浦仕彪，王鉞涵，楊竹雅，劉 錄，周志宏

(云南省高校中藥飲片工程研究中心 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500)

胃潰瘍是臨床上常見的一種急、慢性消化系統(tǒng)疾病，由各種致病因子的共同作用，使胃粘膜發(fā)生炎性反應(yīng)、壞死及脫落，進(jìn)而形成潰瘍，其粘膜缺損壞死穿透粘膜肌層，甚至達(dá)到固有肌層及更深處，多表現(xiàn)為噯氣、反酸、饑餓不適、中上腹脹悶、疼痛等，可發(fā)生出血、穿孔、幽門梗阻，甚至癌變等并發(fā)癥，常反復(fù)發(fā)作[1].胃潰瘍病因復(fù)雜，是綜合因素的結(jié)果，與遺傳、精神、飲食、化學(xué)、感染、環(huán)境等因素相關(guān)[2].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為胃潰瘍的形成是胃粘膜的攻擊因子與防御因子失衡所致[3]，攻擊因子包括胃酸、胃蛋白酶、幽門螺桿菌、非甾體抗炎藥等；防御因子包括胃粘膜、胃粘液、碳酸氫鹽、前列腺素、細(xì)胞更新和上皮生長因子等.胃潰瘍的愈合包括了粘膜層及粘膜下層組織結(jié)構(gòu)的重生、正常生理結(jié)構(gòu)的重建、粘膜層防御功能的恢復(fù)等，涉及多種細(xì)胞和分子的相互作用，是一個自發(fā)的并且非常復(fù)雜的過程，其中包含很多不同機(jī)制，影響著疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸.目前臨床治療胃潰瘍的常用手段主要有抗幽門螺桿菌治療、經(jīng)典的H2受體拮抗劑(雷尼替丁、法莫替丁等)、質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑等)、胃粘膜保護(hù)劑(硫糖鋁、鋁碳酸鎂、前列腺素)、胃腸動力藥(多潘立酮、莫沙必利)等[4-5].盡管西藥靶點(diǎn)明確、療效肯定，但停藥后年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%，且長期使用有較大安全隱患，如近年來發(fā)現(xiàn)奧美拉唑的致癌性、雷尼替丁原料的基因毒性、粘膜保護(hù)劑引起的腹瀉，以及瑞巴派特和替普瑞酮所致的白細(xì)胞減少、肝功能損害等，給需要長期、反復(fù)用藥的胃潰瘍患者帶來了潛在的安全隱患.

胃潰瘍屬于西醫(yī)病名，中醫(yī)古籍中并無與之相應(yīng)的病名，但其癥狀與中醫(yī)的“胃脘痛”、“痞滿”、“吐酸”、“嘈雜”等病證相合，可將其歸屬于上述病證范疇，并認(rèn)為主要由飲食不節(jié)、寒溫失調(diào)、情志不暢、損傷脾胃引起，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜[6].由于中醫(yī)藥對胃潰瘍的病因病機(jī)分析、臨床表現(xiàn)、藥物治療上均有獨(dú)特見解，在預(yù)防和治療方面有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和臨床療效，特別是近年來中藥對胃粘膜保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究取得了較大進(jìn)展，為中藥治療胃潰瘍提供了越來越多的證據(jù)[7].目前臨床對胃潰瘍的治療主要包括西醫(yī)、中醫(yī)和中西醫(yī)聯(lián)合治療3個方面，相比于西醫(yī)近期療效好但遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率高和副作用多，中醫(yī)中藥在消除胃潰瘍攻擊因子等方面顯示了優(yōu)勢，其高治愈率、高愈合質(zhì)量及較強(qiáng)的抗復(fù)發(fā)作用，為胃潰瘍的治療及防止復(fù)發(fā)提供了更有效的方法[8-9]，并具有安全性高、價(jià)格較低等特點(diǎn)，越來越受到患者青睞.

胃腸炎寧顆粒是我省已故名中醫(yī)吳生元教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由美洲大蠊、白芨和鐵皮石斛三味藥組成，具有抗菌消炎、保護(hù)消化道粘膜、收斂止血、促進(jìn)潰瘍組織修復(fù)、養(yǎng)陰健胃等作用，對消化性潰瘍療效顯著.為了將該方繼續(xù)發(fā)揚(yáng)光大，讓更多胃潰瘍患者獲益，對其進(jìn)行院內(nèi)制劑的開發(fā)具有積極的社會意義.本文擬采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，通過簡單、經(jīng)濟(jì)、經(jīng)典的乙醇致小鼠急性胃潰瘍模型，進(jìn)行組方優(yōu)化，為院內(nèi)制劑開發(fā)明確方劑組成.

1 儀器與試劑

DENVER INSTRUMENT電子分析天平，HX602Z型電子天平，248WBJV型海爾冰箱，Milli-Q Integral 超純水機(jī)，量筒、燒杯、剪刀、計(jì)時鐘等均為國產(chǎn).

無水乙醇，分析純，含量≥99.7%，500 mL /瓶，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司出品，批號20180707；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)，國藥準(zhǔn)字H53020469，500 mL/瓶，昆明南疆制藥有限公司出品，批號A170114d；甲醛(37%～40%)，分析純，500 mL/瓶，廣東光華科技股份有限公司，批號20171018；磷酸二氫鈉，分析純，500 g/瓶，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號20151222；磷酸氫二鈉，分析純，500 g/瓶，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號20170204.10%中性福爾馬林溶液(分別稱取磷酸二氫鈉 4.000 2 g 及磷酸氫二鈉 6.500 3 g，加入純水溶解、稀釋至約 800 mL，再加入甲醛溶液(37%～40%)100 mL，以純水定容至 1 000 mL，混勻后即可).

SPF級雄性ICR小鼠，5～6周齡，體重24～28 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030.

美洲大蠊提取物、白芨超微粉、石斛超微粉由云南中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室楊竹雅教授鑒定并提供.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

按均勻設(shè)計(jì)原則選用U5(53)表，以美洲大螊提取物(X1)、白芨粉(X2)、石斛粉(X3)3種藥物作為考察因子，每個因子分別取5個水平(即呈梯度遞增的5種不同劑量).

根據(jù)美洲大螊提取物(臨床推薦劑量為 0.5 g/次、3次/天)、白芨粉(臨床常用推薦劑量為 3.0 g/天、3次/天)及石斛粉(臨床常用推薦劑量為 3.0 g/天、3次/天)的臨床使用劑量，得出小鼠的等效劑量分別為0.25、0.5、0.5 g/kg，并以此為基礎(chǔ)確定美洲大螊提取物的小鼠劑量范圍0.10～0.30 g/kg、白芨粉和石斛的劑量范圍均為0.20～0.60 g/kg，從低到高各選取5個劑量水平.按照均勻設(shè)計(jì)表格安排各因子及水平，進(jìn)行組方設(shè)計(jì)，得到均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，見表1～3.

表1 均勻設(shè)計(jì)U5(53)表

表2 各因素劑量水平表 (g·kg-1)

表3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案 g

2.2 藥效篩選試驗(yàn)

選用24～28 g 雄性ICR小鼠132只，按體重隨機(jī)分為11組：正常對照；模型對照；陽性對照雷尼替丁 50 mg/kg；美洲大蠊提取物 0.25 g/kg(相當(dāng)于混合物 1.56 g/kg)；白芨超微粉 0.5 g/kg；石斛超微粉 0.5 g/kg；不同劑量水平配比組方樣品(實(shí)驗(yàn)1～5號)；每組12只.各組動物每日分別按劑量灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，正常和模型對照組給予純水，容積均為 20 mL/kg.末次給藥前禁食不禁水 24 h，末次給藥后 1 h，除正常對照組外，各模型動物均按 0.1 mL/10 g 灌胃給予無水乙醇.造模 1 h 后，脫頸椎處死動物，剪開腹部，結(jié)扎幽門和賁門，并向胃內(nèi)注射氯化鈉注射液 2 mL，游離、并切下整個胃，置于10%中性福爾馬林溶液中固定 10 min.取出，沿胃大剪彎開，平鋪于玻片上，觀察并按Guth計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[5]計(jì)算潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率.結(jié)果見表4及圖1.

Guth計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：點(diǎn)狀出血記1分；線狀出血，若寬度<1 mm，糜爛長度<1 mm 記2 分，1～2 mm 記3分，2～3 mm 記4 分，>4 mm 記5分；若寬度>1 mm，以上分值×2.

潰瘍抑制率=(模型組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù))/模型組潰瘍指數(shù)×100%

由表4和圖1可見，正常對照組小鼠禁食 24 h 后，胃粘膜完整，表面光滑，呈淡粉紅色，無充血和潰瘍等異常變化；與對照組相比，模型組小鼠胃粘膜有廣泛損傷，呈暗紅色，伴隨有大量出血點(diǎn)或糜爛等，其潰瘍指數(shù)明顯增高(P<0.01)，表明造模成功.與模型組相比，各給藥組小鼠胃粘膜出血和糜爛情況均有不同程度減輕，其中除美洲大蠊對潰瘍指數(shù)的降低僅有作用趨勢而無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P﹥0.05)，其余各給藥組均能明顯降低潰瘍指數(shù)(P<0.05/0.01)，提示對無水乙醇致小鼠的急性潰瘍有明顯保護(hù)作用.

表4 對無水乙醇致小鼠胃潰瘍的影響

圖1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)小鼠胃粘膜損傷圖示

2.3 對均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析

將以上藥效學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果(潰瘍指數(shù))分別輸入計(jì)算機(jī)，采用DPS v8.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)回歸分析，得出相關(guān)指標(biāo)的回歸方程和最優(yōu)結(jié)果.見表5.

表5 3因素5水平均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)回歸方程及結(jié)果

2.4 最佳配比

當(dāng)美洲大蠊提取物(混合物)、白芨、石斛的劑量配比為1.88∶0.6∶0.6 (g/kg)(試驗(yàn)中的5號樣品)時，小鼠潰瘍指數(shù)最低(1.6分)，與模型組相比潰瘍抑制率為76.00%；由回歸方程得出的最佳配比為0.625∶0.20∶0.20(g/kg)，潰瘍指數(shù)為2.9分；2組劑量配比基本相當(dāng)，均大致為3∶1∶1.由此，確定胃腸寧組方中美洲大蠊提取物(混合物)、白芨、石斛的最佳配比為3∶1∶1.

3 討論

均勻設(shè)計(jì)法又稱為均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)法或空間填充設(shè)計(jì)法，是一種可應(yīng)用于各個領(lǐng)域的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[10].以中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論為基點(diǎn)，將數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法的理論與技術(shù)結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)對方劑的配伍規(guī)律進(jìn)行研究，并通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析與綜合評價(jià)，可探討復(fù)方中藥味配伍與藥理效應(yīng)變化的相關(guān)規(guī)律，因此，均勻設(shè)計(jì)法近年來也被學(xué)者應(yīng)用于復(fù)方劑量配伍優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)研究.該研究的關(guān)鍵點(diǎn)在于指標(biāo)的選擇，一般選取最為重要的 1～2 項(xiàng)指標(biāo)，綜合評估篩選出更優(yōu)質(zhì)的配伍處方后，再以此為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)的藥學(xué)、藥理、毒理等研究，同時要求最終篩選出的處方必須體現(xiàn)原處方的宗旨和立意，這樣才能證明指標(biāo)選擇的正確性和準(zhǔn)確性.

胃腸寧是云南省名中醫(yī)吳生元教授的經(jīng)驗(yàn)方，由美洲大蠊、白芨和鐵皮石斛三味藥組成，臨床用于胃潰瘍療效顯著.本研究采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)法，以美洲大蠊混合物、白芨及石斛超微粉為實(shí)驗(yàn)材料，在乙醇致小鼠急性胃潰瘍模型上優(yōu)化組方中三味藥抑制潰瘍指數(shù)的最佳配比，結(jié)果顯示：美洲大蠊、白芨、石斛以3∶1∶1的劑量配比時，對無水乙醇致小鼠胃潰瘍有最佳保護(hù)作用.