賈利強， 趙秋芳， 陳曙

(1.貴州師范學院生物科學學院，貴州 貴陽 550018； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091)

DNA Binding with one finger (DOF)轉錄因子是鋅指蛋白 (zinc finger proteins)家族的一個亞家族，是植物特有的一類轉錄因子。DOF家族基因在動物基因組中沒有同源基因，在其蛋白序列中具有一個明顯的鋅指結構，所以這類植物特有的單個鋅指結構的轉錄因子命名為DOF(DNA-binding with one finger)蛋白[1]。所有的DOF蛋白的N端具有一個保守的大約有52個氨基酸組成的DNA結合結構域C2-C2鋅指結構，這個結構域可以結合到靶基因的啟動子順勢元件序列AAAG上，調控靶基因的表達[2]。另外，在DOF蛋白的N端含有一個雙向的核定位信號序列(NLS,bipartite nuclear localization signal)[3]。DOF蛋白的C端序列的不保守，有報道表明,DOF蛋白的C端調控許多下游基因的表達，在植物的生長發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的調控作用[4-5]。迄今為止，已報道了許多作物的DOF基因家族，大麥中有75個DOF基因[6],玉米中有46個[7],馬鈴薯中有35個[8], 大豆中有28個[9],木豆中有38個[10],水稻中有30個[11],42個候選DOF基因發(fā)現(xiàn)于苜蓿基因組中[12],25個在甘蔗中[13]。

玉米的DOF基因家族的初步研究已有報道，但是,這個家族基因在玉米生長發(fā)育中及應答逆境脅迫的定量表達數(shù)據(jù)還很缺乏。本研究選用其中的一個亞家族共計8個基因作為研究對象，研究了這8個基因在玉米自交系鄭58不同器官中的特異表達模式及應答NaCl，PEG6000，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮脅迫時的響應表達模式，為深入研究這些DOF基因的功能提供了有用的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗處理

試驗材料為玉米自交系鄭58。在鄭58授粉期及授粉15 d后采集根、莖、葉、花、穗和苞葉，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。對于NaCl和PEG 6000脅迫試驗。參照前人的研究結果，玉米鄭58種子用2%的次氯酸鈉表面消毒，28 ℃黑暗催芽，挑選發(fā)芽一致的種子放置于固定在泡沫漂浮板的紗網(wǎng)上，于Hoagland培養(yǎng)液中生長，為了使根系健壯生長和防止綠藻產(chǎn)生，水培容器和支持苗的平板采用不透光的塑料。在人工氣候室(28 ℃光照16 h，黑暗8 h)長至三葉一心時，挑選大小一致的玉米幼苗轉到200 mmol·L-1NaCl溶液或者20%的PEG 6000溶液脅迫處理，分別于處理的0，1,6和24 h時間點采取葉片，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。對于不同氮形態(tài)的脅迫試驗，將發(fā)芽整齊一致的玉米鄭58種子生長于含2 mmol·L-1的硝酸鉀或氯化銨的Hoagland培養(yǎng)液中，每周更換新的培養(yǎng)液，生長3周后，轉到含有0.02 mmol·L-1的硝酸鉀或者氯化銨的Hoagland培養(yǎng)液脅迫處理，分別在脅迫處理的0，1，6和24 h時迅速采集葉片，液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以試驗處? h的樣品作為空白對照，將3株幼苗混樣作為1次生物學重復，共設置2次生物學重復試驗。

1.2 8個ZmDOF基因生物信息學分析

本研究中，8個ZmDOF的蛋白和核苷酸序列及擬南芥的36個DOF蛋白序列。

從Phytozome中下載(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。根據(jù)在染色體中的物理位置，輸入到軟件MapInspect (http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html)，繪制這8個基因在染色體中的位置圖。這8個玉米DOF蛋白和擬南芥36個DOF蛋白生成的數(shù)據(jù)陣，利用軟件MEGA10(http://meme-suite.org/tools/meme)中的MUSLE算法進行比對，取保守序列，用NJ法進行進化樹計算，參數(shù)設置為P-distance，pairwise deletion，bootstrap值取1 000。利用這8個基因的CDS和基因組序列，輸入在線軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)，繪制基因結構圖。利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org)對8個ZmDOF蛋白進行結構域搜索。

1.3 RNA提取及定量PCR

玉米葉片總RNA的提取利用Trizol試劑盒 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取。用DNase I(Takara, Dalian, China)去除總RNA中可能污染的基因組DNA?？俁AN的質量和純度用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計 (Thermo Scientific, USA)來測定。取3 μg總RNA用Super Script Ⅲ逆轉錄酶(TaKaRa,Dalian,Chian)進行反轉錄，生成cDNA稀釋5倍用于后續(xù)的定量PCR反應(羅氏480實時定量PCR儀)。擴增體系為1 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL、SYBR反應MIX(2×)為5 μL和3 μL水。設定的PCR程序為：1個循環(huán)95 ℃ 30 s; 45個循環(huán)95 ℃ 5 s; 60 ℃ 20 s; 72℃ 10 s。利用2-△△Ct算法來計算ZmDOF基因的相對表達量。玉米actin基因用作內(nèi)參。用于定量的8個玉米DOF基因的引物見表1。所有的試驗重復至少3次，用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析。

表1 8個ZmDOF基因的實時熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression on analysis of 8 ZmDOF genes

2 結果與分析

2.1 8個ZmDOF基因的生物信息學分析

根據(jù)玉米DOF基因家族的研究結果[35]，選定位于同一亞家族的8個基因作為研究對象，這8個基因是ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF25，ZmDOF29，ZmDOF32，ZmDOF37和ZmDOF45(表2)，位于染色體1,2,4,5,7和10上 (圖1A)。除了ZmDOF45含有一個內(nèi)含子外，其他基因無內(nèi)含子 (圖1B)。這8個蛋白含有一個保守的C2-C2鋅指結構域 (圖1C)。對這8個蛋白序列和36個擬南芥DOF蛋白序列構成的數(shù)據(jù)列進行比對，利用MEGA 7軟件計算進化樹，結果表明，這8個蛋白確實分布于一個亞家族中 (圖1D)。這個亞家族又可以進一步細分為3個小家族，命名為Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ，小家族Ⅰ包括4個基因，ZmDOF5，ZmDOF9,ZmDOF29和ZmDOF45；小家族Ⅱ包含有2個基因，ZmDOF14和ZmDOF37；小家族Ⅲ有2個基因，ZmDOF25和ZmDOF32。

表2 8個ZmDOFs的生物信息學分析

A.8個ZmDOF基因的染色體定位； B. 8個ZmDOF的基因結構分析；

利用在線軟件MEME對這8個蛋白的保守基序進行了分析，選取了前6個motif進行了分析。結果表明，Motif1分布于所有的這8個蛋白序列中。表明這個保守的基因序列在這8個DOF蛋白中有重要的作用。這個基因序列的分布模式也支持進化樹的分類結果。一個家族內(nèi)蛋白具有相似的基因序列分布模式。亞家族Ⅲ的成員ZmDOF25和ZmDOF32都只有2個核心基序的分布。亞家族Ⅱ的成員ZmDOF14和ZmDOF37都有3個基序的分布且位置類似。

A. 8個ZmDOF蛋白的基序分析；B. 8個ZmDOF蛋白的基序分布示意圖。

選取玉米抽雄期根、莖、葉、雄花、穗和苞葉組織，利用熒光定量PCR技術，檢測了這8個基因的組織特異性表達模式。結果表明,這8個基因具有明顯的組織特異性表達特性 (圖3)。ZmDOF5，ZmDOF9和ZmDOF14主要在雌穗中表達，分別是根部表達的71,88和81倍以上。ZmDOF25和ZmDOF32主要在雄花中表達，分別是根部表達量的7 700倍和17倍。ZmDOF29主要在雄花和苞葉中表達，分別是根部表達量的33和14倍。ZmDOF45主要在雄花和根部表達，而ZmDOF37主要在苞葉中表達。這些表達數(shù)據(jù)表明，這些基因在玉米生長發(fā)育進程中可能發(fā)揮著重要作用。

R，S，L，CB，T，E分別代表根、莖、葉、苞葉、雄花和幼穗。

這8個基因應答逆境脅迫的響應模式未知。為了探測這8個基因對NaCl脅迫和PEG脅迫的響應模式，利用200 mmol·L-1的NaCl溶液和20% PEG 6000溶液處理三葉一心期的玉米幼苗，分別在處理后的0，1，6和24 h取葉片，利用熒光定量PCR技術探測了這8個基因的表達模式。所用到的引物見表1。在NaCl溶液脅迫處理1 h時，6個基因，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF32，ZmDOF37和ZmDOF45，表達量出現(xiàn)明顯上調，分別比處理前上調了6.9，3.7，2.1，3.9，2.7和4.5倍，之后這些基因的表達量又出現(xiàn)部分恢復，在脅迫處理24 h時，其表達量恢復到處理前的水平。表明這些基因是應答NaCl脅迫的早期響應基因。ZmDOF25和ZmDOF29在脅迫1 h后，表達出現(xiàn)明顯上調。直到脅迫處理結束，其表達量還維持在較高的水平。表明這2個基因在整個NaCl脅迫處理期間都處于被誘導的狀態(tài)。在20%PEG 6000溶液脅迫處理1 h后，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14和ZmDOF25的表達量出現(xiàn)上調，分別比處理前上升了6.9，19.4，2.7和13.9倍。說明這些基因是應對脅迫處理的早期響應基因。而ZmDOF29，ZmDOF32，ZmDOF37和ZmDOF45的表達量在脅迫處理24 h后出現(xiàn)了明顯上調，分別比處理前上調了2.8，4.7，2.1和3.7倍。這表明這些基因是應答PEG脅迫處理的晚期響應基因。這些表達數(shù)據(jù)表明，這8個基因可能在不同時間內(nèi)不同程度地參與調控玉米應答NaCl或PEG脅迫響應途徑。

2.5 8個ZmDOFs對不同氮形態(tài)脅迫的響應模式分析

本研究探測了這8個基因應答銨態(tài)氮脅迫和硝態(tài)氮脅迫的響應模式。結果表明，在這2種脅迫條件下，這8個基因的表達模式都發(fā)生了明顯變化(圖5)。在銨態(tài)氮脅迫處理1 h后，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF29，ZmDOF32和ZmDOF45都發(fā)生了明顯的上調，分別比處理前上調了3，4.5，3.5，6.6，5.1和4.9倍。銨態(tài)氮脅迫處理幾乎不影響對ZmDOF37基因的表達，表明ZmDOF37基因不參與玉米應答銨態(tài)氮脅迫途徑。ZmDOF25的表達量在銨態(tài)氮脅迫處理早期沒有變化，在脅迫處理的24 h時，表達量上調了2.6倍，表明ZmDOF25是玉米應答銨態(tài)氮脅迫的晚期響應基因。相比于銨態(tài)氮脅迫處理，在硝態(tài)氮脅迫處理下，這8個基因的表達量變化幅度更大。其中有7個基因，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF25，ZmDOF29，ZmDOF32和ZmDOF45,在硝態(tài)氮脅迫處理1 h后，出現(xiàn)了明顯的上調，之后這7個基因的表達出現(xiàn)回落。相對于處理前，這7個基因的表達量分別上調了13.3，58.2，43.4，5.2，45.7，23.7和59.8倍。表明這些基因是玉米應答硝態(tài)氮脅迫的早期響應基因。ZmDOF37的表達受脅迫處理的抑制，在脅迫處理的1 h，其表達量下調了58%，在脅迫處理6 h時，其表達量更是出現(xiàn)了劇烈下降，表明ZmDOF37是玉米應答硝態(tài)氮脅迫的負調控因子。這些表達數(shù)據(jù)表明，這8個基因在玉米應答氮脅迫的響應機制中可能發(fā)揮著生物學功能。

圖4 8個ZmDOFs對鹽脅迫和PEG脅迫的響應模式

圖5 8個ZmDOFs應答不同氮形態(tài)脅迫的響應表達模式

3 結論與討論

利用熒光定量PCR技術檢測了一個DOF亞家族基因在玉米抽雄期不同器官中的表達模式。 結果表明,這8個基因的表達具有明顯的器官特異性。在前人的研究中，以玉米自交系B73為試驗材料，利用RNA-Req技術，得出ZmDOF25主要在玉米的雄花、葉片和雌穗中表達，ZmDOF29在雌穗，ZmDOF32在幼嫩的莖、葉和雄花中表達，ZmDOF37在葉和穗部中表達[36]。而在本研究中，ZmDOF25在玉米的雄花中表達，ZmDOF29在苞葉和雄花中表達，ZmDOF32在雄花中表達，ZmDOF37主要在苞葉中表達。試驗材料的不同可能是造成這些數(shù)據(jù)差異的原因之一。本研究結果進一步補充了前人的研究，用熒光定量PCR進一步明確了這8個基因在玉米不同組織的表達模式，為研究這些基因在調控玉米組織器官生長發(fā)育進程提供有用的信息。

葛敏等[37]利用土培的方法，在不同氮肥處理條件下，通過轉錄組測序比較了玉米V3期DOF基因家族的表達水平。其中，ZmDOF5,ZmDOF29和ZmDOF45沒有檢測到表達，ZmDOF9和ZmDOF25在高氮處理中表達，而低氮處理不表達，ZmDOF14則在高氮處理時不表達，而在低氮處理時表達，ZmDOF37則一直穩(wěn)定高表達。本研究利用更加靈敏的定量PCR技術，更能精細控制的水培系統(tǒng)，研究這8個ZmDOFs應答不同氮形態(tài)的響應表達模式。與前人的研究結果類似，ZmDOF5，ZmDOF29和ZmDOF45的本底表達量比較低，但是這3個基因在應答不同氮形態(tài)脅迫時，其表達模式差異明顯，這3個基因對硝態(tài)氮脅迫表現(xiàn)敏感，都受到硝態(tài)氮脅迫的強烈誘導。ZmDOF9和ZmDOF25也受到硝態(tài)氮脅迫的強烈誘導，而不是抑制。不同品種的玉米幼苗在應答氮脅迫時的耐受能力有明顯的差異，鄭單958耐受低氮脅迫的能力要強于浚單20、先玉335和登海662[38]。后續(xù)試驗可以對這些品種的親本耐受低氮的能力進行比較研究。