張學(xué)林，吳梅，李曉立，何堂慶，張晨曦，田明慧，陳冰潔，張富糧，郝曉峰，楊青華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

玉米(ZeamaysL.)是重要的糧食、經(jīng)濟(jì)、飼料作物，在中國糧食安全方面具有著重要作用。玉米灌漿期子粒氮代謝強(qiáng)弱對其生長發(fā)育、氮素轉(zhuǎn)運(yùn)及源供應(yīng)能力的維持具有重要影響[1-3]。玉米子粒灌漿期氮代謝過程受到外界環(huán)境和栽培措施的影響[2-3]。周衛(wèi)霞等[2]分析了弱光脅迫對不同基因型玉米子粒發(fā)育和氮代謝的影響；呂麗華等[4]認(rèn)為，高種植密度下玉米子粒氮素代謝較為旺盛；李洪岐等[5]發(fā)現(xiàn)，高密度、寬窄行種植有利于玉米子粒碳氮代謝，保證子粒正常能源供應(yīng)；萇建峰等[3]認(rèn)為，高產(chǎn)田過量施肥不利于氮素向子粒轉(zhuǎn)運(yùn)，而中產(chǎn)田適當(dāng)施肥能夠協(xié)調(diào)灌漿子粒和營養(yǎng)器官間競爭氮素的矛盾。玉米子粒不同發(fā)育階段對氮素的吸收量不同，其中抽雄前10 d至抽雄后25～30 d是玉米吸收氮素最多的時期，吸氮量占總氮量的70%左右[6]。夏光利等[7]也認(rèn)為，玉米子粒硝酸還原酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶活性最大值均出現(xiàn)在授粉后20 d。明確玉米子粒氮素吸收高峰期的氮代謝特征，對改善氮素吸收利用和提高產(chǎn)量至關(guān)重要。

叢枝菌根真菌(ArbuscularmycorrhizaeFungi,AMF)是土壤中生物量最大的一類真菌，能與陸地上絕大多數(shù)的維管束植物形成共生體[8]，具有改善寄主根際土壤環(huán)境、促進(jìn)養(yǎng)分吸收、增加生物量、提高寄主應(yīng)對生物及非生物脅迫的能力[9-12]。研究發(fā)現(xiàn)，AMF顯著提高玉米根系活力和吸收能力，改善其礦質(zhì)營養(yǎng)和水分狀況，增加葉片光合速率，促進(jìn)生長發(fā)育[13-15]。REN等[13]研究認(rèn)為，干旱條件下玉米接種AMF能夠降低玉米葉片脫落酸含量，提高根系吸水率，增強(qiáng)其抗旱性，增加玉米生物量。同一種作物根系可以與多種不同的AMF形成共生關(guān)系，而不同AMF對同一種作物的影響效果也不同，AMF和宿主作物之間相互選擇，成為該植物的優(yōu)勢種[14-15]。姜德峰等[14]和任禛等[15]比較了不同種叢枝菌根對玉米生理特性及子粒產(chǎn)量的影響，并篩選了適合玉米接種的 AMF 菌種。目前，關(guān)于叢枝菌根真菌影響玉米子粒氮代謝，尤其是灌漿高峰前期氮代謝的研究鮮有報(bào)道。不同AMF在玉米子粒氮代謝方面的差異性也不清楚。本研究選擇在夏玉米灌漿前期進(jìn)行試驗(yàn)，探究不同AMF在子粒氮代謝過程中的作用，為篩選對玉米生長有益的優(yōu)勢種，改善玉米養(yǎng)分吸收和生物肥料配施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和試驗(yàn)材料

2019年6—10月在河南省西平縣二郎鄉(xiāng)張堯村(114°02′E，33°20′N，平均海拔49 m)室外開展盆栽試驗(yàn)，土壤質(zhì)地為砂姜黑土。供試土壤取自長期定位試驗(yàn)不施肥處理0～20 cm耕層，土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分為有機(jī)質(zhì)24.04 g·kg-1、全氮1.56 g·kg-1、有效磷9.16 mg·kg-1、速效鉀204 mg·kg-1。土壤物理機(jī)械組成為沙粒18.60 %、粉粒42.20 %、黏粒39.20 %。供試土壤自然風(fēng)干后過2 mm篩，175 ℃高溫滅菌2 h后備用。

供試玉米品種為鄭單958，供試菌種分別為摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae,FM)和地表球囊霉(Glomusversiforme,GV)，其中摩西斗管囊霉由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所“AMF種質(zhì)資源庫”(BGC)提供；地表球囊霉由浙江大學(xué)生命科學(xué)院程磊課題組提供。菌種以玉米為寄主植物進(jìn)行擴(kuò)繁，產(chǎn)生的菌劑包括相應(yīng)的培養(yǎng)基質(zhì)、孢子、根外菌絲及植物根段等，其中菌劑孢子密度為30個·g-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)為單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3個處理分別為：對照CK(滅菌土壤不接菌)；FM處理(土壤接種摩西斗管囊霉)；GV處理(土壤接種地表球囊霉)。試驗(yàn)盆上口徑34 cm，下口徑21 cm，高21 cm。每盆裝滅菌風(fēng)干土9 kg，根據(jù)前期研究結(jié)果[16]，接菌處理每盆添加100 g菌劑，菌劑與滅菌土壤充分混合后裝盆；不接菌對照處理采用相同方法加入等量的滅菌土壤代替菌劑。所有處理均3次重復(fù)，隨機(jī)排列。試驗(yàn)開始前每盆補(bǔ)充20 mL菌劑濾液以消除處理間細(xì)菌群落差異[16-17]。玉米播種前選擇顆粒飽滿的種子，每盆播種3粒，三葉期間苗，每盆保留1株長勢相近的幼苗。試驗(yàn)期間采用土壤水分測定儀測定并定時補(bǔ)充水分，維持土壤含水量為田間最大持水量的60%。

1.3 取樣與測定分析

玉米吐絲期采用日本產(chǎn)SPAD-502葉綠素儀測定穗位葉SPAD值，同時測量植株葉面積。并在玉米吐絲后10 d(10 days after silking，DAS 10),15 d(15 days after silking，DAS 15),20 d(20 days after silking，DAS 20)和成熟期分別進(jìn)行取樣。取樣時玉米植株分為根、莖、葉、子粒等部分，經(jīng)105 ℃殺青，75 ℃烘干至質(zhì)量恒定后測定生物量。玉米植株各器官氮含量采用濃H2SO4-H2O2聯(lián)合消煮，用AA3連續(xù)流動分析儀(SFACFAFIABRAN+LUEBBEⅢ)測定樣品全氮含量。玉米子粒粗蛋白、粗脂肪采用近紅外光譜儀(MATRIX-1)測定。

玉米子粒硝酸還原酶(nitrate reductase,NR)、亞硝酸還原酶(nitrite reductase,NiR)、谷氨酰胺合成酶(glutamate synthase,GS)、谷氨酸合成酶(glutamine synthetase,GOGAT)采用試劑盒法測定[18-20]。取樣時，每個處理隨機(jī)選取3株玉米植株，分別迅速采集5 g子粒，液氮冷凍，保存至冰箱(-80 ℃)后用于測定NR,NiR，GS和GOGAT酶活性。NR，NiR，GS和GOGAT酶活性的測定方法為：待測樣本稱取1 g，用液氮將標(biāo)本研磨充分，加入9 g pH值7.2～7.4的1×PBS緩沖液充分沖洗研缽。采用Eppendorf Centrifuge 5810 R 高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf,Germany)進(jìn)行離心20 min(3 000 r·min-1)，仔細(xì)收集上清液。NR，NiR，GS和GOGAT試劑盒均采自上海酶聯(lián)生物(貨號分別為ml016956，ml076477，ml062646和ml076498)，以空白孔調(diào)零，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀(Rayto，RT-6100)依序測量各孔的吸光度(OD值)，所有測定在加終止液15 min以內(nèi)進(jìn)行。

玉米根系侵染率測定采取PHILLIPS等[21]的方法，即隨機(jī)選取2 g玉米成熟期新鮮根段保存于50%乙醇中，后將根切成0.5～1 cm小段，酸性品紅染色后，以侵染根段數(shù)在總根段數(shù)中百分比計(jì)算菌根侵染率。

玉米成熟期土壤孢子數(shù)采用濕篩傾注-蔗糖離心法篩選孢子[8]，即每個處理稱取土樣10 g，蒸餾水靜置后過雙層分樣篩(上篩20目、下篩400目)，收集400目篩上的殘留物，采用Eppendorf Centrifuge 5810 R 高速冷凍離心機(jī)進(jìn)行3 000 r·min-1離心3 min后去掉上清液；加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)45%～50%蔗糖溶液，攪勻，1 500 r·min-1離心2 min后取上清液，過400目篩，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9% NaCl溶液收集殘留物于培養(yǎng)皿中，備用。每個土樣重復(fù)3次。將所分離的孢子材料置于Olympus顯微鏡下觀察并記錄孢子數(shù)量。

玉米成熟期根系形態(tài)指標(biāo)采用EPSON EXPRESSION 11000XL根系掃描儀(Seiko Epson Corp,Japan)掃描后，利用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)(Version Pro 2013,Regent Instruments Inc,Canada)分析掃描圖片，獲得根長度、根表面積、根體積和根直徑等數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用one way ANOVA比較不同處理之間的差異性，并采用Duncan進(jìn)行多重比較。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Sigmaplot 14.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同叢枝菌根真菌對玉米子粒產(chǎn)量、子粒氮素累積量及子粒品質(zhì)的影響

從表1可以看出，與對照相比，AMF顯著提高玉米子粒產(chǎn)量、子粒氮素積累量、子粒蛋白質(zhì)含量和子粒脂肪含量，但對子粒淀粉和賴氨酸的影響不顯著。與對照相比，F(xiàn)M和GV處理子粒產(chǎn)量分別增加18.29%和25.23%；子粒氮素累積量分別增加37.45%和42.96%；子粒粗蛋白分別增加12.64%和21.51%；子粒粗脂肪分別增加11.49%和12.79%。表明玉米接種不同AMF均可以顯著提高其子粒產(chǎn)量、改善其子粒品質(zhì)，但不同菌劑對產(chǎn)量提高和品質(zhì)改善的作用存在差異，其中GV對玉米子粒產(chǎn)量、氮素積累量、粗蛋白和粗脂肪的作用相對較高。

表1 不同AMF對玉米子粒產(chǎn)量、子粒氮素累積量及子粒品質(zhì)的影響Table 1 Effects of different AMF species on maize grain yield,grain nitrogen accumulation,grain quality

土壤孢子數(shù)和根系侵染率是評價AMF與植物親和性的重要參數(shù)。由圖1可以看出，2種AMF均能在玉米根系中形成侵染，并形成根內(nèi)孢子和根內(nèi)菌絲。由于本試驗(yàn)供試土壤是滅菌土，所以未接菌處理的土壤孢子數(shù)和玉米植株菌根侵染率視為0。與對照相比，接種AMF后土壤孢子數(shù)和根系侵染率均顯著增加(表2)，表明2種AMF均與玉米根系有較高的親和性，并能夠有效地互相識別，其中侵染率相對較高的GV與玉米根系的親和性更高，可以作為玉米的優(yōu)勢菌株。

圖1 玉米吐絲期不同AMF(A:CK; B:FM; C:GV)處理之間根系侵染的光學(xué)顯微鏡 (OM) 顯微照片F(xiàn)ig.1 Photomicrographs by optical microscope (OM) photomicrograph at 40×magnification of root infection in different AMF (A:CK; B:FM; C:GV) treatments at maize silking stage

玉米接種AMF顯著改善根長、根表面積和根體積和根系直徑(表2)。與對照相比，F(xiàn)M處理成熟期玉米根長、根表面積和根體積分別增加14.44%，9.88%和1.56%，GV處理分別增加64.54%，42.27%和19.92%；而FM和GV處理的玉米根直徑分別降低5.65%和9.07%。這表明玉米接種AMF后，一方面，延長根系長度，擴(kuò)大根系表面積和根體積，增加養(yǎng)分吸收面積；另一方面，降低玉米根系直徑，深入到更微小的孔隙中，接觸更多的養(yǎng)分，其中GV對玉米根系性狀的改善作用高于FM。

表2 不同AMF對土壤孢子數(shù)、根系侵染率、根系性狀、吐絲期穗位葉SPAD和葉面積的影響Table 2 Effects of different AMF species on soil spore numbers,root infection rate,root parameters,ear leaf SPAD and leaf area at silking stage

SPAD值是衡量植物葉綠素相對含量的一個重要參數(shù)，而葉面積指數(shù)是反映植物群體生長狀況的一個重要指標(biāo)，其大小與作物產(chǎn)量密切相關(guān)。方差分析結(jié)果表明(表2)，3種處理之間穗位葉SPAD均值和葉面積均差異顯著，其中FM和GV處理的穗位葉SPAD和葉面積均顯著高于對照。表明接種AMF后能顯著提高玉米穗位葉葉綠素含量，增加光合吸收面積，改善玉米群體生長。

由表3可以看出，玉米灌漿前20 d，3個處理根、莖、葉生物量，根、莖、子粒氮含量和根、莖氮素累積量均呈下降趨勢，而子粒生物量、葉氮含量、葉氮素累積量和子粒氮素累積量均呈上升趨勢。與CK處理相比，F(xiàn)M和GV處理根、莖、葉、子粒生物量分別增加8.72%和17.44%，8.72%和7.24%，3.72%和4.64%，17.94%和15.68%；氮含量分別增加8.17%和12.87%，6.86%和8.54%，7.15%和11.53%，6.76%和7.72%；氮素累積量分別增加17.24%和33.04%，15.99%和16.28%，11.14%和16.54%，26.48%和24.66%，其中以GV處理的增加量相對較高。表明玉米接種AMF不僅能夠顯著提高植株生物量，而且能提高各器官，特別是子粒氮含量及其養(yǎng)分吸收能力，其中不同AMF在提高玉米子粒產(chǎn)量和氮吸收方面存在差異。

隨灌漿進(jìn)程推進(jìn)，不同AMF處理玉米子粒NR，NiR，GS，GOGAT酶活性均呈上升趨勢(表4)。3個處理之間NR，NiR，GS，GOGAT酶活性差異顯著，其中FM處理的NR，NiR，GS，GOGAT酶活性平均值分別比對照增加10.67%，5.74%，2.23%和4.28%；而GV處理酶活性分別增加6.97%，7.25%，8.48%和12.17%。表明接種AMF后能顯著增強(qiáng)灌漿前期玉米子粒氮代謝酶的活性，提高玉米子粒氮代謝能力，其中GV對玉米灌漿前期子粒氮代謝酶活性的改善作用高于FM。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，接種叢枝菌根真菌顯著提高玉米子粒產(chǎn)量及其氮素積累量，同時改善玉米子粒部分品質(zhì)性狀。玉米子粒中40%～60%的氮素來自于根系的吸收，作物根系性狀和根系營養(yǎng)吸收能力顯著影響作物產(chǎn)量及其氮素積累量[20-21]。叢枝菌根真菌一方面通過侵染玉米根系形成根外菌絲，在土壤中形成龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)，擴(kuò)大根系養(yǎng)分吸收范圍和吸收能力，獲得植物根系無法直接獲取的土壤養(yǎng)分和水分[22-23]。根外菌絲還能夠進(jìn)入直徑較小根系不能進(jìn)入的土壤孔隙內(nèi)，吸收毛管水和礦質(zhì)營養(yǎng)；并穿插進(jìn)入土壤小孔隙中，增加土壤水穩(wěn)性大團(tuán)聚體數(shù)量，使土壤孔隙溶液中保存更多養(yǎng)分和水分，改良土壤結(jié)構(gòu)，增加菌根植物從土壤中獲取養(yǎng)分和水分的潛力[24]；菌絲還可以穿入有機(jī)物正在分解的微域或與其他微生物直接競爭分解產(chǎn)物，并將有機(jī)物分解釋放的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)給植物[25]。另一方面，叢枝菌根真菌通過改善根系結(jié)構(gòu)增加寄主養(yǎng)分吸收能力[13,26]。在不同草本或木本植物上研究均發(fā)現(xiàn)，接種AMF后植物根長、根表面積、根投影面積等根系參數(shù)增加，水分和養(yǎng)分吸收能力增強(qiáng)，生物量增加；而降低根系直徑使根系深入到較小的土壤孔隙內(nèi)吸收養(yǎng)分[27]。這與本研究發(fā)現(xiàn)AMF顯著改善玉米根系性狀的結(jié)果基本一致。

玉米子粒中的氮素主要是輸導(dǎo)系統(tǒng)運(yùn)來的酰胺、脲和精氨酸等化合物，經(jīng)過GS-GOGAT同化，轉(zhuǎn)變成其他的合成貯藏蛋白所需的氨基酸[28]。較高的硝酸還原酶活性，有助于硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化吸收和產(chǎn)量的增加；而且谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶是氨基酸合成和代謝的關(guān)鍵酶，是氮代謝過程中重要的調(diào)節(jié)酶和限速酶，對植物生長發(fā)育、產(chǎn)量形成有重要作用，其酶活性高低表明氮代謝及蛋白質(zhì)合成能力的強(qiáng)弱[28]，較高的酶活性能夠促進(jìn)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化吸收[5,7]。鄭朝峰[29]發(fā)現(xiàn)，玉米子粒灌漿前期胚形成過程中GS，GOGAT活力大幅度提高，而且GOGAT活力高峰期與子粒氮素積累最活躍時期相一致。呂鵬等[30]也認(rèn)為，施氮通過提高花后玉米NR，GS，GOGAT等酶活性，使玉米灌漿期氮代謝關(guān)鍵酶活性保持較高水平，保證玉米葉片中氮代謝系統(tǒng)的暢通和高效運(yùn)轉(zhuǎn)，提高植株和子粒的吸氮量。本研究發(fā)現(xiàn)，接種叢枝菌根真菌能顯著提高玉米子粒氮含量，可能是AMF通過提高灌漿過程中玉米子粒氮代謝酶活性，促進(jìn)了氨基酸合成和轉(zhuǎn)化及蛋白質(zhì)的形成所致。

姜德鋒等[14]比較了Gigasporarosea，Glomusmosseae，Glomusversifome，Sclerocystissinousa4種叢枝菌根對玉米生理特性和子粒產(chǎn)量的影響后，發(fā)現(xiàn)GV在提高玉米根系活力和養(yǎng)分吸收能力、增加玉米葉片光合速率等方面作用顯著。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同AMF對玉米子粒產(chǎn)量的影響程度存在差異，其中GV的增產(chǎn)作用相對較大。不同叢枝菌根真菌在改善玉米產(chǎn)量和氮素吸收方面的差異，主要是因?yàn)椴煌瑓仓婢鷮ν凰拗髯魑锏挠H和性存在差異，相互之間的選擇性對作物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的影響程度也不相同[31-32]。普遍研究認(rèn)為，菌根侵染率越高，植物菌根化程度相應(yīng)越高，菌根效應(yīng)就越強(qiáng)[15,33]。菌根侵染后一方面促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)活化運(yùn)移，不斷地為宿主提供磷素等營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面宿主為菌根真菌提供碳水化合物保證其生長發(fā)育的能量，提高菌絲生長量、根系侵染率和養(yǎng)分吸收量，促進(jìn)植物生長發(fā)育[22-23]。