錢海燕，曹 楊

（南京中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院·江蘇省第二中醫(yī)院，江蘇 南京210017）

清氣解毒合劑為江蘇省第二中醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局重點?？品尾？茖W科帶頭人王燦暉教授結(jié)合溫病理論指導自擬的臨床經(jīng)驗方，由醋柴胡、蒲公英、金銀花、蟬蛻、連翹、板藍根、忍冬藤、鴨趾草、半枝蓮組方。方中，醋柴胡、蟬蛻透邪泄熱、達邪外泄，半枝蓮、蒲公英、金銀花、連翹、板藍根、忍冬藤清熱解毒，各種藥材配伍，清中有透而不滯，雖不以發(fā)汗為目的，但服藥后有汗出而解的效果。清氣解毒合劑具有透邪泄熱、清氣解毒功效，臨床主要用于治療病毒感染所致高熱不退，對風熱流感所產(chǎn)生的內(nèi)毒素具有解毒清熱功效，且起效時間快，可迅速緩解臨床癥狀。方中主藥柴胡味辛、苦，性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，疏肝解郁，和解表里，升陽舉陷，退熱截瘧，主治感冒發(fā)熱、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛、寒熱往來。其指標性成分為柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，具有抗炎[1]、中樞神經(jīng)抑制[2]、鎮(zhèn)痛[3]、鎮(zhèn)咳[4]、抗菌、抗病毒作用[5]，以及對幽門結(jié)扎型、應激型、醋酸型、組織胺型潰瘍也有較好防治效果[6]。劉得華[7]的動物實驗從細胞水平反映了清氣解毒合劑對流感病毒內(nèi)毒素拮抗的影響，表明其解熱效果良好。黃寶駒等[8]證實清氣解毒合劑與奧司他韋膠囊治療風熱感冒（流感病毒性感冒）效果類似，都具有解毒清熱功效，且起效更快，臨床癥狀緩解更迅速。本研究中優(yōu)化了我院院內(nèi)制劑清氣解毒合劑濃煎劑的制備工藝?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

雙波長掃描高液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，包括全自動在線脫氣系統(tǒng)，SIL－20A型全自動進樣系統(tǒng)，SPD－20A型紫外檢測器，CTD－20AC型自動溫控柱溫箱；KH－500E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為800 W，頻率為40 kHz）；DK－98－ⅡA電熱恒溫水浴鍋，98－1－C型數(shù)字控溫電熱套，均購于天津市泰斯特儀器有限公司；ML104／02型電子分析天平（精度為萬分之一），XSR105型電子分析天平（精度為十萬分之一），PL602－L型臺秤，均購于瑞士Mettler Toledo公司；調(diào)溫電熱器（南通市通州申通電熱器廠）；R－1010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FLBP－250型萬能高速粉碎機（上海菲力博食品機械有限公司）；YJX40－g型微壓循環(huán)中藥煎藥機（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責任公司，功率為3 000 W）；R20型蒸汽夾層鍋(山東博興縣國龍廚房設(shè)備廠)。

1.2 試藥

柴胡皂苷a對照品（批號為110777－201309，純度為91.1%）；連翹苷對照品（批號為110821－200508，純度為98.0%）；連翹酯苷A對照品（批號為111810－201707，純度為97.3%），均購于中國食品藥品檢定研究院；半枝蓮（批號為1905137），醋北柴胡（批號為1901010），蒲公英（批號為1922053），金銀花（批號為1903133），蟬 蛻（批 號 為1901071），連 翹（批 號 為2001006），板藍根（批號為2002018），忍冬藤（批號為1912015），鴨跖草（批號為1903273），均購于州市中藥飲片廠，由本院楊燕主管中藥師鑒定為正品；水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 煎煮液制備

稱取半枝蓮20 g，醋北柴胡10 g，蒲公英15 g，金銀花10 g，蟬蛻10 g，連翹20 g，板藍根20 g，忍冬藤30 g，鴨跖草30 g，倒入中藥煎藥機中浸泡、煎煮，大火燒開，保持微沸，開始計時，結(jié)束后過濾，濾渣加入中藥煎藥機再按上述方法提取1次，合并提取藥液，再將藥渣充分壓榨，壓榨出的藥汁并入上述藥液，置中轉(zhuǎn)容器放置沉淀后經(jīng)200目過濾篩濾過，將上述藥汁置蒸汽夾層鍋中加熱至沸，改用文火，不斷攪拌，濃縮至80～120 mL，于4℃存放備用。

2.2 含量測定

2.2.1 柴胡皂苷a

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：色譜柱為YMCPack ODS－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)－水(B)溶液，梯度洗脫(程序見表1)；流速為1.0 mL／min；檢測波長為210 nm；進樣量為20 μL；柱溫為25℃。理論板數(shù)按柴胡皂苷a峰計應不低于10 000。在此色譜條件下，供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應保留時間處有相同色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 柴胡皂苷a高效液相色譜圖A.Reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solutionFig.1 HPLC chromatograms of saikosaponin a

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of mobile phase（%）

溶液制備：取柴胡皂苷a對照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，即得質(zhì)量濃度為0.4 mg／mL的對照品溶液。精密量取清氣解毒方水煎液5 mL，置25 mL具塞錐形瓶中，精密加入含5%濃氨試液的甲醇溶液20 mL，30℃水溫超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）30 min，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，合并洗液與濾液，回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇3 mL溶解，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得柴胡皂苷a供試品溶液[9－10]。取除柴胡、連翹外的其余藥材，按1／2處方量稱取，加12倍量水回流1.5 h，提取2次，過濾，按柴胡皂苷a供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.2.2 連翹苷

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：色譜柱為YMCPack ODS－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈－水（25∶75，V／V）溶液；流速為1.0 mL／min；檢測波長為277 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。理論板數(shù)按連翹苷峰計應不低于3 000。在此色譜條件下，供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應保留時間處有相同色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

圖2 連翹苷高效液相色譜圖A.Reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solutionFig.2 HPLC chromatograms of forsythin

溶液制備：取連翹苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇適量使其溶解，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL的對照品溶液。精密量取清氣解毒方水煎液5mL，置25mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，混勻，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）25 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)取濾液（稀釋3倍），用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得連翹苷供試品溶液。取除柴胡、連翹之外的其余藥材，按1／2處方量稱取，加12倍量水回流1.5 h，提取2次，過濾，按連翹苷供試品溶液方法制備，即得陰性對照藥材溶液。

2.2.3 連翹酯苷A

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：色譜柱為YMCPack ODS－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈－0.4%冰醋酸溶液（15∶85，V／V）；流速為1.0mL／min；檢測波長為330 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。理論板數(shù)按連翹酯苷A峰計應不低于5 000。在此色譜條件下，供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應保留時間處有相同色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖3。

圖3 連翹酯苷A高效液相色譜圖A.Reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solutionFig.3 HPLC chromatograms of forsythiaside A

溶液制備：取連翹酯苷A對照品適量，精密稱定，加50%甲醇適量使溶解，即得質(zhì)量濃度為0.2mg／mL的對照品溶液。精密量取清氣解毒方水煎液5mL，置25mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，混勻，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）25 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液（稀釋3倍），用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得連翹酯苷A供試品溶液。取除柴胡、連翹外的其余藥材，按1／2處方量稱取，加12倍量水回流1.5 h，提取2次，過濾，按連翹酯苷A供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.3 正交試驗

根據(jù)前期預試驗的單因素考察結(jié)果，以清氣解毒合劑濃煎劑浸出物含量和柴胡皂苷a、連翹苷、連翹酯苷A 3種活性成分為指標，其中3種活性成分權(quán)重系數(shù)分別為20，浸出物含量權(quán)重系數(shù)為40，計算綜合評分。綜合評分＝浸出物含量／浸出物含量Max×40＋連翹苷含量／連翹苷含量Max×20＋柴胡皂苷a含量／柴胡皂苷a含量Max×20＋連翹酯苷A含量／連翹酯苷A含量Max×20。通過L9（34）正交試驗對清氣解毒合劑濃煎劑提取工藝進行優(yōu)選，因素和水平見表2。試驗結(jié)果使用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，結(jié)果見表3和表4。由表4可知，各因素影響作用順序為煎煮次數(shù)（C）＞煎煮時間（B）＞加水量（A）。方差分析結(jié)果表明，煎煮次數(shù)對有效成分的含量和浸出物得率有影響。綜合有效成分含量、浸出物得率的方差分析結(jié)果，經(jīng)直觀分析，最終確定最優(yōu)工藝條件為A2B2C3，即加12倍量水，煎煮3次，每次2 h。

表2 L9（34）正交試驗因素水平表Tab.2 Factor levels of the L9（34）orthogonal test

表4 正交試驗方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the ANOVA of the orthogonal test

2.4 干膏得率測定

取表3中1－9號提取液，過濾，濾液濃縮為浸膏，取10 mL置已恒重的蒸發(fā)皿中（質(zhì)量為M1），水浴蒸干溶劑，于105℃烘箱中干燥3 h后取出，移至干燥器中，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，在相同條件下繼續(xù)干燥1 h，冷卻，稱定質(zhì)量，直至連續(xù)2次的質(zhì)量差不超過5 mg為止，記錄此時的質(zhì)量（M2），計算干膏得率。

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果Tab.3 Results of the L9（34）orthogonal test

得率（%）＝[（M2－M1）×（總濃縮液量／10mL）／原藥材質(zhì)量]×100%

2.5 最佳提取工藝驗證試驗

根據(jù)試驗結(jié)果優(yōu)選出來的最優(yōu)工藝參數(shù)，按原來清氣解毒合劑濃煎劑制備處方量的5倍，平行稱取3份，按A2B2C3最優(yōu)清氣解毒合劑制備工藝進行驗證試驗，具體制備方法同前面，結(jié)果見表5。驗證結(jié)果表明，正交試驗設(shè)計的最佳提取工藝適合清氣解毒合劑濃煎劑制備生產(chǎn)實踐，方法具有可操作性。

表5 清氣解毒合劑濃煎劑優(yōu)選工藝驗證試驗結(jié)果Tab.5 Validation of optimal extraction process of concentrated decoction of Qingqi Jiedu Mixture

3 討論

選擇干膏得率及柴胡皂苷a、連翹苷、連翹酯苷A含量為清氣解毒合劑濃煎劑的評價指標[11]，柴胡皂苷a為清氣解毒合劑方中君藥柴胡[12－14]的特征指標為產(chǎn)品的控制指標，同時選取臣藥連翹中的連翹苷和連翹酯苷A為工藝優(yōu)化指標，可間接標志連翹藥材的優(yōu)劣[15－16]。

清氣解毒合劑濃煎劑為我院院內(nèi)制劑的臨床經(jīng)驗方。原設(shè)計了四因素的正交試驗，即加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)和浸泡時間。預試驗中，發(fā)現(xiàn)加水量越多、煎煮時間越長、煎煮次數(shù)越多、浸泡時間越長，提出物越多。但煎煮時間過長，某些活性物質(zhì)可能會因為長時間高溫煎煮而變性失活；煎煮次數(shù)和加水量越多，后期提取出的物質(zhì)可能就越少，會造成不必要的浪費。考慮到工廠大生產(chǎn)的特點，以及實際生產(chǎn)所用時間和資源成本，故選擇煎煮時間、煎煮次數(shù)和浸泡時間3個因素進行考察。由于長時間的提取，某些藥物中的有效成分是否會造成破壞而影響藥物療效、是否要進行更多的臨床試驗來確定所做的提取工藝對藥效有影響等，還需更多試驗研究來驗證。

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