蔣振華，李勝容，王賢英

（重慶市中藥研究院，重慶400065）

桑葉為?？浦参锷orus albaL.的葉，味甘、苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)，可除寒熱、出汗，治勞熱咳嗽、明目長發(fā)，用于治療風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭昏頭痛、目赤昏花[1]。桑葉含有蘆丁、槲皮素、異槲皮苷、黃芪苷、茵芋苷等黃酮類成分[2]。桑葉中的總黃酮對糖尿病大鼠小腸的雙糖酶、體外蛋白糖基化及低密度脂蛋白氧化都具有抑制作用[3－5]，具有降血壓、抑制血糖上升、抗菌、消炎、調(diào)血脂、延緩衰老、抗腫瘤、抗氧化等功效[6－7]。桑葉超微粉由桑葉炮制加工而成，但其中的微生物生長繁殖影響產(chǎn)品質(zhì)量，甚至部分有害微生物通過口服進(jìn)入人體會影響患者的健康和生命安全。因此，對桑葉超微粉的滅菌方法進(jìn)行研究及控制其微生物限度是必然要求[8]。傳統(tǒng)的滅菌方法可能破壞藥物的有效成分，影響療效；或有輻射、有機(jī)溶劑殘留，影響用藥安全；或能耗大、時間長，影響經(jīng)濟(jì)效益。滅菌時必須結(jié)合藥物的化學(xué)成分、性質(zhì)、劑型等綜合考慮，采用有效的滅菌方法，合理運(yùn)用滅菌技術(shù)[9]，既要除去或殺滅微生物，又要保證藥物的質(zhì)量穩(wěn)定性、治療作用及用藥安全。蘆丁是桑葉中黃酮類成分之一，本研究中探討了不同滅菌方法對桑葉超微粉中蘆丁含量的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

YX280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；MS205DU型電子分析天平(精度為十萬分之一)，XPR6UD5型電子分析開平(精度為百萬分之一)，均購自瑞士梅特勒－托利多有限責(zé)任公司；KQ－3200B型超聲波清洗儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；M1－L213C型美的微波爐（美的電器有限公司）；Waters e2965型高效液相色譜儀（美國沃特世儀器有限公司），配有Waters 2489型紫外檢測器；101A－1型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；LCF－G／A－20型壁掛式臭氧消毒機(jī)（河北蘭蒂斯環(huán)?？萍加邢薰荆?；SPX－150BⅢ型需氧菌培養(yǎng)箱，CJ－1S型超凈工作臺，SPX－150BⅢ型霉菌及酵母菌恒溫培養(yǎng)箱，均購于天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，美國Fisher公司，批號為20034）；甲醇（批號為20180901），磷酸（批號為20180701），均為分析純，購于重慶川東化工有限公司；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080－201811，純度為92.2%）；環(huán)氧乙烷；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號為20180201），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為20180402），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號為20180503），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號為20180201），均購于北京三藥科技開發(fā)公司；桑葉超微粉(批號為20190501)，由山東南易辰超微粉碎技術(shù)有限公司制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 滅菌樣品制備

分別用干熱滅菌、濕熱滅菌、輻照滅菌、微波滅菌[10]、臭氧滅菌[11]和環(huán)氧乙烷氣體滅菌方法制備桑葉超微粉的滅菌樣品。干熱滅菌：烘箱160～170℃滅菌120 min；濕熱滅菌：高壓蒸氣121℃滅菌20 min；輻照滅菌：60Co射線6 kGy輻照滅菌；微波滅菌法：滅菌功率600 W微波滅菌2～4 min；臭氧滅菌：經(jīng)臭氧發(fā)生器滅菌30 min；環(huán)氧乙烷氣體滅菌：經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌30 min。

2.2 微生物限度檢查

按2020年版《中國藥典（四部）》通則1108中藥飲片微生物限度檢查法進(jìn)行試驗。樣品經(jīng)不同方法滅菌，分別將原粉定為1號，干熱滅菌定為2號，濕熱滅菌定為3號，60Co輻照滅菌定為4號，微波滅菌定為5號，臭氧滅菌定為6號，環(huán)氧乙烷滅菌定為7號。微生物限度檢查方法為平皿法，結(jié)果各滅菌樣品均達(dá)到預(yù)期滅菌效果。詳見表1。

表1 不同滅菌方法桑葉超微粉的微生物限度檢查結(jié)果Tab.1 Results of microbial limit test of ultra－fine powder of Folium Mori with different sterilization methods

2.3 蘆丁含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：ThermoHypersilODSC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）－0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫程序見表2；流速：1.0 mL／min；檢測波長：358 nm；柱溫：25℃；檢測器：紫外檢測器；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

表2 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Gradient elution procedure of mobile phase（%）

圖1 高效液相色譜圖1.rutinA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.3.2 溶液制備

取蘆丁對照品0.0250g，精密稱定，置100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，配制成質(zhì)量濃度為0.25mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別取1－7號樣品1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾渣用甲醇50 mL同法提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜濾過（0.45 μm），即得供試品溶液1－7。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取0.20，0.40，1.00，2.00，4.00 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為5，10，25，50，100 μg／mL的系列對照品溶液。按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg／mL）、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝18 450X－3 339.4，R2＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在5～100 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取對照品溶液（質(zhì)量濃度為10 μg／mL），按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定6次。結(jié)果的RSD為1.81%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.3.2項下供試品溶液1，分別于室溫下放置0，4，8，12，24，36 h時各進(jìn)樣10 μL測定。結(jié)果峰面積的RSD為1.08%（n＝6），表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取1號樣品1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，共6份，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣10 μL測定峰面積，并計算蘆丁含量。結(jié)果蘆丁的平均含量為0.15%，RSD為1.56%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的1號樣品1 g，精密稱定，共9份，分成3組，分別精密加入蘆丁對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.25 mg／mL）3.0，6.0，9.0 mL，依法制備供試品溶液。按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算回收率。結(jié)果蘆丁的平均回收率為98.12%，RSD為1.43%（n＝9）。

2.3.4 樣品含量測定

分別取對照品溶液和供試品溶液1－7各10 μL，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算蘆丁含量。結(jié)果見表3。

3 討論

由表1可知，6種滅菌條件的微生物限度檢查結(jié)果均符合藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但濕熱滅菌的外觀及色澤較差，其他滅菌方法的效果較好。由表3可知，蘆丁在濕熱滅菌下?lián)p失較大，其他5種滅菌方法對蘆丁含量影響不明顯?？紤]到干熱滅菌時間較長，輻照滅菌、臭氧滅菌及環(huán)氧乙烷滅菌存在殘留問題，微波滅菌法因其滅菌時間短，熱轉(zhuǎn)化效率高，節(jié)約能源，符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，并可實(shí)現(xiàn)自動控制及連續(xù)化生產(chǎn)[12－13]。故選擇微波滅菌。

表3 不同滅菌方法桑葉超微粉中蘆丁含量測定結(jié)果（%）Tab.3 Content determination of rutin from ultra－fine powder of Folium Mori with different sterilization methods（%）

本試驗中對未滅菌及6種滅菌方法[14－19]的樣品進(jìn)行了含量測定，結(jié)果顯示，不同滅菌方法對桑葉超微粉的質(zhì)量影響較大。因此，在生產(chǎn)過程中，應(yīng)對直接服用的中藥飲片桑葉超微粉滅菌方法的選擇進(jìn)行考察。以蘆丁為指標(biāo)性成分進(jìn)行考察，方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可作為桑葉超微粉中蘆丁的含量測定方法，同時為制訂中藥飲片桑葉超微粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

試驗結(jié)果表明，桑葉超微粉濕熱滅菌法對桑葉超微粉蘆丁含量影響較大，其他方法影響較小，而蘆丁是主要藥用成分之一，含量太低不能保證桑葉超微粉的質(zhì)量，故不能選濕熱滅菌方法滅菌；且60Co輻照滅菌存在輻照殘留問題[20－24]，還有待進(jìn)一步研究。微波滅菌時對物料內(nèi)外同時進(jìn)行加熱，內(nèi)部溫度高，熱傳導(dǎo)是由內(nèi)向外的，升溫均勻且加熱迅速，時間較短。