劉麗 營(yíng)口經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)中心醫(yī)院（營(yíng)口市第六人民醫(yī)院） （遼寧 營(yíng)口 115007）

內(nèi)容提要： 目的：探討乙型肝炎病毒（HBV）核酸免提取熒光定量PCR方法應(yīng)用價(jià)值。方法：選擇于2017年7月～2019年7月本院收治的乙型肝炎病毒感染患者145例作為資料，均取血清提取DNA，采用ELISA（酶聯(lián)免疫-吸附劑測(cè)定）法測(cè)定HBV血清標(biāo)記物，采用熒光定量PCR檢測(cè)血清HBV-DNA，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果：ELISA法測(cè)定結(jié)果為HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，熒光定量PCR相對(duì)應(yīng)陽(yáng)性率分別為100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清標(biāo)記物的陽(yáng)性率比較差異顯著，P＜0.05。結(jié)論：在乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)中采用熒光定量PCR法可實(shí)現(xiàn)定量計(jì)數(shù)，準(zhǔn)確反應(yīng)核酸復(fù)制狀況，為診治提供可靠依據(jù)，保證治療合理性，應(yīng)用價(jià)值較高。

乙型肝炎在我國(guó)較為多見(jiàn)，主要是由于乙型肝炎病毒引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯母腥拘约膊?，可能?dǎo)致出現(xiàn)乏力疲勞、食欲不振等癥狀，持續(xù)發(fā)展易引起多器官損害[1]。近年來(lái)我國(guó)乙型肝炎感染率逐漸增加，為實(shí)現(xiàn)對(duì)乙型肝炎的盡早發(fā)現(xiàn)，需重視實(shí)驗(yàn)室對(duì)乙型感染病毒的檢測(cè)。常規(guī)多采用ELISA法測(cè)定HBV血清標(biāo)記物進(jìn)行診斷，但存在明顯局限性。而隨著科技進(jìn)步，如今熒光定量PCR法受到重視，其具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高優(yōu)勢(shì)，可直接呈現(xiàn)HBV復(fù)制過(guò)程[2]。為此，本次研究對(duì)乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量PCR方法應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了探討，分析如下。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

選擇于2017年7月～2019年7月本院收治的乙型肝炎病毒感染患者145例作為資料，均知曉本次研究?jī)?nèi)容及目的，且自愿簽署知情同意書(shū)。其中男性78例，女性67例，年齡22～60歲，平均（40.17±3.74）歲。排除嚴(yán)重黃疸癥狀患者、凝血功能障礙患者等[3]。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法。取空腹外周靜脈血5mL作為標(biāo)本，離心處理10min，速度為3000r/min，分離上清血液，置入-20°C環(huán)境保存，采用ELISA法測(cè)定HBV血清標(biāo)記物，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司提供試劑盒，酶標(biāo)儀型號(hào)為HBS1096B，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2熒光定量PCR法。取待測(cè)血清樣本100μL，離心處理10min，1000r/min，分離上清血液加入100μlDNA提取液Ⅰ，混勻后離心處理10min，1000r/min，去除上清液，在沉淀物中加入25μlDNA提取液Ⅱ，混勻后沸水浴10min，離心處理10min，1000r/min，取上清液。在離心管中加重37.6μlPCR反應(yīng)液，0.4μlTaq酶、0.06μL尿苷酶作為反應(yīng)管，加入2mL處理樣本、對(duì)照品，對(duì)照品濃度梯度108copies/mL，107copies/mL，1076copies/mL，105copies/mL，104copies/mL，103copies/mL。完成后進(jìn)行檢測(cè)，采用核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)487rim，檢測(cè)波長(zhǎng)525nm，探針在擴(kuò)增區(qū)中間，條件為93°C預(yù)變形2s，94°C預(yù)變形5s，60°C預(yù)變形30s，40個(gè)循環(huán)。探針HB-Taq S，引物5'-ACATCAGGATTCCTAGGACC-3'（nt167-nt186）；探針HB-Taq AS，引物5'-GGTGAGTGATTGGAGGTTG-3'（nt339-nt321）；探針HB-TaqP，引物5'-FAM-CAGAGTCTAGACTC GTGGTGGTGGACTTC-3'（nt242-nt267）；探針HB-C-S，引物5'-CCTGCACCGAACATGGAGAG-3'（nt143-nt162）；探針HB-C-AS，引物5'-ATATGATAAACGCCGCAGACAC-3'（nt401-nt379）。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

分析表1可知，ELISA法測(cè)定結(jié)果為HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，熒光定量PCR相對(duì)應(yīng)陽(yáng)性率分別為100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清標(biāo)記物的陽(yáng)性率比較差異顯著，P＜0.05。

表1 兩種方法的檢測(cè)結(jié)果分析

3.討論

根據(jù)臨床研究可知，肝炎主要致病因素為乙型肝炎病毒，其作為DNA病毒，對(duì)人體有易感性，可引發(fā)乙型病毒性感染，在我國(guó)較為多見(jiàn)，且呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)[4,5]。如今我國(guó)部分乙型肝炎患者形成持久免疫力，成為慢性感染患者，但大多數(shù)患者發(fā)展為肝硬化及肝癌，因此需重視對(duì)乙型肝炎的盡早檢出，有效治療，控制病情進(jìn)展[6]。ELISA法屬于檢測(cè)乙型肝炎病毒的常見(jiàn)手段，可間接反應(yīng)病毒的表達(dá)和復(fù)制。為進(jìn)一步提高準(zhǔn)確率，近年來(lái)臨床加強(qiáng)對(duì)熒光定量PCR法的應(yīng)用，其可檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)陰性的突變株DNA，彌補(bǔ)ELISA法檢測(cè)不足[7]。本次研究結(jié)果顯示ELISA法測(cè)定結(jié)果為HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，熒光定量PCR相對(duì)應(yīng)陽(yáng)性率分別為100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清標(biāo)記物的陽(yáng)性率比較差異顯著，P＜0.05，提示熒光定量PCR法可在陰性標(biāo)本中檢測(cè)出感染病毒，并可實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV-DNA復(fù)制定量計(jì)數(shù)，準(zhǔn)確反應(yīng)感染情況，應(yīng)用價(jià)值較高。

綜上所述，乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量PCR方法應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒感染進(jìn)展及抗病毒治療反應(yīng)的判斷。