鄧兵 晉美旺杰 任增幫 次旦歐珠 達(dá)瓦羅布 楊銳 陳仕毅 鄺良德

摘要：為在基因組水平研究西藏黃牛的遺傳多樣性，并通過選擇信號(hào)分析發(fā)掘重要種質(zhì)特性基因，利用RAD-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序鑒定拉薩黃牛、阿沛甲咂牛、日喀則駝峰牛和樟木黃牛的SNP標(biāo)記，計(jì)算群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化，鑒定基因組受選擇區(qū)域和受選擇基因。結(jié)果表明，共鑒定出1 355 274個(gè)SNP標(biāo)記。阿沛甲咂牛和樟木黃牛遺傳多樣性最為豐富，觀察雜合度分別為0.185 6、0.164 4，核苷酸多樣性分別為0.202 2、0.202 6，拉薩黃牛和日喀則駝峰牛的遺傳多樣性相對(duì)低些。近交系數(shù)最高的為阿沛甲咂牛，而日喀則駝峰牛的近交系數(shù)最低。拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的遺傳分化系數(shù)最高（0.092 7），而樟木黃牛和阿沛甲咂牛之間的遺傳分化系數(shù)最低（-0.001 1）。聚類分析結(jié)果表明，日喀則駝峰牛和阿沛甲咂牛之間的親緣關(guān)系最近，而與樟木黃牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。通過選擇信號(hào)分析，在西藏黃牛群體中檢測(cè)出22個(gè)基因組區(qū)域受到選擇，包含96個(gè)受選擇基因。GO富集分析表明，這些受選擇基因顯著富集在心血管系統(tǒng)發(fā)育、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞間連接、染色質(zhì)結(jié)合等生物學(xué)通路。本研究從基因組水平揭示西藏黃牛的種質(zhì)特性，為進(jìn)一步開展西藏黃牛種質(zhì)資源保護(hù)及利用提供了重要理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：西藏黃牛;遺傳多樣性;簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

中圖分類號(hào)：S823.8+12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2021）16-0153-04

西藏黃牛是西藏的主要地方家畜品種之一，集中分布于西藏農(nóng)區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)和林區(qū)，主要分布在海拔 3 000～4 200 m，且分布數(shù)量隨海拔高度的增加而減少。雅魯藏布江中下游、喜馬拉雅山東段和三江流域下游地區(qū)分布較集中，占全區(qū)黃?？倲?shù)的50%以上。西藏黃牛體型外貌以及生產(chǎn)性能由于分布區(qū)域的不同存在一定差異，經(jīng)過長(zhǎng)期自然選擇形成了拉薩黃牛、阿沛甲咂牛、日喀則駝峰牛、樟木黃牛等4個(gè)主要地方類群。西藏黃牛以產(chǎn)乳為主，乳、肉、役兼用，具有體型小、成熟晚、耐寒、耐粗飼、適應(yīng)高海拔、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國(guó)寶貴的地方畜禽遺傳資源[1-3]。

通過利用微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體DNA標(biāo)記來進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳進(jìn)化分析已經(jīng)在不同品種牛上廣泛開展[4-7]，然而這些DNA標(biāo)記在整個(gè)?；蚪M中的覆蓋范圍是極其微小的，所代表的基因組遺傳變異信息量也是非常有限的。而新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了SNP分子標(biāo)記的高通量檢測(cè)，為從整個(gè)基因組水平上研究牛的遺傳進(jìn)化提供了準(zhǔn)確高效的研究方法[8]。RAD-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序是通過限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行打斷，然后進(jìn)行高通量測(cè)序從而得到大量遺傳多態(tài)性標(biāo)簽序列，該技術(shù)流程簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低，能有效降低基因組測(cè)序復(fù)雜度，目前，已廣泛應(yīng)用在動(dòng)物分子遺傳標(biāo)記開發(fā)、群體遺傳及進(jìn)化學(xué)、高密度遺傳圖譜構(gòu)建等研究中[9-10]。因此，本研究利用RAD-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序?qū)ξ鞑攸S牛4個(gè)類群的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行研究，能為西藏黃牛遺傳保種提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步進(jìn)行品種改良和優(yōu)良新品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

以西藏黃牛的4個(gè)地方類群，即拉薩黃牛（L）、阿沛甲咂牛（J）、日喀則駝峰牛（T）和樟木黃牛（Z）為研究對(duì)象，于2020年7月在西藏拉薩、林芝、日喀則隨機(jī)采集每個(gè)類群30頭成年牛（公母各半）血液樣本，盡量避免個(gè)體間存在親緣關(guān)系，合計(jì)采集120頭成年西藏黃牛血液樣本，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RAD-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序 利用天根血液基因組DNA提取試劑盒（DP318-02）提取樣品基因組DNA，經(jīng)質(zhì)檢合格后，利用Super GBS技術(shù)[1]構(gòu)建pair-end測(cè)序文庫(kù)（300～500 bp），在Illumina PE150平臺(tái)上對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行RAD-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。測(cè)序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.2.2 SNP質(zhì)控 測(cè)序結(jié)果用GATK 和Samtools程序進(jìn)行SNP鑒定，質(zhì)控條件為：Q20>95%，ddRAD depth>60%，SNP Call rate>90%，MAF>0.05。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 利用Pop Gen 軟件進(jìn)行觀察雜合度（Ho）、近交系數(shù)（Fis）和群體遺傳分化系數(shù)（Fst）計(jì)算，利用Treemix軟件進(jìn)行基因流（Nm）計(jì)算，利用PLINK 軟件進(jìn)行連鎖不平衡（LD）分析和選擇信號(hào)檢測(cè)，利用MEGA 軟件UPGMA聚類法進(jìn)行群體聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組SNP標(biāo)記鑒定

經(jīng)過兩步法數(shù)據(jù)質(zhì)控，在西藏黃牛4個(gè)類群中共鑒定出SNP 1 355 274個(gè)，其中，常染色體上鑒定出SNP 1 326 666個(gè)，性染色體上鑒定出SNP 28 588個(gè)，總體上，SNP數(shù)量與染色體長(zhǎng)度呈正相關(guān)。

2.2 西藏黃牛不同類群遺傳多樣性分析

由表2可知，阿沛甲咂牛和樟木黃牛遺傳多樣性最為豐富，觀察雜合度分別為0.185 6、0.164 4，核苷酸多樣性分別為0.202 2、0.202 6，拉薩黃牛和日喀則駝峰牛的遺傳多樣性相對(duì)低些，核苷酸多樣性分別為0.191 6、0.198 5，與LD連鎖不平衡分析結(jié)果（圖1）相一致。近交系數(shù)最高的是阿沛甲咂牛，為0.092 7，日喀則駝峰牛的近交系數(shù)最低，為0.078 2。

2.3 西藏黃牛不同類群遺傳進(jìn)化分析

西藏黃牛不同類群遺傳分化系數(shù)（Fst）和基因流（Nm），由表3可知，拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的遺傳分化系數(shù)最高（0.092 7），而樟木黃牛和阿沛甲咂牛之間的遺傳分化系數(shù)最低（-0.001 1），相對(duì)應(yīng)的，拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的基因流最高（0.021 0），而樟木黃牛和阿沛甲咂牛之間的基因流最低（-0.000 3）。UPGMA 聚類結(jié)果，由圖2可知，日喀則駝峰牛和阿沛甲咂牛之間的親緣關(guān)系最近，而與樟木黃牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 西藏黃牛群體選擇信號(hào)分析

結(jié)合核苷酸多樣性比率（Pi）和遺傳分化系數(shù)（Fst）的選擇信號(hào)分析發(fā)現(xiàn)，22個(gè)基因組區(qū)域受到選擇，共有96個(gè)受選擇基因。由圖3可知，功能分析結(jié)果受選擇基因主要富集在心血管系統(tǒng)發(fā)育（VSIG8、TEK、ADM、HOPX）、炎癥反應(yīng)（CCL24、VSIG8、CCL26）、細(xì)胞間連接（TEK、SLAMF8、KDR）、染色質(zhì)結(jié)合（KLF8、MAK、MCMBP、CCNT2）等生物學(xué)通路。

3 討論

3.1 西藏黃牛群體基因組SNP鑒定和遺傳多樣性

本研究通過簡(jiǎn)化基因組測(cè)序在西藏黃牛4個(gè)地方類群中共鑒定出1 355 274個(gè)SNP位點(diǎn)，主要分布在1～19號(hào)常染色體上，且數(shù)量均在40 000個(gè)以上 說明西藏黃牛群體具有豐富的遺傳多樣性。本試驗(yàn)克服了微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體DNA技術(shù)在基因組上覆蓋度較低的缺點(diǎn)，為從基因組水平進(jìn)行西藏黃牛遺傳進(jìn)化和關(guān)聯(lián)分析奠定了基礎(chǔ)，也為構(gòu)建西藏黃牛SNP芯片提供了必要條件。

在西藏黃牛不同類群中，阿沛甲咂牛遺傳多樣性最豐富，觀察雜合度為0.185 6，核苷酸多樣性為0.202 2。同時(shí)，其近交系數(shù)最高為0.092 7，提示在阿沛甲咂牛的保種和選種過程中應(yīng)嚴(yán)格控制近交系數(shù)的過快增加，維持群體遺傳多樣性的相對(duì)穩(wěn)定。而拉薩黃牛的遺傳多樣性最低，觀察雜合度為0.179 9，核苷酸多樣性為0.191 6。總體來看這與LD連鎖不平衡分析結(jié)果相一致。拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的遺傳分化系數(shù)最高（0.092 7），說明兩者之間存在中等程度的遺傳分化，而拉薩黃牛與樟木黃牛以及阿沛甲咂牛之間的遺傳分化系數(shù)分別為0.008 5、0.010 1，遺傳分化系數(shù)較小。UPGMA聚類分析表明，日喀則駝峰牛和阿沛甲咂牛之間的親緣關(guān)系最近，而與樟木黃牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。總體上，遺傳聚類分析結(jié)果與西藏黃牛4個(gè)地方類群間遺傳分化、基因流以及地理分布相一致。

3.2 西藏黃牛群體選擇信號(hào)

大量研究表明，在動(dòng)物進(jìn)化過程中，無論是先天自然選擇，還是后天人工選擇都會(huì)在動(dòng)物基因組上留下選擇信號(hào)，受到選擇區(qū)域會(huì)產(chǎn)生高度遺傳分化。因此，進(jìn)行選擇信號(hào)分析有助于進(jìn)一步了解基因組遺傳分化對(duì)動(dòng)物表型的影響，發(fā)掘篩選出影響動(dòng)物性狀的重要的功能基因。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用基因組測(cè)序或基因芯片技術(shù)已經(jīng)在豬、羊、雞等畜禽上開展了選擇信號(hào)研究，發(fā)掘出大量種質(zhì)特性基因和經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因[11-14]。針對(duì)牛而言，Zinovieva等利用高密度SNP基因分型芯片對(duì)2個(gè)俄羅斯本地牛品種進(jìn)行選擇信號(hào)研究，檢測(cè)出了新的基因組受選擇區(qū)域和受選擇候選基因[15]。Ben-Jemaa 等利用SNP芯片對(duì)北非牛進(jìn)行基因組選擇信號(hào)研究，確定了36個(gè)受選擇的基因組區(qū)域，篩選到了GH1、ACE、ASIC3、HSPH1等與炎熱相關(guān)的受選擇基因[16]。Mariadassou等利用全基因組測(cè)序?qū)举澟＿M(jìn)行選擇信號(hào)研究，找到了57個(gè)受選擇基因組區(qū)域以及68個(gè)受選擇候選基因，其中包括MSTN、NCKAP5、RUNX2等可能與利木贊牛重要表型性狀相關(guān)的基因[17]。Xia等利用全基因組測(cè)序評(píng)估了中國(guó)郟縣紅?；蚪M多樣性和選擇信號(hào)特征，采用FST方法找到了17個(gè)受選擇基因，這些基因可能與郟縣紅牛的飼料轉(zhuǎn)化率（CCSER1）、肉品質(zhì)性狀（ROK2、PPP1R12A、CYB5R4、EYA3、PHACTR1）、生育能力（RFX4、SRD5A2）和免疫應(yīng)答（SLAFF1、CD84和SLAFF6）密切相關(guān)[18]。呂世杰等通過簡(jiǎn)化基因組測(cè)序?qū)χ袊?guó)南陽牛和安格斯牛進(jìn)行選擇信號(hào)分析，篩選得到33個(gè)受選擇基因組區(qū)域，其中，16個(gè)基因組區(qū)域與生長(zhǎng)性狀相關(guān)QTLs重合，找到了4個(gè)基因（FXR1、ADAR、IGF1和MNF1）與骨生長(zhǎng)、肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)[19]。

在青藏高原上，缺氧是影響動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素，生活在青藏高原上的西藏黃牛具有耐寒、耐粗飼、適應(yīng)高海拔、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)。本試驗(yàn)中，通過選擇信號(hào)分析在西藏黃牛群體中發(fā)現(xiàn)22個(gè)基因組區(qū)域受到選擇，找到了VSIG8、TEK、ADM、HOPX等4個(gè)顯著富集在心血管系統(tǒng)發(fā)育的受選擇基因，而心血管系統(tǒng)發(fā)育與動(dòng)物對(duì)高海拔缺氧環(huán)境的適應(yīng)性密切相關(guān)。因此，這4個(gè)受選擇基因極有可能是西藏黃牛對(duì)高海拔適應(yīng)性的候選基因。其中HOPX基因已被證實(shí)在心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用[20-21]，而ADM基因參與血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)[22]，VSIG8和TEK在心血管系統(tǒng)中的作用尚未證實(shí)，需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因CCL24、VSIG8、CCL26也受到了選擇，CCL24和CCL26是趨化性細(xì)胞因子家族成員，能夠促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)炎癥部位的各種白細(xì)胞的補(bǔ)充、激活及黏附[23]。推測(cè)CCL24、VSIG8、CCL26這3個(gè)基因與西藏黃牛的抗逆性強(qiáng)相關(guān)，因而在進(jìn)化上受到選擇。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序準(zhǔn)確揭示了西藏黃牛4個(gè)類群基因組水平的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化，選擇信號(hào)分析表明，選擇作用主要集中在高海拔適應(yīng)性、抗逆性等方面的塑造。該研究結(jié)果進(jìn)一步為西藏黃牛種質(zhì)資源的保護(hù)及利用提供了重要參考依據(jù)。

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