劉 源，李紅麗*，閆益波，喬國峰，溫永亮，郭錦龍，張國權(quán)

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省方山縣教育科技局，山西 方山 033100)

新生犢牛腹瀉是引起犢牛死亡的重要原因之一[1],該疾病涉及多重因素，包括犢牛的免疫狀況、環(huán)境因素和畜舍、飼養(yǎng)和衛(wèi)生條件等牧場管理措施，以及細菌、病毒和原生動物等不同病原體的相互作用[1-2]。大腸桿菌是哺乳動物腸道的正常寄生菌,在宿主代謝、免疫和營養(yǎng)方面起著重要作用。然而，有少量致病性菌株可引起腸內(nèi)或腸外疾病，并可引起極大的經(jīng)濟損失[3]。致病性大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的一種重要因素[4]。

致病型大腸桿菌菌株具有不同的毒力因子，使其能夠在宿主小腸中定植，避免免疫反應(yīng)，刺激有害的炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生腹瀉。這些毒力因子包括定植或黏附因子(F2-F6、F17、F18、F41)、外毒素(熱敏性腸毒素LTⅠ和LTⅡ、熱穩(wěn)定腸毒素STa和STb、志賀毒素(Stx)、細胞毒性壞死因子 (CNF) 等[5]。目前牛源致病型大腸桿菌主要有產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(enteotoxigenicE.coli,ETEC),腸致病型大腸桿菌(entropathogenicE.coli,EPEC),腸出血型大腸桿菌(enterohaemorrhagicE.coli,EHEC),產(chǎn)細胞毒性壞死因子型大腸桿菌(necrotoxigenicE.coli,NTEC)[5]。不同型致病性大腸桿菌的劃分是依據(jù)其所包含的毒力因子和毒性機制例如腸致病性大腸桿菌[6]或尿道致病性大腸桿菌。

ETEC已被確定為幾種重要的動物和人類腹瀉疾病的病原體。這些細菌可能產(chǎn)生熱敏性(LT)和熱穩(wěn)定性(STa和STb)腸毒素中的一種或多種[7]。EPEC感染后在患者或受感染動物的腸道組織中可觀察到附著和消退(A/E)組織病理學(xué)損傷，不產(chǎn)生腸毒素和Stx[8]，其與上皮細胞的緊密結(jié)合是由親密素(intimin)的外膜蛋白介導(dǎo)的，而參與編碼該蛋白的基因eae最早由JERSE等[9]報道。EHEC隸屬于STEC亞類，可產(chǎn)生Stx并引起腸道組織A/E損傷[8]。NTEC能產(chǎn)生CNF(包括CNF1,2,3)[10]。已有研究報道從腹瀉的犢牛中分離出CNF1、CNF2[11-12]。

在中國，引起犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌被廣泛研究。然而，近5年的研究僅限于少數(shù)畜群，集中在病原的流行病學(xué)調(diào)查[13-14]、系統(tǒng)進化樹分析[15]、耐藥性分析[16]以及功能研究[17]等方面。本研究對隨機取樣的新生牛犢中分離出的致病性大腸桿菌菌株進行毒力因子(F5、F17、STa、LTII、eae、Stx1、Stx2、CNF1、CNF2)篩查，通過PCR檢測分析腹瀉犢牛分離的大腸桿菌致病性相關(guān)的毒力因子的流行情況，初步探究這些毒力因子與腹瀉率的關(guān)系。本研究為山西省牛群的致病性大腸桿菌毒力因子特征研究提供了最新信息，對預(yù)警犢牛腹瀉的暴發(fā)和治療致病性大腸桿菌引起的犢牛腹瀉具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選取山西省母牛數(shù)量為100～250頭的西門塔爾雜交肉牛場33個，33個牛場覆蓋了山西省11個市，每個市隨機選取3個牛場。LB培養(yǎng)基、PCR試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR擴增陽性對照菌株C83539(F5+、Sta+)、C83684(Stx2+)、C83901(LTⅡ+)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；FX-01(F17+、CNF2+)、FX-02(Stx1+、eae+)、XN-01(CNF1+)，均由本實驗室保存。

1.2 采集樣品采集所選33個牛場出生10 d以內(nèi)腹瀉犢牛腸拭子。采樣時間為2019年6—8月(夏季)。記錄采樣時所有牛場犢牛數(shù)量，對采樣時犢牛的腹瀉狀況進行描述統(tǒng)計。

1.3 致病型大腸桿菌分離與毒力因子PCR鑒定收集單個直腸拭子(n=205)，轉(zhuǎn)移至含有LB培養(yǎng)液的試管中，于搖床37℃培養(yǎng)6～8 h菌液變渾濁后，抽取菌液1 μL作為模板進行PCR反應(yīng)，鑒定其是否含有毒力因子。PCR擴增體系：2×Direct PCR Mix 10 μL、模板1 μL、Hot Start DNA Polymerase 0.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、滅菌ddH2O 補足至20 μL。PCR程序：預(yù)變性98℃ 30 s；變性98℃ 5 s，退火5 s，延伸72℃ 20 s，35個循環(huán)；72℃延伸1 min，于4℃保存(表1)。將PCR結(jié)果為陽性(至少擴出1個毒力因子)的菌液涂抹于麥康凱瓊脂平板(山西科教儀器服務(wù)公司)，37℃培養(yǎng)24 h，挑選平板長出單菌落約10個分別作為模板進行PCR驗證其所含的毒力因子。將結(jié)果為陽性的菌落進行革蘭染色、生化試驗，確定為腸桿菌科、大腸桿菌屬的菌落轉(zhuǎn)移到含有LB培養(yǎng)液的細菌培養(yǎng)瓶中，37℃搖床培養(yǎng)6～8 h，菌液變渾濁后將1 mL菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，加30%甘油后于-80℃保存。

表1 PCR反應(yīng)引物基本信息

1.4 統(tǒng)計與分析所有數(shù)據(jù)分析均使用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0，P< 0.05有統(tǒng)計學(xué)意義；使用全球定位系統(tǒng)(GPS)記錄牛群的地理坐標；使用Originpro 2019b將研究區(qū)域內(nèi)的牛場按照毒力譜的種類和頻率進行聚類分析；使用ArcGIS 10.2 (ESRI,Redlands,CA,USA)對聚類的結(jié)果進行空間描述；依據(jù)各牛場的腹瀉率和其毒力譜計數(shù)，使用SPSS 18.0，采用逐步回歸法建立犢牛腹瀉率對毒力譜計數(shù)多元線性回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 犢牛的腹瀉狀況33個牛場共有205頭腹瀉犢牛。各牛場平均采樣(6.21±3.05)頭。各牛場犢牛采樣時的平均腹瀉率為33.1%。各牛場犢牛腹瀉率為15.4%～62.5%。中位數(shù)為29.4%(百分位數(shù)25∶23.9%，百分位數(shù)75∶39.5%)。5個牛場(5，7，17，20，33)腹瀉率高于50%；5個牛場(1，9，13，23，28)的腹瀉率低于20%(圖1)。

2.2 毒力因子鑒定根據(jù)不同基因組合，從33個牛場采樣的腹瀉犢牛(n=205)中分離得到101株致病性大腸桿菌(PCR毒力基因陽性)中，鑒定出18種不同毒力譜(表2)。檢測到的毒力譜廣泛分布于所調(diào)查牛場，不同牛場毒力譜呈現(xiàn)不同組合，并檢測到所有9種毒力因子。黏附因子和毒素結(jié)合較普遍。檢測到的最普遍的陽性毒力因子為F17，其次為F5、Sta，而僅有2株菌為CNF1陽性(表2)，其中，F(xiàn)17僅與其他基因結(jié)合。

2.3 牛場聚類分析將各牛場按照其毒力譜的種類和頻率進行聚類分析(圖1)，可聚為4類。牛場1，2，3，5，6，8，9，10，11，12，13，14，16，18，19，23，24，25，26，27，28，29，30，31聚為第Ⅰ類；牛場4，17，20，21，22，33聚為第Ⅱ類；牛場7，32聚為第Ⅲ類；牛場15單獨聚為第Ⅳ類。使用ArcGIS (ESRI,Redlands,CA,USA)對牛場的聚類結(jié)果進行空間描述(圖2)，結(jié)果表明聚為第Ⅰ類的牛場數(shù)量最多，集中連片地分布在山西省廣大地區(qū)；聚為第Ⅱ類的牛場中，牛場17,20,21,22集中連片地分布在山西省的中部地區(qū)。

圖1 牛場聚類分析

表2 33個牛場毒力譜(n=101)

圖2 牛場聚類的空間描述(圓點表示牛場的地理坐標)

3 討論

致病性大腸桿菌對新生犢牛，尤其是出生1周內(nèi)的犢牛發(fā)病率、死亡率影響相對較高[26]。因此本試驗樣本只采自出生10 d以內(nèi)犢牛腸拭子，有利于研究犢牛的毒力譜與其腹瀉率之間的關(guān)系。

利用PCR技術(shù)鑒定毒力因子已被廣泛用于區(qū)分致病性大腸桿菌和正常腸道菌群。本研究PCR結(jié)果表明檢測到的多數(shù)陽性毒力譜與ETEC的毒力譜相兼容。NAGY等[27]報道，ETEC引起的腹瀉被認為是斷奶前和斷奶期新生犢牛的主要傳染病類型。F5是新生犢牛大多數(shù)感染ETEC的罪魁禍首[28]。本研究F5陽性菌占比為25.7%。世界范圍內(nèi)巴西的F5陽性菌株感染率較高(35.0%)[29]，而美國(1.8%)[30]、荷蘭(2.6%)[31]的F5陽性菌株感染率較低。

本試驗檢測到腹瀉犢牛中最普遍的毒力因子是F17(31.7%)。這也印證了MAINIL等[5]報道F17普遍存在于分離自牛的各種主要致病性大腸桿菌(ETEC、EHEC、STEC、NTEC)。

ETEC菌株在黏附腸黏膜后，可產(chǎn)生耐熱性(LT)和熱穩(wěn)定性(STa和STb)腸毒素中的一種或多種[7]，這2種腸毒素負責(zé)將電解質(zhì)和水大量分泌到小腸內(nèi)。NAGY等[27]研究報道Sta腸毒素來源于豬和牛的ETEC菌株，而Stb腸毒素來源于人類和豬的ETEC菌株。MAINIL[5]報道Sta腸毒素主要來源于牛、豬、犬、人和綿羊的ETEC菌株,而Stb腸毒素主要來源于豬的ETEC菌株。因此本研究并沒有涉及Stb，而Sta陽性菌株占比25.8%。MAINIL[5]指出，不同于分離自腹瀉豬的LTp主要陽性菌和分離自腹瀉病人的LTh主要陽性菌，LTⅡ陽性菌可以從腹瀉病人、牛、水牛中分離得到。本研究中分離到LTⅡ陽性菌株18株，占比17.8%。

牛場聚類結(jié)果表明犢牛腹瀉率在40%以上的8個牛場中，牛場4，17，33，22，20聚到第Ⅱ類；犢牛腹瀉率在25%以下的所有8個牛場聚到第Ⅰ類。因此推測牛場的犢牛腹瀉率與毒力譜之間存在相關(guān)關(guān)系；因此將各牛場的毒力譜計數(shù)作為自變量，其犢牛腹瀉率作為因變量來建立多元線性回歸方程。建立的方程為y=0.264+0.217x1+0.079x2(R=0.723)。其中，x1是組合為Sta、eae毒力譜計數(shù)，x2是組合為F17、LTⅡ毒力譜計數(shù)。由于其他毒力譜偏回歸系數(shù)的檢驗概率P>0.05，已不顯著，引入方程無意義。

犢牛致病性大腸桿菌的獲得通常是通過與母牛接觸，在犢牛未出生之前，可通過該方程由某牛場待產(chǎn)母牛檢測的Sta+eae、F17+LTⅡ這2種毒力譜的計數(shù)來預(yù)測該牛場所產(chǎn)犢牛腹瀉率的高低；通過預(yù)測結(jié)果，對檢出這2種毒力譜的母牛進行大腸桿菌病針對性治療，并對該牛場采取積極的防制措施，從而減少新生犢牛大腸桿菌病的發(fā)病率，減小經(jīng)濟損失。該方程的建立可預(yù)警新生犢牛腹瀉的暴發(fā)。由于該方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.723，相對較低，牛場也不一定包含所有這2種陽性毒力譜，加之腹瀉與諸多因素有關(guān)，故該方程只能大致預(yù)測。要研究牛場犢牛的毒力譜與其腹瀉率的關(guān)系還需要進行更深入的探索和反復(fù)驗證。

牛場聚類結(jié)果的空間分布呈現(xiàn)第Ⅰ類牛場和第Ⅱ類17，20，21，22牛場集中連片分布形態(tài)，提示集中分布牛場的牛來源于同一疫源地，后續(xù)試驗將對這一推論進行求證。

綜上所述，本研究對山西省腹瀉犢牛的致病性大腸桿菌菌株9種毒力因子進行PCR篩查，其中F17和F5是從腹瀉的肉犢牛分離的致病性大腸桿菌中最常見的毒力因子；發(fā)現(xiàn)了18個不同的毒力譜；將牛場按照毒力譜的種類和頻率進行聚類分析，建立犢牛腹瀉率對其毒力譜的線性回歸方程。本研究在國內(nèi)針對犢牛大腸桿菌毒力譜進行廣泛分析，為山西省致病性大腸桿菌菌株的分子特征研究提供了最新信息，對預(yù)警牛場犢牛大腸桿菌的暴發(fā)和預(yù)防及治療致病性大腸桿菌引起的犢牛腹瀉具有重要意義。為了研究與大腸桿菌病相關(guān)毒性因子的特性，后續(xù)需要對涉及不同牛種和牛場類型(奶牛或肉牛)的動物進行更廣泛研究。