姚銘榕 謝凱玲 張文靜 張文杰 史慶華 劉杰

摘? ? 要：為研究2個(gè)番茄品種WK53、WK54的耐鹽性，采用200 mmol·L-1 NaCl處理幼苗，分別測(cè)定其生長指標(biāo)、可溶性糖、Na+、K+含量，以及抗鹽基因SOS1、SOS2相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，鹽脅迫下，2個(gè)品種番茄展葉數(shù)、株高、莖粗的相對(duì)增長值均受抑制;可溶性糖含量較對(duì)照組分別增加了66.1%、73.7%;而葉片Na+、K+含量卻只有少量提高;抗鹽基因SOS1、SOS2相對(duì)表達(dá)量均受鹽脅迫誘導(dǎo)，尤其是在WK54中，SOS2表達(dá)水平較對(duì)照組上升18倍。綜合分析表明，在幼苗期WK53、WK54均具有一定的耐鹽性，但WK54的耐鹽性更好，SOS2的高表達(dá)可能是WK54更耐鹽的關(guān)鍵因素。

關(guān)鍵詞：番茄;鹽脅迫;生長指標(biāo);耐鹽基因

中圖分類號(hào)：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）08-021-05

Evaluation of salt tolerance of two tomato varieties

YAO Mingrong1，2， XIE Kailing3， ZHANG Wenjing3， ZHANG Wenjie3， SHI Qinghua1， LIU Jie2，3

（1. College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， Shandong， China; 2. Facility Horticulture Laboratory of Universities in Shandong/Weifang University of Science and Technology， Shouguang 262700， Shandong， China; 3. School of Agronomy and Environment， Weifang University of Science and Technology， Shouguang 262700， Shandong， China）

Abstract： In order to study the salt tolerance of two tomato varieties WK53 and WK54， the seedlings were treated with 200 mmol·L-1 NaCl， and their growth indexes， soluble sugar content， Na+ content， K+ content and the expression levels of salt-resistant genes SOS1 and SOS2 were determined. The results showed that the relative increments in leaf number， plant height and stem diameter were inhibited in two varieties under salt stress; the contents of soluble sugar increased by 66.1% and 73.7% than these in control; however， the contents of Na+ and K+ in leaves increased slightly; the expression levels of salt-resistant genes SOS1 and SOS2 were induced under salt stress. Compared with the control， the expression level of SOS2 increased 18 times under 200 mmol·L-1 NaCl treatment in WK54. Comprehensive analysis shows that both WK53 and WK54 are salt-tolerant to a certain extent， but WK54 has a higher salt tolerance at the seedling stage. The high expression of SOS2 may be the key factor for WK54 to be more salt tolerant.

Key words： Tomato; Salt stress; Growth index; Salt tolerance gene

壽光市被譽(yù)為“蔬菜之鄉(xiāng)”“海鹽之都”，位于山東半島中北部，渤海萊州灣西南岸，其北部地區(qū)潛水礦化度高，土層含鹽量大，土壤鹽漬化問題嚴(yán)重，屬于濱海濕潤-半濕潤海侵鹽漬區(qū);而南部地區(qū)雖然有較為良好的土壤條件，但是由于近年來設(shè)施蔬菜發(fā)展迅速，長年集約化經(jīng)營引起土壤酸化與鹽漬化，極大地影響了蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。提高植物耐鹽性，培育和篩選耐鹽蔬菜品種是有效利用鹽漬化土壤的途徑之一。

番茄（Solanum lycopersicon）屬中等耐鹽堿蔬菜作物[3]，其適應(yīng)性強(qiáng)，是世界栽培歷史悠久、栽培地區(qū)廣泛的重要果菜種類，也是我國設(shè)施蔬菜栽培面積和消費(fèi)量最大的蔬菜作物之一。目前，對(duì)于番茄品種耐鹽性的研究大多為單一的生理生化或分子改良方面的研究[2，4-6]，而將其苗期的生理生化與相關(guān)抗鹽基因表達(dá)情況相結(jié)合來評(píng)價(jià)其耐鹽性未見報(bào)道。濰坊科技學(xué)院蔬菜育種組一直致力于高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗設(shè)施番茄選育工作，并陸續(xù)推出了一系列新品種。筆者選取了2個(gè)新品種，以不同濃度NaCl模擬脅迫環(huán)境，通過測(cè)定其幼苗期的各項(xiàng)生理指標(biāo)及抗鹽基因的表達(dá)情況，來綜合確定各品種對(duì)鹽脅迫的耐受度，從而為耐鹽品種的選擇及鹽漬土壤的合理利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄材料為濰科番茄品種WK53、WK54，由濰坊科技學(xué)院番茄育種課題組提供。

1.2 方法

試驗(yàn)于2019年4月進(jìn)行，育苗工作在濰科種業(yè)科技有限公司育苗棚完成，移栽后置于濰坊科技學(xué)院設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)植物培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)。挑選飽滿的種子播種于72孔穴盤中（規(guī)格：口徑40 mm，底徑20 mm，深度50 mm，單個(gè)穴容量40 mL），21 d后待幼苗長至3葉1心時(shí)，選取長勢(shì)一致的健康植株定植于小黑盆中（規(guī)格：上口徑70 mm，下口徑50 mm，深度73 mm），每盆1株。緩苗5 d后，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共2個(gè)處理，每處理15盆，3盆為1個(gè)重復(fù)，共5次重復(fù)。對(duì)照組為清水澆灌;處理組用200 mmol·L-1濃度的NaCl溶液澆灌;每3 d澆灌1次，共處理5次。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 番茄幼苗形態(tài)、生理指標(biāo)測(cè)定 番茄幼苗處理0、15 d后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗，用直尺測(cè)量株高。處理15 d后，摘取其全部葉片稱葉鮮質(zhì)量，80 ℃恒溫箱烘干，稱葉干質(zhì)量，計(jì)算葉片相對(duì)含水量[8]，用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[8]，用火焰分光光度計(jì)測(cè)定Na+、K+含量[9]。

1.3.2 基因表達(dá)情況分析 處理15 d后，剪取新鮮葉片，迅速儲(chǔ)存于液氮中備用。使用諾唯贊RNA提取試劑盒提取總RNA，核酸蛋白分析儀（型號(hào)：Quawell UV Spectrophotometer Q3000）檢測(cè)樣品RNA的濃度及純度，取2 μL RNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。以RNA為模板，參照諾唯贊逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScriptR Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper））的說明合成cDNA，備用。

試驗(yàn)選取SOS1、SOS2抗鹽相關(guān)基因，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)qRCR引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成引物，引物列表見表1。

Real-time PCR步驟：以18S rRNA為內(nèi)參基因，按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒（購自南京諾唯贊生物科技有限公司）操作指導(dǎo)，應(yīng)用Eppendorf realpleax 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增體系包括0.4 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，5 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，3.8 μL ddH2O，總體系為10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線。每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)、計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。采用Excel2010、SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼苗表型分析

由圖1可以看出，在番茄品種WK53、WK54用200 mmol·L-1 NaCl處理15 d后的表型中，對(duì)照組植株長勢(shì)均較好，葉片繁茂;200 mmol·L-1 NaCl處理過的植株矮小，葉片稀疏，且伴隨著黃化枯萎現(xiàn)象。但WK54比WK53長勢(shì)略好，葉片較多，黃化枯萎現(xiàn)象較輕。

2.2 幼苗株高、莖粗及展葉數(shù)

由圖2可以看出，在NaCl處理后15 d，WK53、WK54對(duì)照組的長勢(shì)均明顯優(yōu)于處理組;而且WK54對(duì)照組展葉數(shù)、株高的增長值要高于WK53。但在處理組中，3個(gè)指標(biāo)在2個(gè)品種中差異并不顯著，這表明鹽脅迫對(duì)2個(gè)番茄品種的生長均有不同程度的抑制作用。

2.3 幼苗相對(duì)含水量及可溶性糖含量

由圖3可以看出，鹽脅迫下2種番茄幼苗的相對(duì)含水量均較對(duì)照組顯著下降，但鹽脅迫下番茄幼苗含水量也基本保持在89%以上，這表明雖然鹽分會(huì)抑制植物體內(nèi)水分的運(yùn)輸從而影響植物的生長，但200 mmol·L-1 NaCl處理對(duì)2個(gè)品種番茄從含水量來看對(duì)其生長并沒有嚴(yán)重影響。鹽脅迫下，可溶性糖含量均顯著高于對(duì)照，較對(duì)照組分別增加66.1%、73.7%，這表明可溶性糖對(duì)番茄的耐鹽性起到了一定的作用。

2.4 幼苗Na+、K+含量

由圖4可以看出，與對(duì)照組相比，鹽脅迫條件下兩種番茄植株葉片的Na+、K+含量變化均不顯著，表明200 mmol·L-1 NaCl處理對(duì)兩種番茄體內(nèi)離子平衡狀況并無太大影響。

2.5 抗鹽基因表達(dá)量

由圖5可以看出，在鹽脅迫下，2個(gè)番茄品種的SOS1相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組;WK54品種SOS2相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照，而WK53品種SOS2相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照，但差異不顯著。鹽脅迫后，WK54中SOS1、SOS2相對(duì)表達(dá)量均高于WK53，尤其是SOS2相對(duì)表達(dá)量急劇上升，結(jié)合2個(gè)番茄品種的表型特征來看，WK54耐鹽性優(yōu)于WK53，這可能是因?yàn)镾OS1、SOS2被誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)揮了重要作用。

3 討論與結(jié)論

植物苗期對(duì)環(huán)境脅迫更加敏感，因此確定苗期的耐鹽性能夠很好地反映植株對(duì)鹽脅迫的耐受程度[10]。筆者選用濰坊科技學(xué)院自主研發(fā)選育的2個(gè)番茄品種WK53、WK54進(jìn)行了苗期耐鹽性研究，在鹽脅迫條件下，植物的表型指標(biāo)可以作為鑒定其耐鹽能力強(qiáng)弱的直觀指標(biāo)，植株矮小、葉片黃化、相對(duì)生長量越小，都說明耐鹽性越差[11]。在本試驗(yàn)中，WK53、WK54在200 mmol·L-1 NaCl處理下15 d后其展葉數(shù)、株高、莖粗的相對(duì)增長值均受抑制，本試驗(yàn)結(jié)果與殷夢(mèng)竹等[12]在高濃度鹽脅迫下對(duì)山柿幼苗株高、地徑的測(cè)定結(jié)果相似。從表型結(jié)果來看，WK54優(yōu)于WK53，這表明在苗期WK54耐鹽性可能要強(qiáng)于WK53。

植物相對(duì)含水量反映了植物體內(nèi)的水分狀況，一般來說植物相對(duì)含水量變化越大，其耐鹽性可能相對(duì)越弱[12]?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境中發(fā)揮重要作用，能夠提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，降低因滲透失水而造成的細(xì)胞膜、酶及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的損傷[13]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下2個(gè)番茄品種葉片相對(duì)含水量雖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上下降顯著，但下降幅度僅為4%，葉片含水量均保持在89%以上，間接說明2個(gè)品種的耐鹽性相對(duì)較強(qiáng)。鹽脅迫下，葉片通過積累可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御外界鹽脅迫對(duì)其的傷害，本研究中WK53、WK54可溶性糖含量均顯著提升，較對(duì)照組分別增加了66.1%、73.7%，但2個(gè)品種之間積累量差異并不顯著，這與石婧等[14]的研究結(jié)果一致。

鹽脅迫可打破植物體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，甚至造成離子毒害，從而影響植物生長。Na+是鹽脅迫下的主要毒害離子，而K+對(duì)維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)不可缺少。研究發(fā)現(xiàn)，Na+和K+具有拮抗效應(yīng)，在鹽脅迫下Na+吸收過多會(huì)導(dǎo)致植物對(duì)K+的吸收下降[15]。在本研究中，200 mmol·L-1 NaCl脅迫下，WK53、WK54葉片Na+、K+含量均有少量上升，均與對(duì)照無顯著差異，這表明葉片細(xì)胞中離子穩(wěn)態(tài)并沒有受太大影響。因沒有測(cè)定根中Na+、K+含量，無法判斷根中離子含量情況，但推測(cè)200 mmol·L-1下葉片Na+含量只有輕微增加，可能大量的Na+被根部截留，以保證植株的正常生長。前人研究也表明，在適宜鹽脅迫濃度下，幼苗根系對(duì)Na+運(yùn)輸有較強(qiáng)的限制能力[16-17]。

目前，植物在鹽脅迫條件下Na+調(diào)節(jié)的主要信號(hào)途徑為SOS （salt overly sensitive）信號(hào)途徑，其中包括3個(gè)主要的蛋白：SOS1、SOS2、SOS3[18-19]。當(dāng)植物遭受鹽脅迫時(shí)會(huì)觸發(fā)SOS信號(hào)途徑中的一系列抗鹽相關(guān)基因的表達(dá)。通常情況下，植物遭受鹽脅迫后，首先細(xì)胞內(nèi)Ca+信號(hào)被激活，與SOS2蛋白激酶作用，使質(zhì)膜上的SOS1磷酸化，調(diào)控細(xì)胞對(duì)Na+的外排，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)離子平衡，防止細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器受到Na+的危害[20-21]。本試驗(yàn)qRT-PCR結(jié)果顯示，2個(gè)番茄品種的SOS1、SOS2表達(dá)量均受鹽脅迫誘導(dǎo)，尤其是在WK54中，SOS2表達(dá)水平急劇上升。這可能是WK54比WK53更耐鹽的關(guān)鍵因素。同樣，Olías 等[22]發(fā)現(xiàn)，SlSOS1的表達(dá)對(duì)于番茄耐鹽性極其重要。Tang等[23]也發(fā)現(xiàn)PtSOS1、PtSOS2的表達(dá)明顯受鹽脅迫誘導(dǎo)，這都與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

從本試驗(yàn)生長指標(biāo)、生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果來看，并不能完全比較出WK53、WK54在幼苗期耐鹽性強(qiáng)弱;而從表型結(jié)合抗鹽基因表達(dá)情況來看，WK54的耐鹽性要優(yōu)于WK53。前人在判斷番茄品種耐鹽性時(shí)大都采用生長指標(biāo)結(jié)合生理指標(biāo)的方法來綜合鑒別[24]，但就本試驗(yàn)2個(gè)品種來看，用以往的方法很難區(qū)分，而筆者通過對(duì)SOS1、SOS2 兩個(gè)抗鹽基因表達(dá)情況分析，再結(jié)合表型、生理指標(biāo)可較容易地比較2個(gè)品種的抗鹽性。WK53與WK54是由不同母本、同一父本雜交選育而成。這表明其耐鹽性的差異可能源于母本的差異，后期筆者將對(duì)WK53、WK54及其母本進(jìn)行深入的研究，探索它們耐鹽性的分子機(jī)制差異，為番茄育種以及抗鹽性品種篩選等工作奠定基礎(chǔ)。

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