王忠 劉坡 王香梅 鄒松云 趙朱云

【摘要】目的?研究富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）對兔耳增生性瘢痕的影響。方法?選取20只成年新西蘭大耳白兔建立兔耳增生性瘢痕動物模型，待傷口上皮化后，將其同體配對對照實驗。實驗組瘢痕內注射PRP。觀察記錄術后20天和50天 2組兔耳瘢痕的發(fā)生和兔耳瘢痕的大小。結果 對照組兔耳瘢痕的發(fā)生率大于實驗組兔耳瘢痕的發(fā)生率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對照組兔耳瘢痕大于實驗組兔耳瘢痕，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 表明富血小板血漿具有降低兔耳瘢痕發(fā)生的作用;富血小板血漿具有減輕兔耳已發(fā)生瘢痕的作用。

【關鍵詞】富血小板血漿;增生性瘢痕;兔耳瘢痕模型

【中圖分類號】R644 【文獻標識碼】A?【文章編號】2026-5328（2021）03-057-04

增生性瘢痕（hyperplastic scar，HS）通常發(fā)生在外傷，尤其是燒傷和外科手術之后[1]。HS是一種良性的皮膚纖維化病灶，特征是細胞外基質中膠原蛋白過度沉積和成纖維細胞過度增殖。發(fā)生機制是由于細胞凋亡受阻和成纖維細胞生成過多，細胞外基質膠原蛋白合成增加以及各種細胞因子的調節(jié)失調而形成的。邊界清楚，一般在原創(chuàng)面范圍內[2]。由于在生理和心理上不同程度地影響患者，其預防與治療至今仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的臨床問題。

從20世紀70年代富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）應用于醫(yī)學。PRP能夠提供自源性生長因子，能夠促進組織和細胞再生，為再生醫(yī)學的發(fā)展開辟了一條新途徑，在創(chuàng)面修復方面報道較多。近年來的報道PRP在疤痕的預防和治療中有效，尤其面部瘢痕者，措施多為綜合性。PRP對增生性瘢痕直接影響報道較少[3]。

本研究通過檢測PRP注射后兔耳創(chuàng)面HS增生情況，研究PRP對HS形成過程中的直接影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物?實驗選取的新西蘭大白兔均通過了深圳龍華區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準。新西蘭大白兔20只，雌性12只，雄性8只，平均體質量（2.4±0.43）kg，兔耳健全，購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心。大白兔喂養(yǎng)于寬敞的籠內，單籠單兔，并給予食物和水，自由攝取。養(yǎng)兔的房間保持通風。

1.2 方法

1.2.1 兔耳瘢痕動物模型的建立：將20只新西蘭大白兔用30%戊巴比妥鈉做耳緣靜脈麻醉。麻醉成功后，在每只兔做兩個傷口，一個在左側，一個在右側。用消毒后的普通外科手術刀在兔耳中心處無血管的部位，各切一個1 cm×1 cm大小的切口，深至兔耳軟骨，切除皮膚、皮下組織、軟骨表面軟骨膜等，小心搔刮軟骨表面，切好后創(chuàng)口用灼燒后的鐵片進行止血，手術完成[4]。待傷口上皮化后，每只兔雙耳創(chuàng)面隨機納入對照組或實驗組，作同體配對對照實驗。

1.2.2?PRP準備：用裝有復方枸櫞酸鈉抗凝劑的注射器于大白兔耳中央靜脈取新鮮血約4 ml，置入離心管中，使用臺式離心機（80-2臺式電動離心機，中國上海）進行離心。第一個周期需要10分鐘，轉速為2500 rpm，血液分為三層。將上部的兩層轉移到其他一次性無菌管中，以3500 rpm的速度再次離心15分鐘。抽出位于底部的PRP，并以1：4的比例添加10%的氯化鈣使其活化。

1.2.3 實驗組每個創(chuàng)面中心及周緣共6個不同部位給予注射PRP0.2mL，對照組給予0.2mL的生理鹽水。每2周進行一次PRP注射，直至8周[5]。本實驗嚴格遵循《實驗動物保護條例》。

1.3 觀察指標 分別觀察20 d時兔耳瘢痕的發(fā)生情況和50 d時兔耳瘢痕的大小情況。以已愈合的創(chuàng)面高出正常皮膚2 mm為標準。

1.4 統(tǒng)計學方法?采用軟件SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)計量資料用用均數±標準差（）表示，組間比較采用x2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兔耳瘢痕發(fā)生情況?對照組與實驗組均發(fā)生瘢痕增生，見圖1。鏡下見實驗組真皮層增厚，成纖維細胞分散分布，中可見膠原纖維增生;對照組真皮層增厚，膠原纖維增生明顯，形成明顯纖維束，粗大致密，束間空隙較大。瘢痕發(fā)生率對照組大于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表明PRP瘢痕內注射抑制兔耳瘢痕增生（表1）。

2.2?2組兔耳瘢痕增生情況?對照組兔耳瘢痕增生量超過1cm3創(chuàng)面數大于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表明PRP瘢痕內注射可有效抑制兔耳瘢痕增生（表2）。

3討論

實驗室制備PRP一般通過雙離心方案或幾種市售的PRP分離系統(tǒng)。但是，不同實驗室、不同方法生產的PRP細胞組成存在很大差異[6-7]，相關文獻中也常常缺乏對這些生物制劑詳細的描述[8]。由于PRP所含成分的復雜，很難判斷是單次制備的PRP各種成分實際含量[9]。提高的血小板濃度的一個因素是增加離心時間，另一個因素是離心力增加。但是，過高的力可能會由于血小板的早期活化和破裂而導致上清液血漿中生長因子的損失，意味著PRP的治療效率會下降[10-12]。選擇合理的離心機、離心時間對PRP的制備至關重要。目前比較明確的是PRP中生長因子濃度增加了3至5倍有效，更高的濃度并未顯示出有進一步改善的作用[13]。而紅細胞及白細胞含量增加對PRP中因子的釋放發(fā)揮功能有不利影響。由于以上原因，本文采用的制備方案盡可能多地保留血小板，去除紅細胞及白細胞，盡可能保護血小板內部顆粒完整性。采用注射的方法則為了盡可能減少PRP意外流失。

傳統(tǒng)上，兔耳HS模型用于評估針對疤痕形成的各種治療方法[14]。標準兔耳HS模型僅反映瘢痕形成的早期階段組織學及生化變化：密集的肉芽組織血管化，繼而細胞漸減少，炎癥減退，膠原束排列發(fā)生變化，瘢痕逐漸增厚;總蛋白和膠原蛋白由起始時降低到增加，纖維化增加。HS的發(fā)病的分子機制尚未闡明。在此過程中，瘢痕組織非常不穩(wěn)定，反映在膠原蛋白變化上[15]。這也是各種細胞因子、生長因子等調節(jié)細胞行為的基礎。本文選取兔耳制作標準的瘢痕模型，主要也是針對瘢痕形成早期PRP的作用。

PRP的一個特殊之處是血小板α顆粒內含有血管內皮生長因子，表皮生長因子（EGF），血小板衍生生長因子（PDGF），胰島素樣生長因子和轉化生長因子β（TGF-β）等生長因子，以“天然”的生理比例存在，且可以通過不同的途徑激活釋放。這些細胞因子、生長因子等調節(jié)傷口的恢復直至痊愈，如：PDGF對傷口巨噬細胞和成纖維細胞具有強的趨化性，刺激這些細胞表達內源性生長因子;TGF-β直接刺激新的膠原蛋白合成，并在更長的時間內持續(xù)增強[16]。PRP對早期瘢痕形成有抑制作用，推測是在瘢痕形成早期，PRP通過生長因子調節(jié)成纖維細胞增生及分泌膠原蛋白行為達到減輕瘢痕增生，尚需進一步實驗證實。本文對PRP對瘢痕形成過程的影響作了初步探討，檢測各種細胞因子、生長因子的含量與反映膠原蛋白沉積指標如瘢痕指數、酶聯(lián)免疫檢測等及反映細胞增生的指標如增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）定量關系可以進一步闡明細胞因子生長因子調整細胞行為，從而更好地理解瘢痕形成過程。

4結論

富血小板血漿具有降低兔耳瘢痕發(fā)生的作用;富血小板血漿具有減輕兔耳已發(fā)生瘢痕的作用。

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基金項目：深圳市龍華區(qū)2018年科技創(chuàng)新專項資金（2017年第二批醫(yī)療衛(wèi)生項目）資助，（項目編號：2017136）。

作者簡介：王忠，1973.12，男，河北省邢臺市人，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：瘢痕預防與治療。

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