竇 鵬, 向玉苗, 梁 靚, 劉 震

(南京大學化學化工學院, 生命分析化學國家重點實驗室, 江蘇 南京 210023)

蛋白糖基化是生物體中普遍發(fā)生且重要的生物學過程,其參與多種分子生物學的功能和途徑[1,2],是臨床診斷重要的生物標志物。研究表明,體液中低分子量蛋白質(zhì)(LMWP)和多肽含有豐富的生物學信息,能從中發(fā)現(xiàn)大量的生物標志物[3]。因此,低分子量糖蛋白質(zhì)(LMW-GP)是生物標志物研究的重點。然而,低分子量糖蛋白在生物樣品中豐度很低,糖肽/糖蛋白在質(zhì)譜檢測時容易被其他非糖蛋白抑制,因此需要發(fā)展高效的低糖蛋白分離富集方法。

對于富集低分子量蛋白質(zhì),目前已有的方法包括超濾[4]、尺寸排阻色譜[5,6]、尺寸限制性材料萃取[7,8],基于納米孔道的膜或顆粒的萃取也發(fā)展成一種新的替代方案[9,10]。近期,納米材料在富集低豐度生物標志物方面具有巨大的潛力[11]。目前糖蛋白的分離富集方法主要有凝集素親和色譜法[12-14]、固相肼化學富集方法[15,16]、磁性納米材料硼親和萃取[17-19]、硼親和色譜[20,21]、親水相互作用色譜法[22,23]等。然而,就作者所知,目前還沒有專門用來富集低分子量糖蛋白的方法。

硼親和材料在近年來取得了很大的發(fā)展[19]。特別是,將功能化磁性納米材料(MNPs)作為微萃取探針用于選擇性富集生物樣品的研究越來越受到科研工作者的重視[24-28]。相比于常規(guī)方法,磁性納米材料的優(yōu)勢是比表面積大,萃取容量高,可操控性強,生物兼容性好。同時,硼酸已經(jīng)成為很有前途的特異性富集糖蛋白的親和配體[20,21]。硼酸親和法的原理為:硼酸分子與含順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物在堿性條件下形成五、六元環(huán)脂的復合物結(jié)構(gòu),而在酸性條件下,該復合物發(fā)生水解,從而釋放出靶標分子。和凝集素親和色譜相比,硼親和色譜具有以下的優(yōu)勢:首先,硼親和色譜對糖蛋白具有廣泛的選擇性,不僅可以富集N-糖蛋白,也可以富集O-糖蛋白;其次,硼親和色譜可以通過簡單地改變環(huán)境pH值來控制糖蛋白的捕獲和釋放,最后,硼親和色譜可以通過揮發(fā)性酸性溶液洗脫被萃取的物質(zhì),因此是完全質(zhì)譜兼容的,但專門用于選擇性富集低分子量糖蛋白的硼親和材料目前鮮有報道。

本文報道一種可以選擇性富集低分子量糖蛋白的多功能磁性納米材料。該多功能磁性納米材料有特殊的外部結(jié)構(gòu),它的表面修飾了硼酸功能團高分子網(wǎng)絡鏈,除了具有磁性納米材料的普遍特性外,該納米粒子具有如下3個特性:1)尺寸排阻性能,消除高分子量蛋白質(zhì)和其他物種的干擾;2)特異性萃取低分子量糖蛋白,3)保護萃取到的低分子量的糖蛋白不被酶解和污染。多功能磁性納米材料的結(jié)構(gòu)和尺寸排阻原理如圖1所示。磁性納米材料的表面修飾了聚丙烯酸高分子網(wǎng)絡,纏繞的線性聚合物鏈覆蓋在磁性納米材料的表面,形成了一個尺寸排阻的網(wǎng)絡鏈,使得只有低分子量的分子才能通過。聚丙烯酸(PAA)鏈上的聚丙烯酸的部分羧基上鍵合了苯硼酸配基,因為羧基具有親水性,而苯基硼酸具有一定的疏水性,在水溶液中,高分子鏈上的羧基處于高分子網(wǎng)絡外側(cè)保證表面很好的親水性,而苯硼酸基團相對疏水,處于高分子網(wǎng)絡內(nèi)側(cè),因此只有通過高分子網(wǎng)絡的低分子量分子中的糖蛋白才能被特異性萃取,另外,被捕獲的低分子量的糖蛋白由于處于高分子網(wǎng)絡內(nèi)部,高分子網(wǎng)絡的空間位阻使得低分子量糖蛋白周圍沒有適合酶相互作用的空間,因此起到了保護富集到的低分子量糖蛋白不受酶解的作用。本文對該材料的結(jié)構(gòu)和性能進行了表征和驗證,并考察了PAA鏈的分子量對材料的尺寸排阻效應的影響。

圖1 間氨基苯硼酸嫁接聚丙烯酸鏈修飾的磁性納米顆粒(APBA-PAA-MNPs)的尺寸排阻效應和聚合物鏈的結(jié)構(gòu)示意圖

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑、材料和方法

N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自阿拉丁試劑公司(上海)。牛血清白蛋白(BSA)、辣根過氧化物酶(HRP)和平均分子質(zhì)量為100 kDa、15 kDa、5 kDa、2.1 kDa的PAA購自美國Sigma公司。丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺預混液(C=2.6%)、四甲基乙二胺(TEMED)和溴酚藍購自美國Bio-Rad公司。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)、間氨基苯硼酸(APBA)和平均分子質(zhì)量240 kDa的PAA購自Alfa Aesar公司(天津)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相對分子質(zhì)量標準品購自Promega公司(上海),胰蛋白酶購自Promega(北京)。其他試劑購自南京化學試劑公司,均為分析純。HPR酶解方法參照文獻[29],將50 μg HRP與2 μg胰蛋白酶混合溶于25 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液中,在37 ℃下酶解過夜,產(chǎn)物存放于-20 ℃冰箱中。

材料的形貌表征采用日本JEOL公司的JEM-1010型透射電子顯微鏡,加速電壓100 kV。制樣是將納米材料均勻分散在水中后滴在銅網(wǎng)上,自然風干備用。紅外光譜為美國Thermo Fisher公司的Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀。Zeta電位測定采用英國Malvern公司的Nano Z zeta電位儀,測定時磁性納米材料被分散在純水中。SDS-PAGE采用美國Bio-Rad公司的Mini Protean 3電泳槽,電源型號為Powerpac HV。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍R-250染料(購自美國Bio-Rad公司)進行染色,并用Gel Doc XR documentation凝膠成像系統(tǒng)進行記錄?；|(zhì)輔助激光誘導解離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)在德國Brucker公司的Autoflex質(zhì)譜儀上完成。納流液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(nano-LC-MS)實驗在美國Thermo Fisher公司的納流LC-LTQ-Orbitrap XL系統(tǒng)上完成。毛細管電泳實驗在美國Beckman Coulter公司的P/ACE MDQ毛細管電泳儀上完成。

1.2 功能化磁性納米材料合成

1.2.1氨基功能化磁性納米材料(AMNPs)[30]

將1.0 g六水合三氯化鐵、6.5 g 1,6-己二胺和2.0 g無水碳酸鈉溶于30 mL乙二醇中,裝入帶有四氟乙烯內(nèi)襯的50 mL高壓水熱釜中在198 ℃下反應6 h。制得的氨基功能化磁性納米材料用水和乙醇各清洗3次后在50 ℃下真空烘干備用。

1.2.2多功能磁性納米材料

將500 mg AMNPs分散于50 mL 30 g/L的PAA溶液中,并加入500 mg EDC和1 g NHS。超聲混合均勻,機械攪拌2 h。制得的PAA活化磁性納米材料(PAA-grafted AMNPs)用水和乙醇各清洗3次后在50 ℃下真空烘干備用。取200 mg PAA-grafted AMNPs分散在40 mL 5 g/L間氨基苯硼酸一水合物溶液中,并加入400 mg EDC和800 g NHS。超聲混合均勻,機械攪拌2 h。制得的多功能磁性納米材料(APBA-PAA-MNPs)用水和乙醇各清洗3次后在50 ℃下真空烘干備用。

1.2.3間氨基硼酸功能化磁性納米材料

將400 mg AMNPs分散于40 mL含5%(v/v)戊二醛的100 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.0)中機械攪拌2 h。得到的戊二醛活化的磁性納米材料用100 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液清洗3次后分散于含40 mL 5 g/L間氨基苯硼酸一水合物和1%(質(zhì)量分數(shù))的氰基硼氫化鈉的100 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液中。反應2 h后,收集制得的間氨基硼酸功能化磁性納米材料(APBA-GA-MNPs)用水和乙醇各清洗3次后在50 ℃下真空烘干備用。

1.3 萃取和解吸

SDS-PAGE分析 將HRP和BSA溶解在含500 mmol/L NaCl的50 mmol/L NH4HCO3-NH3·H2O(pH 10)中,每種蛋白質(zhì)各1 g/L。取2 mg MNPs和50 μL上述蛋白質(zhì)溶液,在一個PCR管中混勻,振蕩萃取1 h。隨后將MNPs用外加磁場吸附于管壁,棄去上清液。MNPs用含500 mmol/L NaCl的50 mmol/L NH4HCO3-NH3·H2O(pH 10)和50 mmol/L NH4HCO3-NH3·H2O(pH 10)各清洗3次后分散于25 μL 50 mmol/L醋酸中振蕩解吸1 h。最后將MNPs用外加磁場吸附于管壁,收集解吸后的醋酸溶液準備進一步分析。

毛細管電泳分析 萃取解吸步驟相同,唯一不同的是在萃取用的HRP、BSA混合溶液中加入了1 g/L腺苷。

nano-LC-MS分析 將HRP酶解產(chǎn)物與含1 mol/L NaCl的100 mmol/L NH4HCO3-NH3·H2O(pH 10)等體積混合后取50 μL用于萃取,其他步驟同上。

1.4 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析采用1 mm厚度的凝膠。用于濃縮膠灌制的各種溶液的配比如下:15 mL 30%的丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺預混液(C=2.6%), 6.3 mL 0.5 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液(pH 6.8), 0.25 mL 10% SDS溶液,15 mL超純水,0.125 mL 10%過硫酸銨和0.025 mL四甲基乙二胺(TEMED)。用于分離膠灌制的各種溶液的配比如下:4.0 mL 30%的丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺預混液(C=2.6%), 2.5 mL 1.5 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液(pH 8.8), 0.10 mL 10% SDS溶液,3.35 mL超純水,0.050 mL 10%過硫酸銨和0.005 mL TEMED。制膠時采用10孔的制孔梳。樣品與5×的上樣緩沖液(100 g/L SDS、10 mmol/L二硫蘇糖醇、20%(v/v)甘油、0.2 mol/L Tris-HCl(pH=6.8), 0.5 g/L溴酚藍)按4∶1(v/v)的比例混合,在100 ℃下加熱3 min。等樣品冷卻到室溫后取20 μL加入上樣孔。在電泳過程中,前25 min電壓為100 V,而后將電壓升高到200 V直至溴酚藍條帶運行到凝膠底部。

1.5 毛細管電泳分析

實驗中使用的毛細管為60 cm(有效長度50 cm)×75 μm I.D.×375 μm O.D.,購自河北永年光纖廠。每天實驗開始前,均使用如下條件平衡毛細管:1 mol/L NaOH沖洗20 min,純水沖洗20 min,背景緩沖溶液(BGE)沖洗20 min。每兩次實驗之間,用以下條件平衡毛細管:0.1 mol/L NaOH沖洗2 min,純水沖洗2 min, BGE沖洗2 min。BGE組成為35 mmol/L硼砂緩沖液(pH 10.0)。毛細管溫度控制在25 ℃。進樣方式采用壓力進樣,進樣壓力3.45 kPa(0.5 psi),進樣時間3 s。分離電壓設定在20 kV。檢測器的檢測波長設定為214 nm。

1.6 Nano-LC-MS分析

LC-LTQ-Orbitrap XL液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)配有兩臺四元梯度泵,一個微量自動進樣器和配有納噴源的LTQ-Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜。實驗中我們選用Agilent公司的富集柱(5 mm×0.3 mm,填料為Zorbax 300SB-C18 5 μm)。分析柱為自制的填裝C18毛細管色譜柱,內(nèi)徑75 μm,長度12 cm。制作方法簡述如下:首先在一段石英毛細管(75 μm I.D.)的一端用丁烷火焰燒制拉出一個內(nèi)徑5～10 μm的噴針;隨后采用自制的壓力容器將C18 AQ反向填料勻漿(粒徑5 μm,孔徑12 nm,購自德國Sunchrom公司)裝填到拉制好的毛細管中,裝填壓力約4 MPa,在填料長度達到12 cm時停止裝填。

流動相組成為(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液,(B)0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液。實驗中上樣泵的流動相恒定為98%A,流速60 μL/min。連接質(zhì)譜儀的色譜梯度如下:0～5 min, 2%B; 5～40 min, 2%B～60%B; 40～45 min, 60%B～90%B; 45～55 min, 90%B保持10 min; 55～75 min, 2%B。流動相在進入分析柱之前經(jīng)過三通分流后的流速約為200 nL/min。質(zhì)譜檢測方法設定如下:噴霧電壓設定為1.8 kV,每次掃描時,在Orbitrap中進行一個10萬分辨率的全掃描,同時在LTQ中進行6個數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描。每個全掃描和二級質(zhì)譜掃描均含有一個micro scan。全掃描的質(zhì)荷比(m/z)范圍是400到2 000,二級質(zhì)譜掃描時儀器自動選擇全掃描中豐度最高的6個離子進行碰撞誘導解離碎裂,歸一化碰撞能量設定為35%。Orbitrap的目標離子強度設為2×105,最大采集時間設為500 ms, LTQ的目標離子強度設為3×104,最大采集時間設為100 ms。動態(tài)排除的設定方式如下:重復2次,重復時長30 s,排除時長60 s。

1.7 MALDI-TOF MS分析

MALDI-TOF MS分析在Autoflex MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀上完成。實驗采用正離子模式,激光波長為337 nm,脈沖時間250 ns,加速電壓20 kV。實驗中使用不銹鋼靶,基質(zhì)為α-氰-4-羥基肉桂酸(CHCA)的飽和溶液,溶劑為0.1%(v/v)三氟乙酸-乙腈(70∶30, v/v)。每張譜圖由100次激光發(fā)射產(chǎn)生的數(shù)據(jù)疊加而得。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料表征

我們采用透射電子顯微鏡對合成的APBA-PAA-MNPs納米材料的形貌進行了表征。如圖2a所示,該材料的形貌完好,粒徑均勻,平均直徑為60±15 nm。隨后,我們通過紅外光譜表征了表面的官能團(見圖2b),在3種納米材料的紅外光譜中,在576 cm-1處均有一個很強的吸收峰,對應的是Fe-O鍵的振動峰。同時在2 855 cm-1和2 927 cm-1處的雙峰則對應著-CH2-官能團。對AMNPs,1 623 cm-1和1 048 cm-1處的雙峰則對應了C-NH2的振動峰,說明磁核納米材料確實被-NH2功能化了。對PAA-grafted AMNPs,1 407 cm-1處的峰證實了羧基的存在,1 456 cm-1和1 715 cm-1處的峰則對應著酰胺基團,說明PAA確實是共價地連接到了納米材料表面。對APBA-PAA-MNPs,1 811、1 783和1 590 cm-1處的峰說明材料上有苯環(huán)存在,而1 208 cm-1處的峰則對應-C-N-苯基團,這些都說明材料上已經(jīng)連接了間氨基苯硼酸。

圖2 納米材料的表征

我們測量了Zeta電位的變化。AMNPs的Zeta電位為+2 mV,修飾了240 kDa PAA的MNPs的zeta電位為-25 mV,而修飾了間氨基苯硼酸的MNPs的Zeta電位為-20 mV。Zeta電位由+2 mV變?yōu)?25 mV,說明材料表面被大量PAA覆蓋,而Zeta電位由-25 mV變?yōu)?20 mV,說明只有部分的羧基連接了間氨基苯硼酸。

我們估算了PAA網(wǎng)絡的孔徑和最大萃取容量。MNPs的密度約為5 g/cm3[31],由于前面的電鏡表征顯示其直徑約為60 nm,可以計算出每個納米顆粒的平均質(zhì)量約為4.5×10-15g。差熱分析結(jié)果顯示,PAA鏈在260 ℃時燃燒(見圖2c)。進一步的熱重分析(見圖2d)顯示,PAA鏈燃燒后導致的質(zhì)量損失占總質(zhì)量的2%。這表明,在該PAA鏈修飾的MNPs上的高分子鏈的質(zhì)量約占總質(zhì)量的2%,因此可以計算得到,每個納米顆粒上的高分子鏈總質(zhì)量平均約為1.1×10-17g。此處PAA鏈的平均分子質(zhì)量為240 kDa,則每條PAA鏈的質(zhì)量約為4.0×10-19g,因此每個磁性納米顆粒上大約接有25條PAA(240 kDa)鏈。另外,根據(jù)分子量可以計算出PAA鏈的聚合度約為3 300,而C-C鍵鍵長約為0.15 nm,因此可知每條PAA鏈的平均長度約為990 nm。我們假定PAA鏈可以均勻包裹在磁性納米顆粒上,則由高分子構(gòu)建出來的網(wǎng)絡的孔徑可以估算得到大約為0.9 nm。由此,我們可以預期由PAA網(wǎng)絡覆蓋的MNPs具有尺寸排阻效應。由于在實際情況下高分子鏈是在水溶液環(huán)境中使用的,而且其空間排布上是相對松散的,因此其孔徑可能更大一些。因此,實際的尺寸排阻效應的分子量閥值應以實驗結(jié)果為準。

2.2 多功能磁性納米材料的選擇性和尺寸排阻性能表征

以APBA-GA-MNPs做對照,我們利用SDS-PAGE表征了APBA-PAA-MNPs的尺寸排阻性能。HRP和BSA分別作為糖蛋白和非糖蛋白的代表用于表征。如圖3所示,APBA-GA-MNPs可以選擇性地從HRP和BSA的混合物中萃取HRP,而APBA-PAA-MNPs則對兩種蛋白質(zhì)均不結(jié)合。該結(jié)果表明,由于HRP(分子質(zhì)量44 kDa)的尺寸大于APBA-PAA-MNPs材料表面高分子網(wǎng)絡形成的孔的直徑,因此無法被APBA-PAA-MNPs富集。

圖3 選擇性和尺寸排阻效應的SDS-PAGE表征

為了進一步確證以上結(jié)論,將小分子順式二醇化合物腺苷(分子質(zhì)量267 Da)與HRP和BSA混合后得到的溶液作為樣品,經(jīng)不同的材料萃取后得到的化合物用毛細管電泳進行分析。如圖4所示,APBA-PAA-MNPs材料只能捕獲腺苷,而APBA-GA-MNPs材料則可以同時捕獲腺苷和HRP。由此就可以得出結(jié)論,APBA-PAA-MNPs材料具有硼親和尺寸排阻雙重選擇性。

圖4 選擇性和尺寸排阻效應的毛細管電泳表征

2.3 多功能磁性納米材料的特異性和尺寸排阻性能與PPA鏈長的關(guān)系

為了考察APBA-PAA-MNPs在復雜環(huán)境中對低分子量糖蛋白的富集能力以及尺寸排阻閾值和PAA鏈長的關(guān)系,我們用nano-LC-MS/MS分析了不同鏈長PAA修飾的APBA-PAA-MNPs從HRP酶解產(chǎn)物中富集到的肽段。實驗中通過二級質(zhì)譜中的特征離子和糖基的中性丟失來確定富集到的肽段是否為糖肽[32],通過如下步驟對得到的二級質(zhì)譜圖進行分析:首先確定哪個時間段得到的譜圖中含有m/z為366([Hex1HexNAc1+H]+)、528([Hex2HexNAc1+H]+)、690([Hex3HexNAc1+H]+)和822([Hex2Pent1HexNAc1+H]+)的特征離子,如果譜圖中存在這些離子則認為是糖肽的二級質(zhì)譜;當確定了糖肽的出峰時間窗口之后,將整個時間段內(nèi)的所有全掃描質(zhì)譜圖用Qual Browser功能進行平均,然后用Xtract功能做去卷積,將所有多電荷離子轉(zhuǎn)化為MH+形式,Xtract中S/N設為10。單糖殘基的中性丟失見表1,如果某個肽段的二級質(zhì)譜圖中含有至少一個上述的特征離子,并有一系列規(guī)律的中性丟失則可認為其為糖肽,圖5中以MH+=2 542.15 Da的糖肽為例標明了各個特征離子和中性丟失。

圖5 用于定性糖肽的特征離子的二級質(zhì)譜圖

表1 寡糖中性丟失造成的質(zhì)量減少

由于絕大多數(shù)文獻中報道的HRP酶解產(chǎn)物中糖肽的分子質(zhì)量在1 800到5 000 Da之間[22,23],因此我們首先考察了1 800到5 200 Da這個質(zhì)量范圍。圖6中是不同PAA鏈長修飾的磁性納米材料富集到的所有糖肽的去卷積質(zhì)譜圖。從HRP酶解糖肽中鑒定到了14個非糖肽段和35個糖肽段(見表2),而被APBA-PAA-MNPs富集到的肽段的數(shù)目要明顯小于HRP酶解產(chǎn)物中的肽段數(shù)目。所有被APBA-PAA-MNPs富集到的肽段均為糖肽,非糖肽被全部排除在外,這說明APBA-PAA-MNPs在復雜體系中依然具有很高的選擇性。用平均分子質(zhì)量為5 kDa的PAA修飾的MNPs富集到的糖肽是所有材料中最多的,HRP酶解產(chǎn)物中76%的肽段被該材料富集。而其他4種分子質(zhì)量的PAA修飾的MNPs富集到的肽段數(shù)目均不足HRP酶解產(chǎn)物中糖肽數(shù)目的50%(詳見附表:http://www.chrom-China.com)。由圖6可知,2、5、15、100和240 kDa PAA修飾的MNPs能結(jié)合到的最大糖肽的分子質(zhì)量分別為4 985.19、5 067.08、4 114.70、5 067.08和2 624.16 Da。因此,這些PAA修飾的MNPs的尺寸排阻閾值應比這些分子質(zhì)量略高。

圖6 1800～5200 Da糖肽的去卷積質(zhì)譜圖

表2 HRP酶解糖肽中分子量在1800到5200 Da范圍內(nèi)鑒定到的非糖肽和糖肽

另一方面,不同分子質(zhì)量的PAA修飾的MNPs能夠富集的最大的糖肽片段并不相同。由于有些糖肽段太過接近5 200 Da的上限,我們進一步研究了分子質(zhì)量高于5 200 Da的肽段。通過MALDI-TOF MS實驗發(fā)現(xiàn),所有的APBA-PAA-MNPs均不能富集RNase B(糖蛋白,分子質(zhì)量約為15 kDa)。因此我們進一步研究了nano-LC-MS/MS譜圖中分子質(zhì)量從5 200到15 000 Da的部分。由2、15、100、240 kDa PAA修飾的MNPs均無法富集任何肽段,僅有5 kDa PAA修飾的MNPs富集到了少量肽段,其中分子質(zhì)量最大為9 218.09 Da(見圖7)。經(jīng)過二級質(zhì)譜鑒定,該肽段為糖肽。由于HRP酶解產(chǎn)物中有大于10 kDa的糖肽段,我們認為,2、5、15、100和240 kDa PAA修飾的MNPs的尺寸排阻閾值約為5.0、9.3、4.1、5.1和2.7 kDa。因此,可以得出結(jié)論:可以通過調(diào)節(jié)PAA鏈長來調(diào)節(jié)多功能MNPs的尺寸排阻閾值。

圖7 5200～15000 Da糖肽的去卷積質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本文提出了多功能磁性納米材料的概念并證明了其原理,由于其特殊設計的結(jié)構(gòu),這種磁性納米材料可以成為高選擇性萃取低分子量的糖蛋白的多功能納米探針,盡管研究中主要測試的分子是低分子糖蛋白,但是這種多功能磁性納米材料同樣可以選擇性萃取其他低分子量順式二羥基生物分子,如修飾核苷、多糖等,由于糖蛋白、核苷和聚糖是蛋白質(zhì)組學、代謝組學和糖組學領域關(guān)注的研究焦點。若能進一步采用高親和力配基,這種多功能磁性納米材料可以發(fā)展成為一種很有前途的組學研究樣品處理材料。