巨鮮婷，果秋婷

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，咸陽 712000)

阿立哌唑(ARP)屬于一種新型的非典型抗精神分裂癥藥物，主治各類型的精神分裂癥[1-2]。ARP為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類藥物，水溶性較差，不利于藥物溶解吸收[3]，ARP具有肝臟首過效應(yīng)，且是P糖蛋白(P-gp)的底物，不利于藥物吸收[4]，這些不利因素最終導(dǎo)致其口服生物利用度較差[5]。為此，本研究以聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F123)和D-α-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作為載體材料，將ARP制備成混合納米膠束(ARP-mNMs)，并通過Caco-2細胞單層模型評價其體外滲透性，通過大鼠體內(nèi)藥動學(xué)評估藥物生物利用度，為ARP的口服新劑型研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-100 型高效液相色譜系統(tǒng)(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)；5F-101S型系列集熱式恒溫磁力攪拌器(常州德普紡織科技有限公司)；LFD系列實驗室冷凍干燥機(上海田楓實業(yè)有限公司)；Zetasizer Nano ZSE型納米粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)；JEM-3200FS型場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；QP-80型二氧化碳培養(yǎng)箱(濟南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)；F98型熒光分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)。

1.2試藥 阿立哌唑原料藥(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%，批號191201)；阿立哌唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，批號100776-202003)；地西泮(華中藥業(yè)股份有限公司)；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F123，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；D-α-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，上海起發(fā)實驗試劑有限公司)；叔丁醇(羅輔醫(yī)藥科技有限公司)；Eagle′s培養(yǎng)基(西寶生物科技股份有限公司)；磷鎢酸(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)；pH 6.8磷酸鹽緩沖液(PBS，實驗室自制)；胰蛋白酶-EDTA和漢克平衡鹽溶液(HBSS)，均購自賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1ARP-mNMs的制備 通過冷凍干燥-水化法[6]制備ARP-mNMs。稱取不同比例的Pluronic F123和TPGS共10 g和ARP 500 mg，加入到叔丁醇100 mL中，在60 ℃熱水浴中攪拌溶解，將溶液分裝到表面皿中，放入到冷凍干燥機中進行冷凍干燥，預(yù)凍溫度為-35 ℃，預(yù)凍時間為2 h，一次干燥溫度為0 ℃，干燥時間為10 h，二次干燥溫度為30 ℃，干燥時間為6 h。干燥結(jié)束后取出樣品，收集到西林瓶中，密閉保存；取上述冷凍干燥粉末1 g，置于錐形瓶中，加入60 ℃的蒸餾水10 mL(并保持在60 ℃水浴中)，在1 000 r·min-1磁力攪拌下水化含藥粉末，持續(xù)攪拌30 min，將溶液冷卻至室溫，再將樣品溶液轉(zhuǎn)移至高速離心機中，以5 000 r·min-1離心1 h，除去不溶性藥物及聚合物沉淀物，用0.22 μm微孔濾膜過濾上述溶液，即得到ARP-mNMs，低溫冷藏，備用。

2.2ARP-mNMs的處方篩選

2.2.1臨界膠束質(zhì)量濃度(CMC)測定 CMC是用于評價聚合物形成膠束性能的重要參數(shù)，只有具備較低CMC的聚合物，其形成的膠束進入體內(nèi)后才能避免被體液稀釋而破壞其完整性[7]。本研究采用芘熒光光譜法測定不同比例Pluronic F123和TPGS形成的混合納米膠束的CMC值[8]，結(jié)果見表1。方法：配制含芘的丙酮溶液，濃度為5×10-6mol·L-1，精密移取芘溶液0.1 mL，置于10 mL干燥的棕色量瓶中，氮氣下吹干丙酮溶劑，平行制備樣品6份，備用；另按照表1中Pluronic F123和TPGS的比例配制一系列濃度的聚合物溶液，加入到含芘的量瓶中，定容，在37 ℃恒溫水浴中振蕩48 h后，取樣品溶液在熒光光度計下掃描，計算各樣品溶液在373(I373)、384 nm(I384)處的熒光強度之比(I373/I384)，以熒光強度比(I373/I384)與聚合物濃度對數(shù)值(lgC)作圖，其交叉點即為不同比例Pluronic F123和TPGS形成的膠束的CMC值。

形成的膠束CMC值越低，其進入體內(nèi)的抗稀釋能力越強，由表1可知，單獨TPGS的CMC值為0.226 mg·mL-1，單獨Pluronic F123的CMC值為0.002 mg·mL-1，隨著處方中Pluronic F123的比例增加，其形成的CMC值呈降低趨勢。

2.2.2ARP-mNMs制劑性質(zhì)研究 按照2.1項下方法以不同配比Pluronic F123和TPGS制備ARP-mNMs，通過測定粒徑分布、Zeta電位和包封率，比較其制劑性質(zhì)，結(jié)果見表2。

表2 不同配比Pluronic F123和TPGS對形成的ARP-mNMs性質(zhì)的影響

由表2可知，單獨以TPGS制備的ARP-mNMs粒徑較大，為(216.2±7.7) nm，而單獨以Pluronic F123制備的ARP-mNMs粒徑較小，為(62.4±1.7) nm，即CMC越大，其形成的膠束所需要的聚合物濃度越高，因此形成的粒徑越大[8]。而不同配比Pluronic F123和TPGS制備的ARP-mNMs，隨著處方中Pluronic F123用量的增加，粒徑逐漸減小。

2.2.3ARP-mNMs的處方確定 本研究要求制備的ARP-mNMs一方面具有較低的CMC值，確保其進入體內(nèi)仍以完整膠束存在，同時具有較小的粒徑分布，利于提高其對胃腸道細胞膜的滲透性；另一方面處方中需要存在一定量的TPGS，用以克服P-gp對藥物的外排作用。因此本研究根據(jù)研究結(jié)果確定Pluronic F123和TPGS的配比為50∶10。

2.3微觀結(jié)構(gòu)觀察 在透射電子顯微鏡下觀察ARP-mNMs的微觀形態(tài)。取ARP-mNMs樣品滴加到涂有碳的銅網(wǎng)上，再滴加20 g·L-1的磷鎢酸溶液染色30 s，風(fēng)干液體后，在透射電鏡下觀察(加速電壓為150 kV)并拍攝電鏡照片。見圖1。由圖1可知，ARP-mNMs呈球狀，大小分布均勻，未發(fā)現(xiàn)任何聚集現(xiàn)象。見圖1。

圖1 ARP-mNMs的透射電鏡照片

2.4體外藥物釋放研究 使用透析袋擴散法[9]評價ARP-mNMs的體外藥物釋放情況。取ARP-mNMs及ARP乙醇溶液(取ARP原料藥50 mg溶解到10 mL乙醇溶液中，即得)各2 mL，分別置于透析袋中，系緊兩端，將透析袋浸入到37 ℃、pH 值為6.8的PBS(吐溫-80質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)中，介質(zhì)體積為200 mL，磁力攪拌子轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，在固定的時間間隔(0.5、1、2、4、6、8、10、12 h)內(nèi)取出3 mL釋放介質(zhì)(同時補加同溫同體積空白介質(zhì))，過濾，進樣檢測藥物含量，計算藥物質(zhì)量濃度，繪制藥物累積釋放度-時間曲線，見圖2。

圖2 ARP-mNMs的體外藥物釋放曲線

由圖2可知，ARP乙醇溶液中的藥物在2 h內(nèi)釋放完全，而ARP-mNMs在釋藥前期表現(xiàn)為突釋現(xiàn)象，在前2 h藥物釋放度約為37%，而在隨后的時間內(nèi)表現(xiàn)為持續(xù)緩慢釋藥現(xiàn)象，在12 h約為85%。

2.5穩(wěn)定性研究 將ARP-mNMs分裝到西林瓶中，密封，置于(25±2) ℃環(huán)境中，分別于10、20、30 d取樣，觀察外觀，并測定粒徑分布、Zeta電位和包封率，結(jié)果見表3。

由表3可知，ARP-mNMs在(25±2) ℃環(huán)境中放置30 d，其外觀仍為淡藍色透明狀溶液，未觀察到溶液出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象以及藥物沉淀，粒徑、Zeta電位以及包封率均未發(fā)生顯著變化，說明ARP-mNMs存放在(25±2) ℃環(huán)境中的穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.6ARP-mNMs抗稀釋性能研究 ARP-mNMs經(jīng)口服給藥進入體內(nèi)，體液會對其產(chǎn)生稀釋作用，有可能破壞膠束的完整性，導(dǎo)致藥物泄露，因此通過測定稀釋后ARP-mNMs的粒徑分布，評估其抗稀釋能力。取ARP-mNMs加入蒸餾水，分別稀釋10、50、100和200倍，靜置0.5 h后測定粒徑分布，并與未稀釋ARP-mNMs進行比較，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，ARP-mNMs稀釋不同倍數(shù)后，其粒徑分布與PDI較為穩(wěn)定，無明顯變化，推測ARP-mNMs經(jīng)口服給藥進入體內(nèi)膠束結(jié)構(gòu)不會遭到破壞。

圖3 ARP-mNMs稀釋后的粒徑分布與

2.7細胞轉(zhuǎn)運研究 取Caco-2細胞在Eagle′s培養(yǎng)基(含有胎牛血清質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1，L-谷氨酰胺質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1和青霉素-鏈霉素質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1)中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，相對濕度為90%，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，培養(yǎng)7 d后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA溶液消化并離心，并以5×104個細胞·cm-2的密度接種在Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿(面積為0.6 cm2)中，加入培養(yǎng)基孵育，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基，孵育14 d，形成Caco-2單層細胞。在轉(zhuǎn)運實驗前測定得Caco-2單層細胞的頂端(AP)和基底外側(cè)(BL)的跨上皮電阻值(TEER)均大于600 Ω·cm-2，說明單層細胞足夠緊密，可用于細胞轉(zhuǎn)運實驗[10]。使用pH值為 7.4的HBSS孵育Caco-2單層細胞15 min，再分別取含有ARP原料藥和ARP-mNMs的HBSS，放入到Caco-2單層細胞的AP側(cè)(0.4 mL)或BL側(cè)(0.6 mL)作為供試液，并在BL側(cè)或AP側(cè)加入相同體積的空白HBSS，將單層細胞在37 ℃下孵育，并在15、30、45、60、90、120 min從接收側(cè)取接收液(同時補加同體積空白HBSS)，離心后經(jīng)HPLC法測定藥物含量，以評價ARP原料藥和ARP-mNMs的吸收過程(AP→BL)和分泌過程(BL→AP)的特性，并按照公式(1)和(2)計算表觀滲透系數(shù)(Papp)和外排比(ER)：

Papp=(dQ÷dt)÷(A×C0)

(1)

ER=Papp(BL→AP)÷Papp(AP→BL)

(2)

其中，dQ÷dt是接收液中ARP的穩(wěn)態(tài)透過率，C0是供試液中ARP的初始濃度，A是Caco-2單層細胞面積，Papp(AP→BL)是ARP從頂端轉(zhuǎn)運到基底外側(cè)的Papp值，Papp(BL→AP)是ARP從基底外側(cè)轉(zhuǎn)運到頂端的Papp值。結(jié)果見表4。

表4 ARP原料藥和ARP-mNMs在Caco-2細胞單層中的滲透性

由表4可知，ARP原料藥從Caco-2單層細胞的BL側(cè)轉(zhuǎn)運到AP側(cè)，其Papp(BL→AP)值為(14.21±0.43)×10-6cm·s-1，而ARP原料藥從Caco-2單層細胞的AP側(cè)轉(zhuǎn)運到BL側(cè)，其Papp(AP→BL)值為(6.24±0.36)×10-6cm·s-1，ER值為2.28(>2)，說明ARP是P-gp底物[11]。將ARP制備成ARP-mNMs，其Papp(BL→AP)值由原來的(14.21±0.43)×10-6cm·s-1降低到(3.75±0.33)×10-6cm·s-1，下降近3.79倍，這是由于ARP-mNMs處方中加入TPGS，能夠有效抑制P-gp的活性，降低了P-gp對ARP的外排作用；同樣，ARP-mNMs的Papp(AP→BL)值由原來的(6.24±0.36)×10-6cm·s-1升高至(11.93±0.41)×10-6cm·s-1，提高了近1.91倍，說明ARP-mNMs通過細胞膜內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，促進藥物吸收。相比ARP原料藥的ER值，ARP-mNMs的ER值降低了7.35倍，說明ARP-mNMs能夠有效提高藥物的滲透性。

2.8大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)

2.8.1色譜條件 色譜柱為CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.03 mol·L-1乙酸銨水溶液(70∶30)，檢測波長為257 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL·min-1，進樣量為20 μL。

2.8.2血漿樣品前處理 取大鼠血漿0.2 mL，置于5 mL圓底離心管中，加入40 μL質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的地西泮作為內(nèi)標(biāo)，渦旋混合，再加入乙酸乙酯與二氯甲烷的混合物(80∶20)1 mL，渦旋混合，離心，取上清液，置于3 mL尖底離心管中，氮氣吹干，殘渣用100 μL流動相復(fù)溶，離心，取上清液進樣檢測。

2.8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)驗證 精密稱取ARP對照品25.0 mg，置于100 mL量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋定容，搖勻，得ARP質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1的對照品儲備液，取上述儲備液依次配成質(zhì)量濃度分別為2.5、6.25、12.5、25.0、62.5、125.0 μg·mL-1的ARP乙腈對照品溶液。取大鼠血漿0.2 mL，置于5 mL圓底離心管中，加入上述系列質(zhì)量濃度的ARP乙腈對照品溶液及ARP對照品儲備液各10 μL，渦旋混合，得到含有ARP質(zhì)量濃度分別為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液40 μL，渦旋混合，再按照2.8.2項下血漿樣品前處理進行操作，并進樣檢測，以ARP質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，以ARP與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(As/Ai)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程為：As/Ai=1.586C-0.264(r=0.999 7)，線性關(guān)系良好。

另配制含有ARP質(zhì)量濃度分別為0.1、1.0、10.0 μg·mL-1的血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合，低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品重復(fù)制備6份。所有樣品按照2.8.2項下血漿樣品前處理進行操作，并進樣檢測，考察方法精密度和提取回收率。結(jié)果顯示，低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品的提取回收率分別為88.7%、94.3%、96.1%，精密度RSD值分別為8.7%、6.7%、7.1%，說明本方法提取回收率高，重復(fù)性好。

2.8.4動物實驗 取SD大鼠12只，體質(zhì)量為(200±20) g，雌雄各半，禁食不禁水12 h。將大鼠隨機分為2組，第1組大鼠灌胃給予ARP混懸液(分散介質(zhì)為5 mg·mL-1的羥丙甲基纖維素)，第2組大鼠灌胃給予ARP-mNMs，給藥量均為20 mg·kg-1，并在0、0.5、1、2、3、4、6、8和12 h經(jīng)眼眶后神經(jīng)叢取血0.5 mL，離心，取大鼠血漿0.2 mL,置于5 mL圓底離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液40 μL，渦旋混合，再按照2.8.2項下血漿樣品前處理進行操作，并進樣檢測，WinNonlin軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，見表5，并繪制血藥質(zhì)量濃度-時間曲線，見圖4。

圖4 血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

表5 大鼠藥動學(xué)參數(shù)

由表5可知，大鼠口服ARP混懸液后其Cmax和AUC(0～∞)分別為(1.37±0.48) μg·mL-1和(8.4±1.3) μg·mL-1·h，而大鼠口服ARP-mNMs后其Cmax和AUC(0～∞)分別為(5.67±1.04) μg·mL-1和(19.8±2.3) μg·mL-1·h，后者較前者的Cmax和AUC(0～∞)分別提高了4.14、2.36倍，說明ARP-mNMs可顯著提高ARP的達峰質(zhì)量濃度和口服生物利用度，這主要歸因于ARP-mNMs的處方中加入了TPGS，可有效抑制腸上皮細胞膜中的P-gp活性，降低對ARP的外排作用。

3 討論

為了改善ARP的溶解度及生物利用度，目前已將ARP制備成納米混懸劑[12]、β-環(huán)糊精包合物[13]、固體脂質(zhì)納米粒[14]、聚合物膠束[15]等新型給藥系統(tǒng)。由高分子聚合物和/或表面活性劑形成的膠束可增加藥物的溶解度，在改善藥物生物利用度方面顯示出巨大潛力[16-17]。Pluronic F123是一種兩親性高分子聚合物，作為一種非離子型表面活性劑，可用于提高難溶性藥物的溶解度[18]，已作為一種安全的藥用輔料被多國藥典收載； TPGS同樣屬于非離子表面活性劑，但TPGS能夠抑制細胞膜內(nèi)的P-gp活性，以降低其對底物的外排作用[19]。而以Pluronic F123和TPGS形成的混合納米膠束能夠顯著改善難溶性藥物的溶解度和口服生物利用度[20]，因此本研究以Pluronic F123和TPGS作為膠束載體，將ARP制備成ARP-mNMs。