郝益 孫銘健 邊策 高原 莊肖肖 王宏蘭

摘要：目的 研究藜豆提取物左旋多巴對(duì)體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞雙向調(diào)節(jié)作用。方法 在體外原代培養(yǎng)小鼠黑色素細(xì)胞后傳代培養(yǎng)，用不同濃度藜豆提取物左旋多巴97.31mg/ml、146.02mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素細(xì)胞，觀察黑色素細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 1. 4代空白組與對(duì)不同濃度對(duì)照組（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比對(duì)小鼠黑色素細(xì)胞的合成并無顯著影響（P>0.05）。5代空白組與不同濃度對(duì)照組（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比顯著促進(jìn)小鼠黑色素細(xì)胞的合成量（P<0.05）。2. 4代黑色素細(xì)胞隨著給藥濃度的增大凋亡率逐漸增加，當(dāng)藥物濃度為146.02mg/mL作用于黑色素細(xì)胞5代時(shí)，發(fā)現(xiàn)藥物具有促進(jìn)黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。當(dāng)藥物濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素細(xì)胞5代時(shí)，發(fā)現(xiàn)藥物具有顯著抑制黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。結(jié)論 1. 適當(dāng)濃度（146.02mg/mL）的藜豆提取物左旋多巴能夠促進(jìn)黑色素細(xì)胞的增殖。2. 濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL藜豆提取物左旋多巴抑制黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：黑色素細(xì)胞;藜豆;左旋多巴;細(xì)胞培養(yǎng)

藜豆（S.capitatum Kuntze）為豆科藜豆屬中以嫩莢及種子供食用的栽培種群，屬一年生纏繞性草本植物，別名虎豆、狗爪豆等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藜豆提取物富含左旋多巴。[1]左旋多巴是黑質(zhì)紋狀體多巴胺以及皮膚細(xì)胞黑色素合成的底物，被廣泛地用于治療人類的帕金森病，而且在離體條件下，還選擇性地抑制人類黑色素瘤（Melanoma）色素細(xì)胞的生長(zhǎng)。[2]

本實(shí)驗(yàn)基于黑色素細(xì)胞培養(yǎng)體系探索藜豆提取物左旋多巴對(duì)于黑色素細(xì)胞的作用，筆者建立了體外藜豆提取物左旋多巴對(duì)于黑色素細(xì)胞作用的藥物模型，采用不同濃度藜豆提取物左旋多巴作用于黑色素細(xì)胞來觀察其對(duì)黑色素生物活性的影響。

1.藜豆對(duì)黑色素細(xì)胞的藥理作用

1.1黑色素細(xì)胞合成過程 酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下生成多巴繼而氧化為多巴醌，多巴醌發(fā)生多聚化反應(yīng)而形成無色的多巴素。在異構(gòu)酶的作用下，多巴素形成真黑色素。【3-4】

1.2藜豆的藥理作用 藜豆的主要成分為左旋多巴，左旋多巴為體內(nèi)合成多巴胺的前體物，經(jīng)血腦屏障進(jìn)入中樞，經(jīng)多巴脫羧酶作用轉(zhuǎn)化多巴胺。[5]此外，藜豆及其變種在治療男性不育癥、降血糖、抗蛇毒等其他方面的藥理作用及其機(jī)制也是研究重點(diǎn)，相關(guān)的氨基酸、生物堿、多酚、蛋白質(zhì)等活性成分正在被逐步揭示。鑒于我國(guó)具有豐富的藥用植物資源，藜豆及其變種對(duì)于上述疾病的藥理作用等方面的深入研究和資源開發(fā)利用仍有待進(jìn)一步重視和加強(qiáng)。[6]

1.3藜豆提取物左旋多巴對(duì)黑色素細(xì)胞的藥理作用 藜豆提取物左旋多巴，最終合成多巴胺，多巴胺在體內(nèi)氧化成多巴醌，多巴醌進(jìn)入真黑素通路形成真黑素。[7]從而通過這一巧妙的方式，無需酪氨酸和多巴的參與形成黑色素。適用于酪氨酸缺乏患者，增強(qiáng)黑色素的形成.[8]

2.實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1主要試劑及儀器 藜豆提取物（植提專家公司）;;胰蛋白酶（索萊寶公司）;DMEM（Hyclone公司）;新生牛血清（四季青公司）;中性蛋白酶（奧博星公司）;F12培養(yǎng)液（biosharp公司）;RPMI1640（biosharp公司）;中性蛋白酶（coolaber公司）;臺(tái)盼藍(lán)染色液（biosharp公司）;倒置顯微鏡（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院提供）。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1藜豆提取物的制備（植提專家公司提供） 將藜豆粉碎為80目細(xì)粉，用30%乙醇 0.1%醋酸水溶液冷浸三次，每次20小時(shí)后過濾，減壓濃縮至豆粉的三倍。薄膜蒸發(fā)濃縮至析出左旋多巴，冷置24小時(shí)，過濾，用冷水洗滌制得粗品。將粗品用24倍量純水，10%活性炭重結(jié)晶，40℃鼓風(fēng)干燥制得藜豆提取物[9]。

2.2.2樣品液的配置 稱取藜豆提取物7.5g，溶于10mL 3%冰醋酸，加30mL 75%乙醇，用200目過濾網(wǎng)過濾再用10mL乙醇清洗過濾網(wǎng)。將濾液用蒸餾水稀釋到500mL，取5mL樣品，再次使用蒸餾水稀釋到500mL。

2.2.3紫外分光光度計(jì)測(cè)定方法及結(jié)果 分別取適量配好樣本液，在紫外波長(zhǎng)280nm的范圍內(nèi)測(cè)量吸光值，并在標(biāo)準(zhǔn)品左旋多巴濃度圖上找出相應(yīng)濃度并計(jì)算含量。測(cè)量的吸光值為0.175，據(jù)計(jì)算測(cè)得藜豆提取物左旋多巴為8.56%。

2.2.3體外給藥細(xì)胞模型的建立 3g藜豆提取物與120mL黑色素培養(yǎng)基攪勻，配為25mg/mL藜豆提取物混合液。在細(xì)胞傳代第三代時(shí)，設(shè)立1、2、3號(hào)板作為空白對(duì)照組（對(duì)應(yīng)標(biāo)為4、5、6號(hào)板），7號(hào)板加入黑色素培養(yǎng)基與0.22微米過濾后的藜豆提取物混合液2：1（97.31mg/mL藜豆提取物混合液），8號(hào)板加入培養(yǎng)基：藥物1：1（146.02mg/mL藜豆提取物混合液），9號(hào)板加入培養(yǎng)基2：3（175.23mg/mL藜豆提取物混合液）。加藥后培養(yǎng)48h，繼續(xù)培養(yǎng)7、8、9代細(xì)胞，觀察黑色素細(xì)胞數(shù)量變化。[10]

3.黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)

3.1黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基的配置 胎牛血清90mL，DMEM/F12培養(yǎng)基450mL，DMEM高糖培養(yǎng)基360mL，雙抗1mL，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2g，加入碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2-7.4，0.22um濾器過濾，分裝成12mL/瓶，做好標(biāo)記，封口，4℃冷藏。

3.2黑色素細(xì)胞原代培養(yǎng) 取4只小鼠頸椎脫位法處死，用肥皂水和11號(hào)手術(shù)刀刀片小心將小鼠背部毛發(fā)刮除，用眼科剪和眼科鑷分別將4只小鼠背部皮膚取下。去除皮下組織，酒精浸泡2min再用含雙抗的PBS液（含青霉素、鏈霉素1mL/L）浸泡10min。用11號(hào)手術(shù)刀刀片將皮切成2-3 mm寬的皮條。放入到0.25%的Dispase I酶中，4℃消化20-24h。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用眼科鑷、眼科剪將皮條的表皮、真皮分離，將分離出來的表皮剪碎，加入0.25%的胰蛋白酶，放入37℃水浴鍋內(nèi)消化10 min。加入等量的終止液終止胰蛋白酶的消化后用吸管吹打混合均勻。分別放入4個(gè)離心管中離心機(jī)1000 rpm離心10 min棄去上清。4支離心管加入DMEM培養(yǎng)基重懸，平均放入4個(gè)6孔培養(yǎng)板中，分別標(biāo)記為原代1板、2板、3板、4板，加入黑色素細(xì)胞專用培養(yǎng)基，封口膜封口放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后換液進(jìn)行傳代。[7]

3.3 黑素細(xì)胞傳代培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)板中細(xì)胞差不多鋪滿培養(yǎng)板時(shí)，吸去培養(yǎng)基。每孔加入1 mL的0.25%胰蛋白酶，蓋好培養(yǎng)板，十字搖晃，放入培養(yǎng)箱中37℃消化8 min、18min、28min，隨時(shí)觀察細(xì)胞消化情況。消化完成后，加入等量的終止液終止消化。用吸管反復(fù)吹打分別放入離心管中，離心機(jī)1000rpm離心10min。棄去上清液，每孔加入2mL的黑色素細(xì)胞專用培養(yǎng)基，重懸后吸取進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照10^5細(xì)胞濃度將每個(gè)板重新接種到2個(gè)新的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，封口膜封口、標(biāo)記，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異具有顯著性。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 小鼠黑色素細(xì)胞傳代后進(jìn)行每一代每號(hào)板mei4孔的觀察。在第二代1號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為432、2號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為597，3號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為658;在第三代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞1號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為264、2號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為674，3號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為271，見表1。于第三代細(xì)胞給予干預(yù)處理，對(duì)照組加入同體積培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組設(shè)立不同藥物濃度梯度（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）。在第四代1號(hào)板（記為4號(hào)板）平均細(xì)胞數(shù)為234、2號(hào)板（記為5號(hào)板）平均細(xì)胞數(shù)為583，3號(hào)板（記為6號(hào)板）平均細(xì)胞數(shù)為264，97.31mg/mL藜豆提取物混合液的7號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為264、146.02mg/mL藜豆提取物混合液8號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為355， 175.23mg/mL藜豆提取物混合液9號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為47;在第五代1號(hào)板（記為4號(hào)板）平均細(xì)胞數(shù)為173、2號(hào)板（記為5號(hào)板）平均細(xì)胞數(shù)為251，3號(hào)板（記為6號(hào)板）平均細(xì)胞數(shù)為112，97.31mg/mL藜豆提取物混合液的7號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為0、146.02mg/mL藜豆提取物混合液8號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為421， 175.23mg/mL藜豆提取物混合液9號(hào)板平均細(xì)胞數(shù)為0，見表2。

在97.31mg/mL，146.02mg/mL，175.23mg/mL不同藥物濃度下，隨著藥物濃度的不斷增大，4代黑色素細(xì)胞凋亡率不斷上升。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第5代時(shí)，低濃度和高濃度藥物作用下，均出現(xiàn)了細(xì)胞損傷，相反，中濃度藥物作用下，黑色素細(xì)胞凋亡率較上一代有所減少，表現(xiàn)出藥物在適宜濃度下對(duì)黑色素細(xì)胞的促進(jìn)作用。

第四代細(xì)胞培養(yǎng)中，空白組配對(duì)低、中、高藥物濃度組均未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。第五代細(xì)胞培養(yǎng)中，空白組配對(duì)低、中、高藥物濃度組均顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。綜合數(shù)據(jù)可知，其中，低、高濃度組藥物（97.31mg/mL、175.23mg/mL），表現(xiàn)出對(duì)黑色素細(xì)胞的抑制作用，而中濃度組藥物（146.02mg/mL）則表現(xiàn)出對(duì)黑色素細(xì)胞的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

5.結(jié)論

4代空白組與對(duì)不同濃度對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)相比均無明顯差異。5代空白組與不同濃度對(duì)照組（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。4代黑色素細(xì)胞隨著給藥濃度的增大凋亡率逐漸增加，當(dāng)藥物濃度為146.02mg/mL作用于黑色素細(xì)胞5代時(shí)，發(fā)現(xiàn)藥物具有促進(jìn)黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。當(dāng)藥物濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素細(xì)胞5代時(shí)，發(fā)現(xiàn)藥物具有顯著抑制黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

6.分析與討論

黑色素是由3，4-二羥苯丙氨酸或酪氨酸經(jīng)過系列反應(yīng)形成，在動(dòng)物體內(nèi)，黑色素是一種存在于皮膚、毛發(fā)的黑褐色的色素，合成并存儲(chǔ)于黑素細(xì)胞中。黑色素能對(duì)抗紫外線，它能夠?qū)⒔^大多數(shù)的紫外線轉(zhuǎn)換為熱量散失，避免紫外線對(duì)深層細(xì)胞造成損傷。因此，皮膚才能夠保持正常的色度。當(dāng)黑色素合成減少，皮膚就會(huì)造成色素缺失，形成白斑，會(huì)產(chǎn)生一些疾病，例如白癜風(fēng)、白化癥等。

各種色素缺失性皮膚病，是以皮膚局部功能性黑素細(xì)胞缺失為主要病理性特征的一類難治性皮膚病，目前尚無滿意的臨床治療方案。在正常生理狀態(tài)下，黑色素和合成與代謝處于動(dòng)態(tài)平衡中。酪氨酸酶與血液中的酪氨酸發(fā)生反應(yīng)，生成黑色素前體物質(zhì)“多巴”，多巴經(jīng)系列氧化還原反應(yīng)可以生成黑色素。本實(shí)驗(yàn)采用藜豆提取物左旋多巴作用于黑素細(xì)胞，探究藥物對(duì)黑色素細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)作用[11]。

本文驗(yàn)證了低、高濃度組藜豆提取物左旋多巴藥物（97.31mg/mL、175.23mg/mL），表現(xiàn)出對(duì)黑色素細(xì)胞的抑制作用，而中濃度組藥物（146.02mg/mL）則表現(xiàn)出對(duì)黑色素細(xì)胞的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。其機(jī)制可能為;第一，藥物促進(jìn)DNA損傷組織中細(xì)胞凋亡，而中等濃度下藥物促進(jìn)未凋亡細(xì)胞快速增殖;第二，藜豆提取物左旋多巴作用于細(xì)胞后，負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制酪氨酸酶活性，只有在中等濃度下對(duì)黑色素細(xì)胞的增殖作用大于酪氨酸酶活性減低影響;第三，藜豆提取物左旋多巴可能參與信號(hào)通路參與或調(diào)控了某一成分對(duì)黑色素合成的抑制作用，而在中等藥物濃度下此作用被翻轉(zhuǎn);其四，需進(jìn)一步明確黑色素其他調(diào)控機(jī)制，如促進(jìn)黑色素分解及代謝，調(diào)控酪氨酸酶翻譯后的修飾，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)黑素小體的攝取和吞噬等，藜豆提取物左旋多巴對(duì)黑色素細(xì)胞的作用可能受到以上幾個(gè)方面的共同作用。[12]

而在臨床上常常使用左旋多巴來治療帕金森患者，有證據(jù)表明這些患者患黑色素瘤的幾率卻大大增加。我們希望可以通過此次實(shí)驗(yàn)探究出藜豆提取物左旋多巴與黑色素細(xì)胞是否有著直接或間接的聯(lián)系，以此來進(jìn)一步探討臨床上是否可以使用這種藥物來影響患者的黑色素細(xì)胞含量。現(xiàn)階段的藜豆及其變種的研究還處于藥效學(xué)驗(yàn)證階段，除了對(duì)黑色素的作用外，藜豆對(duì)防治帕金森、男性不育癥的治療等疾病積極作用仍是有利的。雖然其成分的具體藥理作用還有待進(jìn)一步的研究與發(fā)現(xiàn)，但如果我們能找到既能有效治療帕金森，又能最大程度上減少患黑色素瘤的幾率時(shí)的左旋多巴使用量，那對(duì)臨床上左旋多巴相關(guān)藥物應(yīng)用等方面開辟了更新更廣的前景。

綜上所述，藜豆提取物左旋多巴在適當(dāng)濃度146.02mg/mL能夠促進(jìn)黑色素細(xì)胞的增殖。濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL藜豆提取物左旋多巴抑制黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，藜豆提取物左旋多巴對(duì)黑色素細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)的作用。我們將會(huì)在接下來的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)立更加精確的給藥梯度以更深入地探究藜豆提取物左旋多巴促進(jìn)黑色素細(xì)胞增殖的給藥范圍。同時(shí)，有關(guān)黑色素相關(guān)檢測(cè)的一些實(shí)驗(yàn)學(xué)方法如氫氧化鈉裂解法、比色法定量檢測(cè)、Masson-Fontana氏黑色素染色法等也仍需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充。

此外，關(guān)于藜豆提取物左旋多巴對(duì)小鼠黑色素細(xì)胞的作用機(jī)制尚未探索，希望在之后的實(shí)驗(yàn)中能明確于黑色素細(xì)胞密切相關(guān)酶mRNA、DNA表達(dá)水平，使得藜豆提取物左旋多巴在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣泛。[13]

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大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目《藜豆提取物左旋多巴對(duì)黑色素細(xì)胞的作用》（202011230065）