趙德慶，于平，喬飛

（中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所／農業(yè)部華南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點開放實驗室，海南 儋州 571737）

海南粗榧（Cephalotaxus hainanensisLi.）為三尖杉科（Cephalotaxaceae）三尖杉屬孑遺植物，主產中國海南省，是三尖杉屬分布最南的種，屬于我國特有的珍稀藥用植物［1，2］。其含有三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿和脫氧三尖杉酯堿等具有抗癌活性的三尖杉酯類生物堿成分，其中高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿已成為治療白血病的臨床藥物［3］。但海南粗榧生長緩慢，對生長環(huán)境要求較高［4－7］，加之過度采伐，目前存量稀少，1987年已被列為國家二級重點保護瀕危植物。

自然界中微生物與植物存在密切關系，植物內生菌（endophyte）是指在其生活史中的某一段時期生活在健康植物組織內部但不引起植物組織明顯侵染及癥狀改變的一類菌，包括真菌、細菌、卵菌和放線菌［8］。已有研究表明內生菌普遍存在于植物體中［9］，且有可能產生與宿主植物相同或具有相似生理活性的代謝產物［10，11］，因此內生菌作為一類應用前景廣闊的資源微生物受到越來越多的關注［12］。

近年來，藥用植物內生菌的研究主要集中在活性次生代謝產物上，對真菌的分離主要是通過體外培養(yǎng)法純化得到。然而有研究表明，即使用多種不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)內生真菌，也無法保證所有生活在植物組織的內生菌全部被分離出來，這是因為有的內生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長，無法通過人工培養(yǎng)分離到需要的菌株［13］，而一些與植物自身產生相同活性物質的菌株往往是那些不可離體培養(yǎng)的菌，因此，利用高通量測序技術研究藥用植物內生菌群落結構逐漸受到重視。該技術可全面分析植物組織中的菌類，并可通過考察其群落結構多樣性及其與周圍環(huán)境微生物的關系，深入了解藥用植物內生菌的來源，有助于進一步豐富人類對藥用植物內生菌資源的認識［14］。

本研究采用高通量測序技術對粗榧樹皮和葉片中細菌16SrRNA基因及真菌rDNA ITS基因序列進行提取并測序，結合生物信息學對粗榧樹皮和葉片中微生物多樣性進行分析，為粗榧內生菌資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 2019年10月于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品質資源研究所儋州基地（北緯19°50′，東經109°51′）采集的兩年實生海南粗榧樹皮和葉片樣品。

1.1.2 儀器與設備 孚夏超凈工作臺SWCJ－1G（中國浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司），QuantiFluorTM－ST熒光計（美國Promega公司），ABI GeneAmp?9700型PCR儀（北京賽百奧科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理 分別稱取5 g海南粗榧樹皮和葉片樣品，用蒸餾水沖洗干凈，無菌吸水紙吸干水分，置于滅菌的超凈工作臺內。先用75%乙醇30 mL表面消毒3 min，然后用無菌水50 mL沖洗3次，再用0.1%升汞30 mL表面消毒5 min，最后用無菌水50 mL沖洗5次，無菌袋保存，寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.2 內生菌基因提取 海南粗榧樹皮、葉片內生菌總DNA采用D5625－01DNA Kit試劑盒（Omega Biotek Inc.）提取，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用ABI GeneAmp?9700型PCR儀，用TransGen AP221－02高保真DNA聚合酶對細菌16SrRNA基因的V3－V4區(qū)進行PCR擴增，引物為338F（5′－ACTCCTACGGGAGGCAGCAG－3′）、806R（5′－GGACTACHVGGGTWTCTAAT－3′）。真菌rDNA ITS區(qū)域采用引物ITS 1F（5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′）、2043R（5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′）進行擴增，每個樣本3個重復。將同一樣本的PCR產物混合后經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris－HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測完畢后將PCR產物用QuantiFluorTM－ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.2.3 Miseq文庫構建及測序 利用PCR擴增進行文庫模板的富集；以氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段，完成Miseq文庫的構建；構建好的文庫經定量和檢測合格后使用Illumina MiSeq進行上機測序。

1.2.4 生物信息學分析 將測得的原始數(shù)據(jù)拼接、過濾、校正后得到優(yōu)化序列。然后在去除嵌合體序列后按照97%相似性對非重復序列進行OTUs（operational taxonomic units）聚類分析?；贠TUs聚類結果，通過Alpha多樣性指數(shù)Chao1和Shannon［15，16］、Venn圖［17］、群落Heatmap圖［18］等分析對樣品中物種進行注釋與評估，以得到樣品內物種組成成分、多樣性、群落分布結構、豐富度和均勻度等信息。

2 結果與分析

2.1 海南粗榧樹皮和葉片內生菌群落多樣性和豐富度分析

通過單樣品的Alpha多樣性分析，可用一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)反映環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。由圖1可以看出，在測序樣本數(shù)達到15 000條以上時稀釋性曲線趨向平穩(wěn)，表明測序數(shù)據(jù)量合理時，Alpha多樣性分析結果能夠代表物種的豐富度。其中，ACE和Chao1指數(shù)在生態(tài)學中用來估計物種總數(shù)，Simpson和Shannon指數(shù)用來描述生物的多樣性。

圖1 海南粗榧樹皮和葉片內生菌OTUs稀釋性曲線

由表1可知，海南粗榧樹皮和葉片樣本文庫的覆蓋率均大于97%，能較好地反映樣本真實情況。樹皮中細菌的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均低于葉片，而真菌的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均高于葉片，表明海南粗榧樹皮中細菌的豐富度低于葉片，真菌的豐富度則比葉片的高。樹皮中細菌的Shannon指數(shù)低于葉片，Simpson指數(shù)高于葉片，而真菌的兩指數(shù)與之相反，表明樹皮的細菌群落多樣性程度比葉片低，真菌群落多樣性程度比葉片高。綜合分析，海南粗榧樹皮中內生菌群落分布與葉片中有所不同，樹皮中真菌群落豐富度及多樣性均高于葉片，細菌群落豐富度及多樣性均低于葉片。

表1 海南粗榧樹皮和葉片內生菌群落豐富度和多樣性分析

2.2 海南粗榧樹皮和葉片內生菌群落相關性分析

Venn圖用于統(tǒng)計多個樣本中所共有和獨有的OTU數(shù)目，可直觀地表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目組成相關性及重疊情況。由圖2可知，從海南粗榧樹皮和葉片中檢測到的細菌共有OTUs為135個，特有OTUs分別為31個和49個，分別占樹皮和葉片細菌總OTUs的18.67%、26.63%；真菌共有OTUs 44個，特有的分別為235個和124個，分別占樹皮和葉片真菌總OTUs的84.23%、73.81%。

圖2 海南粗榧樹皮和葉片內生菌OTUs的Venn圖

2.3 海南粗榧樹皮和葉片內生菌群落結構分析

2.3.1 門水平群落結構分析 從圖3可以看出，海南粗榧樹皮和葉片中內生細菌群落在門水平上主要為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其在樹皮中的相對豐度分別為44.91%、32.96%、11.98%、6.00%、3.58%，在葉片中的相對豐度分別為55.41%、29.45%、4.37%、4.52%、5.06%。其中，變形菌門（Proteobacteria）為樹皮和葉片中的優(yōu)勢菌門，其次是厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）。

圖3 海南粗榧樹皮和葉片內生菌門水平上的組成與相對豐度

海南粗榧樹皮和葉片中內生真菌主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）及未鑒別的菌門（Fungi_unclassified），其在樹皮中的相對豐度分別為91.36%、7.57%、0.72%，在葉片中的相對豐度分別為84.89%、13.01%、1.80%。其中，子囊菌門（Ascomycota）為海南粗榧樹皮和葉片中的優(yōu)勢菌門，其次是擔子菌門（Basidiomycota）。

上述結果表明，海南粗榧樹皮和葉片中內生菌群落門水平的種類相差不大。

2.3.2 屬水平群落結構分析 從圖4看，海南粗榧樹皮中細菌群落在屬水平上主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、Cyanobacteria_norank、小單孢菌屬（Micromonospora）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）等，其相對豐度均大于2%，其中，假單胞菌屬（Pseudomonas）相對豐度最高，是樹皮中的優(yōu)勢菌屬，占所有菌屬的15.73%；粗榧葉片中細菌群落在屬水平上主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、Cyanobacteria_norank、不動桿菌屬（Acinetobacter）和Moraxellaceae_uncultured等，相對豐度均大于2%，其中，假單胞菌屬（Pseudomonas）相對豐度最高，占所有菌屬的14.67%，是葉片中的優(yōu)勢菌屬。

圖4 海南粗榧樹皮和葉片內生菌屬水平上的組成與相對豐度

粗榧樹皮內生真菌群落屬水平上主要為杯梗孢屬（Cyphellophora）、Ascomycota_unclassified、Nectriaceae_unclassified、Capnodiales_unclassified、帚枝霉屬（Sarocladium）、Incertae_sedis_unclassified、德福里斯孢屬（Devriesia）、Musicillium、Chaetothyriales_unclassified等，相對豐度均大于2%，其中，杯梗孢屬相對豐度最高，是樹皮中的優(yōu)勢菌屬，占所有菌屬的27.06%；粗榧葉片中真菌群落在屬水平上主要為Mycosphaerellaceae_unclassified、Sordariomycetes_unclassified、赤霉菌屬（Gibberella）、Incertae_sedis_unclassified、鏈格孢屬（Alternaria）、Pleosporales_unclassified、Nectriaceae_unclassified、Ascomycota_unclassified、Capnodiales_unclassified、毛孢子菌屬（Trichosporon）、Hannaella等，其相對豐度均大于2%，其中，Mycosphaerellaceae_unclassified相對豐度最高，占所有菌屬的17.04%，是葉片中的優(yōu)勢菌屬。

上述結果表明海南粗榧樹皮和葉片在細菌群落屬水平上相差不大，但在真菌群落屬水平上存在較大差異。

3 討論與結論

近年來，高通量測序技術已廣泛用于環(huán)境、食品及動植物、微生物群落多樣性的研究［19］。該技術具有成本低、高通量、效率高的優(yōu)勢，且讀取長度較短，不進行全長序列分析，只對一個或幾個高變區(qū)進行測序分析，可以同時完成傳統(tǒng)基因組學研究的測序和注釋以及功能基因組學分析，測序深度更加深入，為從分子水平上準確、全面、高效研究微生物群落結構提供了新的研究手段［20］。通過高通量測序技術測定植物內生菌，不僅能獲得植物中菌群結構的詳細信息，分析植物內部微生態(tài)水平與環(huán)境關系，為篩選優(yōu)質菌種發(fā)酵生產藥物活性成分提供可能，同時還建立了藥材道地性鑒別的新模式［21－23］，逐漸成為藥用植物微生物資源研究熱點。

本研究首次采用高通量測序方法對海南粗榧樹皮和葉片內生菌的群落結構與多樣性進行了分析，結果表明，內生菌在門水平上主要為變形菌門（Proteobacteria）、子囊菌門（Ascomycota），在屬水平上以假單胞菌屬（Pseudomonas）和杯梗孢屬（Cyphellophora）為主。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物內生菌在門水平上差異不大，細菌以變形菌門、厚壁菌門和放線菌門為主，真菌以子囊菌門和擔子菌門為主［24－25］，與本研究結果基本一致，這充分說明植物內生菌在較大分類級別單元中存在相似性。假單胞菌屬（Pseudomonas）是對農業(yè)生產有益的一類菌，不僅對植物病害有一定防治作用，增加植物本身生長素、赤霉素、細胞分裂素等內源激素的分泌，還可固氮、溶磷，促進植物對養(yǎng)分的吸收，進而改善根系構型，促進植物生長［26－28］。其作為海南粗榧內生優(yōu)勢細菌，對海南粗榧生長可能存在一定的促進作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，海南粗榧樹皮和葉片在真菌群落屬水平上存在較大差異，這可能與植物不同組織器官所獲光照及營養(yǎng)積累不同有關。葉片光合作用較強，代謝旺盛，能夠積累大量營養(yǎng)代謝產物，而樹皮代謝差，積累的營養(yǎng)代謝物相對較少。

前人利用傳統(tǒng)的劃線分離純化手段鑒定了海南粗榧的內生菌，結果表明其內生真菌主要為刺盤孢屬（Colletotrichum）、擬莖點霉（Phomopsis）［29］、根霉屬（Rhizopus）和青霉屬（Penicillium），而種植于泰國的海南粗榧內生優(yōu)勢真菌為酵母屬（Saccharomyces）和毛霉屬（Mucor）［30］。傳統(tǒng)方法不僅鑒定工作繁瑣，工作量大，耗時長，且與高通量測序技術得到的結果存在較大差異，這可能與海南粗榧中某些專性寄生菌不能直接體外培養(yǎng)有關；另外，產地是影響海南粗榧內生菌種類多樣性的主要因素。

本研究利用高通量測序技術對海南粗榧樹皮和葉片中的微生物多樣性進行了全面分析，為后續(xù)開展微生物與粗榧細胞組織共培養(yǎng)技術提供了參考，這也是后續(xù)研究將面臨的新挑戰(zhàn)。