閔建華，陳世乾，冉強(qiáng)波，石強(qiáng)

（湖北理工學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 黃石 435000）

世界上每年啤酒的產(chǎn)銷量是各種酒類之首，2018年全年我國(guó)啤酒累計(jì)產(chǎn)量達(dá)到3 812.2萬(wàn)千升，是世界主要啤酒生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)之一[1]。啤酒糟作為啤酒釀造中的主要副產(chǎn)物，我國(guó)每年產(chǎn)出含水量在80%左右的啤酒糟約為300萬(wàn)噸。啤酒糟中主要成分為蛋白質(zhì)、膳食纖維、糖類等，如不對(duì)其加以利用而直接丟棄，不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染。

啤酒糟中蛋白質(zhì)含量在15%～25%之間，主要為醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白4種蛋白質(zhì)[2-4]。其中醇溶蛋白占總蛋白40%～60%，不溶于水，具有較好耐熱性、成膜性、膨脹性和抗氧化性，可用于保鮮、防靜電、抗紫外線、隔氧、防潮等方面[5-9]，并且具有一定的抑菌效果。近年來(lái)，啤酒糟除了用于飼料外，還用于發(fā)酵原料和人工栽培基料提供碳源和氮源[2-3]，啤酒糟中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提取及利用也受到越來(lái)越多的關(guān)注[10-15]。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化醇溶蛋白的提取工藝，并對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定分析，為啤酒糟綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒糟：湖北理工學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室自制；無(wú)水乙醇、茚三酮（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DHG-Ш型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AR2140電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D2F-6000真空干燥箱：湖北科學(xué)器材公司；UV-2700紫外分光光度計(jì)：島津中國(guó)公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；121MB型氨基酸自動(dòng)分析儀：BECAMAN公司。

1.2 方法

1.2.1 啤酒糟醇溶蛋白提取

取一定量啤酒糟干粉，過(guò)40目篩，采用超聲輔助法提取啤酒糟醇溶蛋白[16-17]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制作

參考文獻(xiàn)[2，6]，測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液在595 nm處吸光度值，以不同濃度對(duì)應(yīng)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 啤酒糟醇溶蛋白提取率的計(jì)算

采用 65%的乙醇溶液，液料比為 4∶1（mL/g），經(jīng)過(guò)超聲處理20 min，進(jìn)行浸提，在4 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，重復(fù)上述操作3次，合并3次收集的上清液，經(jīng)減壓蒸餾，冷凍干燥后得到粗醇溶蛋白粉，595 nm處測(cè)定吸光度，可得提取醇溶蛋白質(zhì)量，采用下式計(jì)算提取率[9]。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

稱取5.0 g啤酒糟干粉進(jìn)行試驗(yàn)，分別研究不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、液料比對(duì)醇溶蛋白提取率的影響。各因素水平取值分別為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、60%、65%、70%、75%、80%；液料比 1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1（mL/g）；超聲時(shí)間 5、10、20、30、40、50 min。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)方案

采用響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，選用Box-Behken模型對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間等影響因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以醇溶蛋白提取率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。具體因素水平見(jiàn)表1。

表1 醇溶蛋白提取響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface factor level design of gliadin extraction

1.2.6 氨基酸含量的測(cè)定

采用GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》中氨基酸的測(cè)定方法，對(duì)提取的醇溶蛋白采用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸含量的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大麥醇溶蛋白提取率的影響乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇溶蛋白提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇溶蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of alcohol-soluble protein

大麥醇溶蛋白主要為單鏈蛋白，多由非極性氨基酸構(gòu)成，無(wú)亞基結(jié)構(gòu)和肽鏈間二硫鍵，肽與肽之間主要通過(guò)氫鍵和疏水鍵相互作用。因含有較多疏水性殘基導(dǎo)致醇溶蛋白有較高的疏水性，而易溶解于非極性溶劑中[18-20]。由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)提取率逐漸增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到65%時(shí)，醇溶蛋白提取率達(dá)到最大值1.4%，因此本試驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%作為醇溶蛋白提取適宜溶劑濃度。

2.1.2 液料比對(duì)醇溶蛋白提取率的影響

液料比對(duì)醇溶蛋白提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)醇溶蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of the ratio of liquid to solid on the extraction rate of alcohol-soluble protein

由圖2可見(jiàn)，隨著液料比的增加，醇溶蛋白提取率逐漸增大，在液料比為 4∶1（mL/g）時(shí)，醇溶蛋白的提取率達(dá)到最大值1.37%。之后，在液料比繼續(xù)增加的情況下，醇溶蛋白的提取率不再增大，說(shuō)明醇溶蛋白在液料比為4∶1（mL/g）時(shí)已被充分提取，繼續(xù)增加液料比，會(huì)造成溶劑等資源的浪費(fèi)，因此本試驗(yàn)選擇液料比為4∶1（mL/g）作為醇溶蛋白提取適宜液料比。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)醇溶蛋白提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)醇溶蛋白提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)醇溶蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic duration on extraction rate of alcoholsoluble protein

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的增加，醇溶蛋白提取率逐漸增大，超聲波處理可對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)有力的物理作用，隨著超聲波處理的進(jìn)行，使得醇溶蛋白更容易分散到溶劑中被提取出來(lái)。在超聲時(shí)間為30 min時(shí)，醇溶蛋白提取率達(dá)到最大值1.38%，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，醇溶蛋白提取率變化不大。因此本試驗(yàn)選擇超聲波提取時(shí)間為30 min，作為醇溶蛋白提取適宜超聲時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化方案

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用Design-Expert 8.6.0軟件按照Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

續(xù)表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn)

根據(jù)表2，利用Design-Expert 8.6.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此得到提取大麥醇溶蛋白對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=1.45+0.043A-5.687×10-3B+0.028C-2.325×10-3AB+4.475×10-3AC-0.021BC-0.13A2-0.14B2-0.13C2。

對(duì)回歸模型各項(xiàng)方差進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 3 Analysis of variance of each regression model

通過(guò)表3方差分析可以看出，該模式P<0.001，表明二次回歸方程模型極顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，校正決定系數(shù)R2Adj=0.920 9，表明模型實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合良好，失擬項(xiàng)P=0.673 5>0.05，失擬不顯著，試驗(yàn)誤差小，因此可用該模型對(duì)醇溶蛋白提取試驗(yàn)進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。

各因素對(duì)醇溶蛋白提取率的影響都極顯著，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時(shí)間對(duì)大麥醇溶蛋白提取率影響較大；超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間與液料比、液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)都存在交互作用，因此表明各因素對(duì)大麥醇溶蛋白提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.2.3 雙因素交互作用分析

液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用響面圖見(jiàn)圖4。

圖4 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的互交作用Fig.4 Interaction between liquid-solid ratio and ethanol volume fraction

超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5 超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用Fig.5 Interaction between ultrasonic time and ethanol volume fraction

超聲時(shí)間和液料比的交互作用響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。

圖6 超聲時(shí)間和液料比的交互作用Fig.6 Interaction between ultrasonic time and liquid-solid ratio

由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間固定在26 min時(shí)，液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用顯著，在所選范圍內(nèi)有極值；由圖 5 可知，液料比固定為 4∶1（mL/g）時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間交互作用明顯，醇溶蛋白提取率隨著時(shí)間的作用效果延長(zhǎng)而增加，當(dāng)超聲時(shí)間為26 min左右，乙醇體積分?jǐn)?shù)為64%時(shí)，醇溶蛋白提取率最大；由圖6顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，醇溶蛋白提取率受液料比和超聲時(shí)間的影響較大。醇溶蛋白提取率隨著液料比、超聲時(shí)間的增加而變大，當(dāng)液料比為4∶1（mL/g），超聲時(shí)間為 26 min 左右時(shí)，醇溶蛋白提取率最大，為1.35%左右

2.2.4 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證

采用Design-Expert 8.6.0軟件，分析得到的最佳工藝提取條件是：超聲時(shí)間26.66 min，液料比4.45∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)63.26%。在此條件下大麥醇溶蛋白提取率為1.45613%?？紤]到實(shí)際操作條件，確定最佳提取條件為超聲時(shí)間27 min，液料比為4.5∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)為64%。經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，醇溶蛋白的提取率為1.4%，與理論值相差不大。

2.3 氨基酸成分分析

啤酒糟醇溶蛋白氨基酸組成見(jiàn)表4。87.7%，必需氨基酸含量在20.52%，非必需氨基酸含量為67.18%。含量最高氨基酸為谷氨酸，含量達(dá)到40.221%，其次為脯氨酸，含量為12.991%，而作為糧食作物的第一限制性氨基酸賴氨酸含量為0.889%，含量較低。

表4 啤酒糟醇溶蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of gliadin

啤酒糟醇溶蛋白氨基酸評(píng)分見(jiàn)表5。

表5 啤酒糟醇溶蛋白氨基酸評(píng)分Table 5 Score of gliadin amino acids

由表5可知，根據(jù)世界衛(wèi)生組織建議，以雞蛋蛋白質(zhì)所含氨基酸比例為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分為100分，對(duì)啤酒糟醇溶蛋白氨基酸進(jìn)行評(píng)分，得分為46.7分，低于常見(jiàn)大豆蛋白氨基酸得分74分。結(jié)合表4結(jié)果，啤酒糟醇溶蛋白中必需氨基酸含量占總氨基酸含量23.4%，必需氨基酸含量占非必需氨基酸含量的30.5%，而聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織建議，理想蛋白質(zhì)以上兩項(xiàng)占比分別要大于36%和60%[20]，說(shuō)明啤酒糟醇溶蛋白氨基酸比例不理想，沒(méi)有達(dá)到理想蛋白質(zhì)氨基酸比例要求，限制了啤酒糟在食品營(yíng)養(yǎng)方面的應(yīng)用。但是，啤酒糟醇溶蛋白含較多疏水性氨基酸，蛋白質(zhì)之間主要通過(guò)氫鍵和疏水鍵相互作用，使蛋白質(zhì)分子間具有一定的水不溶性及延伸性，可通過(guò)一定技術(shù)手段制成天然高分子膜在食品保鮮等方面得到很好的應(yīng)用[5，21-25]。

3 結(jié)論

在單因素分析基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)大麥醇溶蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，并進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出最佳提取工藝：超聲時(shí)間 27 min，液料比 4.5∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)64%，此時(shí)最大醇溶蛋白提取率為1.4%。通過(guò)該法提取啤酒糟中醇溶蛋白，技術(shù)手段簡(jiǎn)單，提取效率較高，可為啤酒糟的工業(yè)化綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。通過(guò)對(duì)啤酒糟醇溶蛋白氨基酸含量及比例進(jìn)行分析，得出啤酒糟醇溶蛋白在食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面不是一種良好蛋白質(zhì)來(lái)源，但是因其特殊的氨基酸組成，使其具有柔軟、可食，黏稠及高彈性，可在食品保鮮、包裝及制藥等領(lǐng)域得到很好的應(yīng)用。