣品放入托盤中保濕，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。待果實發(fā)病后進(jìn)行病原菌的再分離，方法同上。

1.3.2 對絲瓜及其他寄主致病性測定 除絲瓜外，選取葫蘆科的黃瓜，茄科的番茄、茄子，十字花科的白菜、西蘭花，錦葵科的秋葵為代表作物，將各作物種子催芽后播種在一次性塑料杯中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中16 h/8 h光暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)約10 d后在幼苗莖基部接種病原菌孢子懸浮液（將病原菌在V8培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3 d，切取小塊菌絲塊放入V8液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，用滅菌自來水洗凈菌絲，誘導(dǎo)游動孢子，將游動孢子濃度稀釋為1×105個/mL），接種后保濕培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

將純化后的菌株接種到V8培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后觀察菌絲生長形態(tài)及顏色，并于顯微鏡下觀察泡囊的形態(tài)特征;15 d后在顯微鏡下觀察有性生殖器官形態(tài)，共計測量了50個性器官和泡囊。按照van der Plaats-Niterink等的方法[11-12]對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

選取在V8平板上培養(yǎng)3 d左右的菌株，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅置于V8液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d，收集病原菌菌絲并用液氮冷凍研磨，采用溴化十六烷基三甲銨（CTAB）法提取病原菌DNA。分別使用rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），Cox2基因特異性引物FM66（5′-TAGGATTTCAAGATCCTGC-3′）/FM58（5′-CCACAAATTTCACTACATTGA-3′）及β-tubulin基因特異性引物BT5（5′-GTATCATGTGCACGTACTCGG-3′）/BT6（5′-CAAGAAAGCCTTACGACGGA-3′）[13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積50 μL：10×PCR buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL、上下游引物各 1 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL、Taq酶0.3 μL，ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物送至湖南擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將所得的ITS、Cox2和 β-tubulin 基因序列用NCBI中BlastN程序進(jìn)行同源性比對分析，將序列提交到NCBI/GenBank獲得基因登錄號。下載參比菌株各基因同源性較高的已知序列及鄰近屬種序列，將各基因串聯(lián)成數(shù)據(jù)集，使用ClutalX工具進(jìn)行多重序列比對，將序列編輯、調(diào)整后，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值重復(fù) 1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及致病性測定

從南昌市和贛州市各分離獲得1株菌株，命名為SG-1、SG-2。

2.1.1 對絲瓜果實的致病性測定 將獲得的病原菌回接至健康的絲瓜果實中，恒溫培養(yǎng)約24 h后觀察發(fā)現(xiàn)，絲瓜果實上出現(xiàn)的癥狀與田間發(fā)病癥狀基本相似，在接種部位出現(xiàn)水漬狀褐色斑點，接種表面還有褐色霉層，而對照果實未出現(xiàn)發(fā)病癥狀（圖1-A）。隨機挑取發(fā)病組織進(jìn)行再分離，獲得與原菌株一致的病原菌，根據(jù)科赫氏法則，確定該菌為引起絲瓜果實腐爛病的病原菌。

2.1.2 對絲瓜及其他作物幼苗的致病性測定 選取生長10 d左右的絲瓜、黃瓜、番茄、茄子、白菜、西蘭花、秋葵幼苗作為接種材料，用移液槍吸取游動孢子懸浮液注入幼苗根部，1～2 d后發(fā)現(xiàn)植株開始猝倒，接種部位部分萎縮，同時有水漬狀病斑出現(xiàn)（圖1-B～圖1-H）。

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在V8平板上培養(yǎng)時，菌落生長迅速、呈圓形、菌絲白色、氣生菌絲發(fā)達(dá)。在顯微鏡下觀察，孢子囊呈姜瓣狀或膨大菌絲狀（圖2-A），孢子囊萌發(fā)時頂端可產(chǎn)生泡囊，內(nèi)生游動孢子（圖2-B）。藏卵器球形，直徑19.2～29.1 μm，柄較直，雄器側(cè)生，寬棍棒狀或近檸檬形，大小為（9.8～16.2） μm×（8.3～13.6） μm，卵孢子球形，直徑（16.4～21.9） μm，平滑，不滿器（圖2-C）。上述結(jié)果與文獻(xiàn)中報道的腐霉屬中瓜果腐霉的形態(tài)特征和測量結(jié)果基本一致，初步將絲瓜果實腐爛病病原菌鑒定為瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

以ITS、Cox2和β-tubulin基因通用引物分別擴(kuò)增SG-1、SG-2菌株gDNA，擴(kuò)增SG-1分別得到長度為867、592、683 bp的片段（登錄號分別為MT598010、MT857739、MT857741）;擴(kuò)增SG-2分別得到長度為865、590、682 bp的片段（登錄號分別

為MT598009、MT857740、MT857742），將3個基因序列串聯(lián)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，SG-1、SG-2 與瓜果腐霉均聚在同一分支，進(jìn)化上的距離最近（圖3）。結(jié)合上述病原菌的形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定本次在江西省絲瓜上分離的果實腐爛病病原菌為瓜果腐霉。

3 結(jié)論與討論

腐霉菌是一類重要的作物土傳病害病原菌[14]，腐霉菌的卵孢子可在土壤中長期存活，且該病害傳播蔓延迅速，一旦發(fā)生將難以控制。之前有報道造成絲瓜果實腐爛的病原有腐霉和疫霉等[15]，由于二者引起的病害發(fā)病時間及發(fā)病癥狀均較為相似，生產(chǎn)上容易造成誤判，因此明確致病病原菌至關(guān)重要。過去主要根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對腐霉菌進(jìn)行分類，由于多數(shù)腐霉菌的形態(tài)特征不穩(wěn)定，有些分類特征存在交叉性，且大多數(shù)為異宗配合，這些均限制了腐霉病害診斷的準(zhǔn)確性[16]，趙思峰等分離的120個腐霉菌中有29個分離物因未誘發(fā)出雄器和藏卵器而無法鑒定到種[17]。目前主要采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對病原菌進(jìn)行鑒定。腐霉屬內(nèi)包含多個近緣種，核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列作為特異性的靶標(biāo)被廣泛應(yīng)用于多種病原菌的分子檢測，但是ITS序列并不能完全區(qū)分所有親緣關(guān)系近的種[18]，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及多基因序列分析才能對病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。Martin等利用Cox2基因序列對24種腐霉的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析，指出腐霉的系統(tǒng)發(fā)育與腐霉的孢子囊或菌絲體存在相關(guān)性[19];Belbahri等在對腐霉ITS序列分析的基礎(chǔ)上也分析了EF-1α、β-tubulin和nadh1的基因序列，揭示了這些基因在菌株內(nèi)和不同菌株之間具有高水平的雜合性和多態(tài)性[20]。本研究通過對分離自江西省南昌市和贛州市絲瓜果實腐爛病的病原菌菌落、泡囊、雄器和藏卵器等形態(tài)特征觀察、致病性測定，聯(lián)合ITS、Cox2和β-tubulin多基因序列對絲瓜果實腐爛病病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，明確江西省絲瓜果實腐爛病的病原菌為瓜果腐霉，這是目前國內(nèi)首次對絲瓜果實腐爛病病原進(jìn)行的系統(tǒng)分離鑒定。

瓜果腐霉為我國第一個報道的腐霉種，也是腐霉屬中致病力最強的種之一，可以侵染多種寄主植物[21]。徐作廷等從玉米根部分離的瓜果腐霉能引起玉米苗期莖腐病[22]，de Cara等從哈密瓜苗期分離的瓜果腐霉能引起哈密瓜苗期植株死亡[23]，銀鈴等從菠菜猝倒病苗期分離的瓜果腐霉能引起菠菜幼苗猝倒病和根腐病[24]，Al-Sheikh從小麥種植區(qū)根際分離的瓜果腐霉能引起小麥幼苗猝倒病和根腐病[25]。本研究從絲瓜果實中分離出的瓜果腐霉除了能引起絲瓜果實腐爛和幼苗猝倒外，接種葫蘆科的黃瓜，茄科的番茄、茄子，十字花科的白菜、西蘭花，錦葵科的秋葵等幼苗發(fā)現(xiàn)均能引起植株猝倒。因此生產(chǎn)上防治該病害時，輪作意義不大，而應(yīng)加強農(nóng)田水分管理，注意排水、高壟等，同時選擇抗性品種及生物防治等手段進(jìn)行綜合控制。

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