黃文慧

摘要：斑馬魚經(jīng)常被作為模式生物而廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)研究中，乙醇是一種常用的提取生物活性成分的有機(jī)溶劑。故我們用乙醇和斑馬魚為材料來進(jìn)行自主實(shí)驗(yàn)，在0%、0.5%、1%乙醇濃度的溶液中飼養(yǎng)斑馬魚兩周后，通過對(duì)斑馬魚存活率、均體長(zhǎng)、均體重的變化來探討酒精對(duì)斑馬魚的影響。在飼養(yǎng)期過后通過石蠟切片及其器官顯微照片的觀察探究酒精對(duì)斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)以及發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)探究結(jié)果表明隨著乙醇濃度的升高，其對(duì)斑馬魚心臟的發(fā)育起抑制作用。

關(guān)鍵詞：乙醇;斑馬魚;心臟發(fā)育;毒害作用;石蠟切片;HE染色

斑馬魚（Danio rerio）是一種發(fā)現(xiàn)于印度和巴基斯坦水域的熱帶魚，被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域，近年來正逐漸用于人類疾病模型的構(gòu)建及藥物篩選方面的研究[1]。乙醇是一種有機(jī)物，在常溫、常壓下是一種易燃、易揮發(fā)的無色透明液體。乙醇對(duì)胚胎的致畸作用在許多脊椎動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)[2]，經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎循環(huán)系統(tǒng)及關(guān)鍵基因的活性對(duì)乙醇非常敏感，隨著乙醇濃度的升高，不完整的循環(huán)系統(tǒng)等畸形率也逐漸升高[3]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1）實(shí)驗(yàn)用魚：本實(shí)驗(yàn)用斑馬魚（Barchydanio rerio var）為未成熟的幼魚，均于保定市花鳥魚蟲市場(chǎng)由專人統(tǒng)一購(gòu)入，用在室溫下放置過一段時(shí)間的水（去除氯氣，防止其對(duì)魚產(chǎn)生毒害作用）飼養(yǎng)兩周。

2）實(shí)驗(yàn)試劑：乙醇來自河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，純度為95%，實(shí)驗(yàn)過程中需要用去氯自來水配置乙醇（100% 、95% 、85%、 75%、70%、 50% 、30%）用于斑馬魚的培養(yǎng)、石蠟切塊和HE染色。

2 實(shí)驗(yàn)過程及方法

本組共6人，每?jī)蓚€(gè)人為一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中兩人為一個(gè)對(duì)照組（空白對(duì)照）、0.5%乙醇、1%乙醇，每組做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)燒杯中放8條斑馬魚置于配好的不同濃度的酒精溶液培養(yǎng)。10月10日至10月23日期間為斑馬魚的培養(yǎng)時(shí)間，在此過程中不斷記錄斑馬魚的換水、喂食的時(shí)間及次數(shù)，每周計(jì)算斑馬魚的體長(zhǎng)、體重、存活率至23日，之后進(jìn)行解剖取材、固定、石蠟包埋、切片、HE染色、普通顯微鏡下結(jié)果觀察、顯微攝影。

據(jù)表1分析以及同組人員的實(shí)驗(yàn)對(duì)照探究發(fā)現(xiàn)：1%乙醇組的斑馬魚在短時(shí)間內(nèi)死亡率最高，0.5%乙醇組次之，空白對(duì)照組最末?？赡茉颍?/p>

①乙醇溶液的濃度可能是直接影響因素，由此可見乙醇對(duì)其的毒害作用可能隨濃度升高而增強(qiáng)（待后續(xù)分析）。

②從第一條魚死亡后溶液中可能殘留毒素，其可能會(huì)對(duì)其余存活的魚有毒害作用。

③換水問題。即培養(yǎng)液渾濁程度亦會(huì)影響斑馬魚的生長(zhǎng)。

根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組體重?cái)?shù)據(jù)繪制散點(diǎn)圖并計(jì)算回歸方程如圖1。

據(jù)圖2可知，斑馬魚的平均體重與乙醇濃度呈正相關(guān)，且相關(guān)程度呈線性關(guān)系。斑馬魚的平均存活數(shù)與乙醇濃度近似呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但并未呈現(xiàn)嚴(yán)格的線性關(guān)系?？赏茰y(cè)隨著乙醇濃度的增加，斑馬魚的存活數(shù)下降。原因是乙醇不利于斑馬魚的生長(zhǎng)，甚至有毒害作用。

兩周飼養(yǎng)期結(jié)束，挑選本實(shí)驗(yàn)組（對(duì)照組）長(zhǎng)勢(shì)良好、體型適中的斑馬魚進(jìn)行解剖，將要取材的斑馬魚進(jìn)行冰凍處理，使其活動(dòng)能力下降，將斑馬魚固定在小蠟盤上，用大頭針固定，對(duì)其進(jìn)行解剖，找出斑馬魚的一些器官，放入固定瓶中，接下來進(jìn)行石蠟切片及HE染色，下圖是使用DP71顯微鏡在10倍、20倍和40倍物鏡下進(jìn)行顯微攝影拍攝斑馬魚心臟部位的石蠟切片，以20倍為例。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論與分析

根據(jù)顯微圖片顯示：切下的部分為心臟的肌肉部分，其中占大多數(shù)的是心肌細(xì)胞，并未觀察到明顯的心臟各部腔室的區(qū)分。根據(jù)小組間對(duì)不同乙醇濃度實(shí)驗(yàn)組的心臟切片的顯微觀察，我們觀察到空白對(duì)照組的心臟切片組織分明，可以觀察到分明的心肌細(xì)胞于心臟切片邊緣較為有序排列;對(duì)于0.5%乙醇組的心臟切片我們可以看到心肌組織較為致密。而1%乙醇組的心臟玻片較0.5%乙醇組和空白對(duì)照組的心臟形態(tài)明顯不同，即心臟出現(xiàn)了局部水腫的情況，并且心臟組織的致密性亦不及前兩組。通過平行對(duì)照，我們可以得出的結(jié)論是：

1）乙醇對(duì)于斑馬魚心臟有毒害作用，具體表現(xiàn)在心臟的形態(tài)和結(jié)構(gòu)等方面。

2）隨著乙醇濃度的升高，其對(duì)斑馬魚的毒害作用越明顯。

結(jié)論：

值得反思的是，本文利用乙醇與斑馬魚開展的自主實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇的致畸作用有了初步的認(rèn)識(shí)與進(jìn)展。另外，作為一種維生素A的生物活性形式，視黃酸（RA）可以降低甚至能逆轉(zhuǎn)乙醇在胚胎心臟發(fā)育中的毒性。RA信號(hào)對(duì)心臟發(fā)育起重要作用，可影響心肌細(xì)胞分化、早期心臟前后模式的形成、左右決定、心內(nèi)膜墊的形成及心臟環(huán)化。而斑馬魚是研究脊椎動(dòng)物早期發(fā)育的最重要的模式動(dòng)物之一，利用斑馬魚研究乙醇影響心臟發(fā)育的機(jī)制是可行的。由此可見，本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚得出的乙醇致畸的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是可信的.

參考文獻(xiàn)：

[1]王思鋒，劉可春，韓利文等.溶劑乙醇對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響[A].濟(jì)南：山東科學(xué).2007，20（3）：10-11.

[2]龔春華，李軍，秦玉明等.乙醇對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育中tenascin-c基因表達(dá)的影響[A].南京：實(shí)用兒科臨床雜志.2008，23（1）：55-56.

[3]錢林溪，王躍祥，蔣璆等.乙醇干擾斑馬魚胚胎發(fā)育中底索和背主動(dòng)脈的形成.上海：中國(guó)科學(xué)C輯.2005，35（4）：326-327.

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北保定 071002）