余曉謙 陳怡

摘要：為了建立左氧氟沙星片微生物限度檢查方法，采用中和法加薄膜過濾法對左氧氟沙星片微生物限度方法學(xué)，

關(guān)鍵詞：左氧氟沙星 微生物限度 中和法 薄膜過濾法

【中圖分類號】R97 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）09-355-02

目前，隨著左氧氟沙星片在市場上運(yùn)用越來越廣泛，但是未見左氧氟沙星片微生物限度方法的文獻(xiàn)報道。根據(jù)中國藥典 2020年版[2]微生物限度相關(guān)規(guī)定，進(jìn)行了左氧氟沙星片微生物限度方法學(xué)驗證。由于左氧氟沙星片為抗生素的一種，是喹諾酮類抗生素，因此選用硫酸鎂中和劑，本品采用2020年版四部《中國藥典》微生物限度計數(shù)法檢查中的中和法+薄膜過濾法。

一、材料

1、儀器與用具：立式壓力蒸汽滅菌器（LDZF-30、LDZM-60KCS-Ⅱ）、凈化工作臺（SW-CJ-1FD）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-250）、生化培養(yǎng)箱（SHP-150）、生化培養(yǎng)箱（SH-250）

2、稀釋劑：硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鎂

3、培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：181119）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號190102：）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號20180122：）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：20180302）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：181211）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：1082781）。

4、實驗用菌種：銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104）、枯草芽孢桿菌（CMCC（B）63501）、金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）、白色念珠菌（CMCC（F）98001）、黑曲霉菌（CMCC（F）98003）、大腸埃希菌（CMCC（B）44102）。

二、方法

1、菌液制備：

①取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24小時的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的新鮮胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液制成菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液;做活菌計數(shù)備用。

②取經(jīng)20℃～25℃培養(yǎng)2～3天的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液制成菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。

③接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面中，經(jīng)20℃～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，用帶有棉花的球形吸管取出菌液至無菌試管內(nèi)，將孢子懸液稀釋制成含孢子數(shù)不大于100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。

2、供試品制備

取本品10g，用0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液加至100ml，充分震蕩，搖勻，制成1：10供試液。靜置片刻，取1：10上清液適量，用0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液稀釋制成1：20和1：100的供試液

三、驗證方法

3.1計數(shù)方法適用性驗證

3.1.1試驗組：分別取1：100的供試品溶液各1ml，加至500ml稀釋劑中混勻，采用薄膜過濾法，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗量為100 ml，在最后一次沖洗液中加入試驗菌。試驗菌共5組，分別是金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，過濾后取出濾膜，菌面朝上，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿中于30～35℃培養(yǎng)，各制備兩個平行皿，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3組培養(yǎng)3天，白色念珠菌、黑曲霉菌2組培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果，計數(shù)。

3.1.2菌液組：分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，測定每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.1.3供試品對照組：取制備好的供試液，用稀釋液代替菌液同試驗組操作，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.1.4陰性對照組：用不含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，進(jìn)行陰性對照組試驗，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.1.5中和劑對照組：用含中和劑的稀釋液分別測定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.2霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證

3.2.1試驗組：取1：20、1：50、1：100的供試品溶液各1ml加至500ml的稀釋液中，搖勻，薄膜過濾，每張膜用稀釋液500ml分次沖洗，在最后一次沖洗液中加入1ml試驗菌， 試驗菌共2組，分別是白色念珠菌、黑曲霉菌，過濾后取出濾膜，菌面朝上，將濾膜貼于相應(yīng)的沙氏葡萄糖瓊脂平皿，于20～25℃培養(yǎng)，分別各制備2個平皿，培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果，計數(shù)。

3.2.2菌液組：分別取白色念珠菌、黑曲霉菌液，測定每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.2.3供試品對照組：取制備好的的供試品溶液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.2.4陰性對照組：用不含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，進(jìn)行陰性對照組試驗，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.2.5中和劑對照組：以含中和劑的稀釋液分別測定白色念珠菌、黑曲霉菌液每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.3控制菌大腸埃希菌檢查適用性驗證

3.3.1方案①

3.3.1.1試驗組：取1：10的供試品溶液適量稀釋成1：20和1：40的供試品溶液，取1：20的供試品溶液20ml和1：40的供試品溶液40ml分別加入500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，在最后一次沖洗液中加入1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，濾干后取濾膜分別加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.1.2中和劑對照組：同試驗組操作，不加任何溶液以0.1mol/L硫酸鎂的%0.9氯化鈉溶液沖洗濾膜10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.1.3陽性對照組：取1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，不加任何供試液，同試驗組操作。

3.3.1.4供試品組：取1：20和1：40的供試品溶液20ml和40ml分別加入500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜分別加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

3.3.2方案②

3.3.2.1試驗組：取1：10的供試品溶液適量稀釋成1：40，再取1：40的供試品溶液40ml加入500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，在最后一次沖洗液中加入1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，濾干后取濾膜和40ml0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液加入400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.2.2中和劑對照組：取0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液40ml薄膜過濾，同試驗組操作，以0.1mol/L硫酸鎂的%0.9氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜和0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液40ml加入400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.2.3陽性對照組：取1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，不加任何供試液，同試驗組操作。

3.3.2.4供試品組：取1：40的供試品溶液40ml加至500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜和0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液40ml加入400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

置于溫度30℃～35℃培養(yǎng)18～24小時后，觀察結(jié)果，結(jié)果見附件三表2和表3。取1ml培養(yǎng)物接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基，于溫度42℃～44℃培養(yǎng)24～48小時，觀察結(jié)果。

3.4.4.2取上述麥康凱液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃～35℃培養(yǎng)18～72小時，觀察結(jié)果。

四結(jié)果

4.1計數(shù)方法適用性驗證

采用中和法+薄膜過濾法，沖洗量為500ml，試驗組菌落數(shù)均值減去供試品對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi);中和劑對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。該方法適用于左氧氟沙星片需氧菌檢查。

采用中和法+薄膜過濾法，沖洗量為500ml，試驗組菌落數(shù)均值減去供試品對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi);中和劑對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。若各試驗菌的回收比值均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證。

采用中和法+薄膜過濾法，沖洗量為1000ml，試驗組：結(jié)果為陽性檢出大腸埃希菌;陽性組：結(jié)果為陽性檢出大腸埃希菌，中和劑對照組：結(jié)果為陰性未檢出大腸埃希菌;供試品組：結(jié)果為陰性未檢出大腸埃希菌。若試驗組檢出試驗菌，則照所用的供試液制備方法及控制菌檢查方法進(jìn)行供試品控制菌檢查方法的驗證。

左氧氟沙星片微生物限度檢查方法適用性試驗驗證過程中，各項目都合格。左氧氟沙星片微生物限度檢查方法適用性試驗驗證方法進(jìn)行。左氧氟沙星片微生物限度檢查方法適用性試驗證過程中，各項目測試進(jìn)行順利，結(jié)果均符合預(yù)期。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐映紅，伍參榮，魏云，吉蘭.鹽酸左氧氟沙星體內(nèi)外抗菌作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，26（9）：983-986.