張佳菲 萬亮 何勇 岑海燕

摘要： 準確獲取作物冠層生化信息對監(jiān)測作物生長和指導精準施肥具有重要意義?，F有的作物生化參數的垂直分布研究以高光譜遙感反演為主，缺乏與光合生理的聯(lián)系。本研究主要探究了不同氮素處理水平下油菜苗期冠層內的葉綠素、類胡蘿卜素、干物質和水分等生化參數的垂直分布變化特性，同時利用快速葉綠素熒光技術測定了葉片的光合性能，并通過線性回歸分析和主成分分析進一步剖析了熒光響應與生化參數的內在聯(lián)系。試驗結果表明：（1）苗期中期油菜冠層的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、干物質和水分含量均呈拋物線型的非均勻垂直分布，而葉綠素與類胡蘿卜素的比值具有與其他生化參數不同的垂直分布模式，其隨著葉位升高和施氮量的增加逐漸下降，與推動力DFTotal、電子鏈末端量子產額φRo等熒光參數的垂直分布模式相同;（2）熒光參數，特別是DFTotal，對油菜葉片葉綠素與類胡蘿卜的比值、葉綠素和干物質含量具有較強的評估能力;（3）缺氮會降低苗期油菜葉片的光系統(tǒng)I和II（PSI和PSII）性能，通過最大光化學效率φPo等熒光參數可對氮素脅迫進行診斷;而不同葉位葉片在PSI性能即電子末端傳遞效率上具有顯著差異，通過DFTotal可有效表征冠層生化參數的垂直異質性。上述結果表明，應用快速葉綠素熒光技術對作物進行生化信息的垂直異質性監(jiān)測具有可行性，可為指導精準施肥和提高優(yōu)質優(yōu)產提供新思路和技術支撐。

關鍵詞： 快速葉綠素熒光;JIP-測定;垂直異質性;葉綠素;類胡蘿卜素;氮素

中圖分類號： S363??? ??? 文獻標志碼： A??? 文章編號： 202103-SA005

引用格式：張佳菲， 萬亮， 何勇， 岑海燕. 基于快速葉綠素熒光技術的油菜冠層生化參數垂直異質性分析[J]. 智慧農業(yè)（中英文）， 2021， 3 （1）： 40-50.

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1? 引? 言

油菜是世界上僅次于大豆的第二大油料作物，在全球石油資源替代、動物飼料和生物燃料供應中發(fā)揮著重要作用[1]。油菜生化表型信息（例如色素、干物質、水分等）的快速獲取對于優(yōu)良品質選育、提高作物品質和產量具有重要意義。而葉片生化特性在冠層內往往呈現顯著的非均勻垂直分布，例如，光合作用較為活躍的上層葉片中的氮濃度往往較高[2，3]。作物冠層內的這種空間異質性可以被視為一種在有限的營養(yǎng)資源和變化環(huán)境條件中不斷進行葉片之間的調整分配，以最大限度地提高冠層光合速率的適應性策略[2，4]。因此，有必要對作物冠層內生化組分信息的垂直異質性進行定量研究與分析，為實施油菜生長信息動態(tài)監(jiān)測和精準科學施肥提供有效的理論方法和技術支撐。

目前，對于作物生化組分垂直分布的研究以高光譜遙感評估作物的氮素垂直分布為主，通過統(tǒng)計模型建立冠層光譜與各個垂直層氮素的聯(lián)系[5-8]。然而，基于反射率的監(jiān)測方法往往包含了來自植物和土壤的混合信號，降低了反演的準確性和穩(wěn)健性，且與作物光合作用等生理機制的聯(lián)系并不是很清楚[9，10]。此外，對于光合色素等與植物光合生理聯(lián)系十分緊密的生化組分的垂直分布研究相對較少，無法滿足田間作物優(yōu)良品質選育和關鍵生育期施氮管理等依賴高通量表型信息獲取的要求。

在植物光合作用中，葉綠素分子吸收的能量一般有三種轉化形式：光化學、熱耗散和葉綠素熒光[11]。也就是說，未被光化學反應消耗或轉化為熱量的剩余光能則以熒光的形式從植物中輻射出來。而植物衰老或逆境脅迫、高溫低溫、鹽脅迫以及干旱等都會引起這三種能量發(fā)生變化[12，13]。因此，通過葉綠素熒光的變化可以探測到植物葉片生理狀態(tài)的變化，如光能的吸收與轉換、反應中心的狀態(tài)、過剩光能及其耗散、光系統(tǒng)II（Photosystem II，PSII）供體側和受體的活性、光合作用光抑制與光破壞等[14，15]。

與傳統(tǒng)的氣體交換測量方法相比，葉綠素熒光技術已經成為一種了解光合功能、生理特性的時空動態(tài)變化更有效、便捷且高通量的方法。其優(yōu)勢主要在于熒光信號只來自于植物本身，因此可以有效避免來自于土壤等其他信號的干擾，從而直接反映植物最真實的生理狀態(tài)。除了植物逆境生理響應的檢測外，已有許多研究將葉綠素熒光應用于分析作物葉綠素含量、氮營養(yǎng)指數（Nitrogen Nutrient Index，NNI）等生理生態(tài)指標來指導作物生長過程中的施肥。熒光參數會受氮素等營養(yǎng)元素供應的顯著影響，隨著施氮量增加，水稻中非光化學淬滅（Non-Photochemical Quenching，NPQ）也會增加[16]，而在棉花中過量施氮則使作物最大光化學效率（Fv /Fm）和電子傳遞速率（Electron Transport Rate，ETR）等顯著下降[17]。此外，一些研究也利用熒光參數在不同葉層觀測到PSII活性和能量利用效率的顯著差異[18，19]，說明了葉綠素熒光響應在對作物光合生理表征，特別是垂直異質性表征的敏感性和巨大潛能。而目前對于作物冠層內熒光參數的垂直異質性的研究還較少。因此，利用葉綠素熒光技術探索作物冠層內熒光參數的垂直異質性以及與生化信息的關系，并作為一種評價作物生化參數的替代方法具有非常大的前景。

本研究主要用分光光度計測定并分析了油菜苗期冠層葉綠素、類胡蘿卜素、干物質和水分等生化參數的垂直分布變化特性，同時利用快速葉綠素熒光技術探究了冠層內光合生理特性的垂直異質性，剖析了熒光響應與生化參數的內在聯(lián)系與生理機制，最終確定了最適宜表征油菜生化信息的熒光參數。

2? 材料與方法

2.1 試驗設計

本研究的試驗對象為甘藍型油菜品種浙雙758（Brassica napus L.），于浙江大學紫金港校區(qū)農業(yè)試驗站試驗田供試土壤設置3個氮素水平，分別為不施氮（N0，0 kg N/ha）、正常施氮（N1，215 kg N/ha）和過量施氮（N2，430 kg N/ha），即N0：N1：N2= 0：1：2。氮肥以3：1：2的比例分別施于油菜移栽前、苗期初期和蕾苔期，磷肥和鉀肥則均作基肥施用。試驗田采用隨機區(qū)組排列，每個氮素水平3個重復，共9個小區(qū)。小區(qū)面積為6.6 m2（5.5 m×1.2 m），每個小區(qū)南北和東西方向各設置寬0.4 m的保護道。油菜于2019年11月初移栽，試驗于2020年1月6日（苗期中期）進行。

2.2 數據獲取

2.2.1 快速葉綠素熒光數據采集

在每個氮素水平的3個小區(qū)內，隨機選取3個長勢相近且良好的油菜樣本，沿主莖自下而上的底1葉、底2葉、底3葉、底4葉、底5葉、底6葉和底7葉分別標記為L1、L2、L3、L4、L5、L6和L7，并根據所在垂直空間的相對位置劃分為基葉（L1、L2）、中葉（L3～L5）和頂葉（L6、L7）。試驗時選取每個葉片葉脈右側中上部區(qū)域的點作為采樣點。在田間采用葉片夾（直徑4 mm）對葉片相應的采樣點進行20 min的暗適應處理后，利用植物效率分析儀Handy-PEA（Handy Plant Efficiency Analyzer，Hansatech Instruments Ltd.，UK）進行快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的測量。

2.2.2 生化參數測定

完成田間數據測量后，采集油菜各個葉位的葉片樣本，在實驗室對每個葉位的采樣點用直徑0.85 cm的打孔器打孔稱量鮮重，并用1.8 mL 95%的乙醇在黑暗環(huán)境中浸泡24 h，用分光光度計（Epoch，BioTek Instruments，Winooski，USA）測定色素含量（葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量）。隨后將完成色素測定的樣本置于60 ℃的烘箱中烘干至恒重并稱量其干重，并用鮮重減去干重計算得到水分含量。

2.3 研究方法

2.3.1 OJIP曲線及JIP-測定參數

綠色植物或含有葉綠素的部分組織進行一段時間的暗適應處理，被突然暴露在可見光下便會發(fā)出一種強度不斷變化的暗紅色熒光信號，也稱為Kautsky效應[20]。這期間，熒光信號先上升，后下降。將其剛暴露在光下時的最低熒光定義為O點，最高峰定義為P點，中間分別有J點（2 ms）和I點（30 ms）兩次階躍，快速葉綠素熒光誘導動力學（OJIP）曲線指的就是熒光從O點到P點的變化過程[21，22]。

OJIP曲線形態(tài)的變化反映了植物葉片PSII的光合原初反應電子傳遞鏈以及光合機構的結構和狀態(tài)的變化，通過JIP-測定的方法可以對該變化進行定量分析和生理解釋。其理論基礎是生物膜能量流動模型，天線色素將小部分吸收（Absorption，ABS）能轉化為熱和熒光，其余部分則被反應中心（Reaction Center，RC）所捕獲（Trapping，TR），并將處于氧化態(tài)的初級電子受體QA激發(fā)還原為QA-，繼續(xù)往下進行電子傳遞（Electron Transfer，ET），從而形成電子傳遞鏈[23]。以此過程為基礎推算出一系列葉綠素熒光參數的數據處理方法即為JIP-測定方法，具體的計算公式和參數含義如表1所示[21]。

2.3.2 主成分分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）以多變量數據為處理對象，旨在利用“降維”的思想，把多指標轉化為少數幾個綜合指標[24]?；贠JIP曲線的JIP-測定參數數量較多，且有些參數之間存在高度的相關性，從而增加了問題分析的復雜性。因此利用PCA將數據從高維空間轉向低維空間，便于進一步對不同氮素處理和不同葉位葉片熒光參數進行統(tǒng)計分析。

2.3.3 數據處理與分析

對不同氮素處理水平下不同葉位的葉片生化參數，采用最小顯著差異法（Least Significant Difference，LSD）檢驗顯著性差異（P < 0.05）。JIP-測定參數的PCA、生化參數和熒光參數之間的相關性分析以及顯著性分析均采用SPSS Statistics 19軟件（IBM Corporation，USA）。

3? 結果與分析

3.1 油菜冠層生化參數的垂直異質性

油菜苗期中期各個葉位下葉片的葉綠素含量（Cab）、類胡蘿卜素含量（Cxc）、葉綠素與類胡蘿卜素含量的比值（Cab /Cxc）、葉綠素a和葉綠素b含量的比值（Chl a/b）、干物質含量（Cm）以及水分含量（Cw）的變化結果如圖1所示。可以看到，上述生化參數值在不同葉位的葉片上均發(fā)生了顯著的變化，即垂直異質性，且不同氮素處理水平下它們垂直空間上的變化基本一致。具體地，油菜葉片葉綠素（圖1（a））和類胡蘿卜素（圖1（b））含量從底部到頂部呈現開口向下拋物線型的變化，干物質（圖1（e））和水分（圖1（f））含量則呈現開口向上拋物線型的變化，說明在冠層垂直空間水平上中葉（L3～L5）的葉綠素、類胡蘿卜素含量最高，干物質和水分含量則最低，而基葉（L1、L2）相較于頂葉（L6、L7）具有更高的葉綠素、水分含量和較低的類胡蘿卜素、干物質含量。由于基葉一定程度上會受到遮蔽，其接受的光強相對頂葉較少，因此其所需要用來進行光保護的類胡蘿卜素相對就少，且其干物質需要向上部新葉轉運而較低。特別的是，正常氮組（N1）的基葉葉綠素和類胡蘿卜素含量均高于缺氮組（N0）和過氮組（N2），而其中葉的葉綠素、類胡蘿卜素、干物質、水分含量則均為最低。此外，頂葉的葉綠素含量隨著施氮量增加有下降的變化趨勢。這一結果表明氮素脅迫雖然對油菜冠層內生化參數的垂直分布模式沒有顯著的影響，但在缺氮的情況下，油菜吸收的氮素會優(yōu)先分配給頂葉以滿足其生長需求[25]，而氮素充足的情況下則會不斷供應更多的頂部新葉生長，從而出現了缺氮組頂葉葉綠素含量較高的情況。

葉綠素與類胡蘿卜素含量的比值（圖1（c））從底部到頂部呈現較為顯著的下降趨勢，進一步反映了頂葉的葉綠素含量較少而類胡蘿卜素含量較高的特點，基葉則反之。葉綠素含量與類胡蘿卜素含量的比值有效反映了光保護葉黃素循環(huán)響應[26，27]，說明在吸收光能較多的頂葉中具有更活躍的葉黃素循環(huán)進行光保護。此外，隨著施氮量的增加，比值也逐漸減小，這一結果也表明了葉綠素與類胡蘿卜素含量的比值與葉位（葉齡）、施氮水平均具有潛在的良好線性關系。葉綠素a/b反映了天線尺寸的大小，植物通過調整葉綠素a/b來適應不同光強或氮素供應的環(huán)境。在基葉中葉綠素a和葉綠素b含量的比值（圖1（d））顯著低于中葉和頂葉，且在各個葉位中基本都是隨著施氮量的增加而增加，這反映了基葉中的光合系統(tǒng)具有更大的天線尺寸（捕光色素葉綠素b所占的比例大）以適應較低的外界光強[28]。

3.2 基于JIP-測定參數的油菜冠層光合生理垂直異質性

以L1底葉的各個JIP-測定參數值為基準，賦值為1，并將其他葉位的參數值與其分別做商，可有效觀察到油菜各個葉位葉片的JIP-測定參數差異，不同氮素處理水平下的結果如圖2所示。3個氮素水平中均出現較為顯著變化的參數是DFTotal、φRo、RE0 /RC、Sm和N，它們在頂葉中出現了極小值，說明在頂葉中的電子鏈末端性能最弱。缺氮組（N0）和正常氮組（N1）中頂葉單位反應中心或單位受光截面耗散的熱量（DI0 /RC和DI0 /CSm）均為最大，因為冠層中各個葉位葉片所吸收的光能隨著葉位的升高是逐漸增加的，頂葉吸收較多的光能而使得其熱耗散也較高。但這個值在過量施氮組（N2）中卻并不是最大的，這可能與過量施氮組頂葉和中葉綠素a和葉綠素b含量的比值較高有關，天線尺寸相對較?。ú豆馍厝~綠素b較少）使其捕獲的光能并沒有比其他葉位的葉片多。

3.3 油菜葉片生化參數與JIP-測定參數的相關性分析

為進一步研究油菜葉片生化參數與JIP-測定參數之間的潛在聯(lián)系，對兩者進行皮爾遜相關性分析，所得結果如圖3所示。葉綠素和類胡蘿卜素比值的對數值與JIP-測定參數的相關性較比值本身有所提高。Cab、Cab /Cxc、log（Cab /Cxc）、Cm與多個JIP-參數之間存在較高的相關性，而Cxc、Chl a/b和Cw等與JIP-測定參數之間的相關性較低。其中，δRo、φRo和DFTotal與葉綠素含量呈顯著的高度正相關關系（r > 0.5，P < 0.01），DFTotal、φRo、PIABS、Sm和RE0 /RC與葉綠素和類胡蘿卜素的比值和其比值的對數均呈顯著的高度正相關關系，ABS/RC與干物質含量呈高度正相關關系，而δRo和DFTotal則與其呈顯著的高度負相關關系（r < -0.5，P < 0.01）。這說明一定程度上提高葉綠素含量和其與類胡蘿卜素的比值將顯著提高原初光化學反應中電子傳遞到PSI傳遞鏈末端的量子產額和推動力，而干物質含量過高和水分含量過少則會阻礙電子在傳遞鏈中的傳遞過程，因為作為最初電子供體的水分含量減少將使光合作用中水電解的過程受到影響。

從與葉綠素與類胡蘿卜比值的對數（圖4（a）～圖4（c））、葉綠素含量（圖4（d）～圖4（f））和干物質（圖4（g）～圖4（i））相關性較高的3個JIP-測定參數進行線性回歸的結果可以看到，3個生化參數均與DFTotal具有較顯著的線性關系（P < 0.0001），決定系數R2分別為0.45、0.35和0.27。結合不同葉位的散點分布情況可以看出，相比于葉綠素含量和干物質含量，葉綠素含量與類胡蘿卜素含量比值的對數值能有效區(qū)分出基葉和頂葉，進一步說明了DFTotal參數具有反映光保護葉黃素循環(huán)等光合生理垂直異質性的潛能。

3.4 基于PCA的JIP-測定參數聚類分析

通過油菜苗期中期葉片JIP-測定參數的主成分分析，進一步探究在不同葉位和不同氮素處理下葉片光合機構結構和功能的變化規(guī)律，結果如圖5所示?？梢钥吹?，JIP-測定參數的分布基本形成了三個較好分離的簇。其中兩個（Cluster 1和Cluster 3）位于第一個主成分（PC1）上，一個（Cluster 2）位于第二個主成分（PC2）上。結合每一簇中JIP-測定參數的生理意義，可以發(fā)現它們分別對應了不同的光合生理過程：光能吸收和捕獲階段（Cluster 1）、電子傳遞和熱耗散階段（Cluster 2）和電子鏈末端傳遞階段（Cluster 3）。進一步可以推得，PC1可對應PSI的活性，較高的值表示較高的PSI性能（高電子鏈末端傳輸效率），代表參數有φRo、δRo、RE0 /RC等;PC2則對應PSⅠI活性，較高的值表示較高的PSⅠI性能（高光吸收、光化學和電子傳輸效率），代表參數包括ABS/CSm、φPo、ET0 /CSm等。

從不同氮素處理實驗組的聚類結果可以發(fā)現，隨著施氮水平的提高，聚類的位置也在發(fā)生改變：缺氮組（N0）主要位于第三、四象限，正常施氮組（N1）主要分布在第二、三和四象限的Cluster1和Cluster3之間，而過量施氮組（N2）則主要分布于第一象限的Cluster2。結合JIP-測定參數分析可知，相較于正常施氮，過量施氮組油菜葉片具有更高的PSII和PSI性能，而缺氮組油菜葉片的PSII和PSI性能均較弱，特別是在光捕獲和能量傳遞階段;同一施氮水平下，隨著葉位的變化，聚類的位置也發(fā)生了變化：顏色較深的數據點所代表的底部葉片（L1）主要分布在第一、四象限，而顏色較淺的數據點所代表的頂部新葉（L7）則位于第二、三象限，表明油菜頂部新葉較底部成熟的葉片在PSI性能上有顯著的差異，即電子鏈末端傳輸效率比較低。

結合圖3、圖4中的結果，可以看到與葉片生化參數具有較高相關性的JIP-測定參數均分布在反映電子傳遞鏈末端性能的Cluster 3內，其中DFTotal所在向量的方向正好也指向葉位升高的方向，這也與圖1（c）中的結果一致。DFTotal是電子能傳遞到電子鏈末端的推動力，通過計算公式（30）可以看出該參數由PIABS、δRo兩個參數計算所得，這同時也解釋了PCA結果中這3個參數之間的夾角較小以及均與葉片生化參數有較高的相關性的原因。進一步推測利用DFTotal這個綜合性能參數，可以有效地用于油菜冠層生化參數垂直異質性的表征。

4? 結 論

本研究主要利用快速葉綠素熒光技術實現了對油菜冠層生化參數垂直異質性的檢測與評估，得到以下研究結果。

（1）苗期中期油菜冠層的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、干物質和水分含量均呈拋物線型的垂直分布，而葉綠素/類胡蘿卜素具有與其他生化參數不同的垂直分布模式，其隨著葉位升高和施氮量的增加逐漸下降，且與熒光參數DFTotal、φRo和RE0 /RC的垂直分布模式相同。

（2）熒光參數對油菜葉片生化參數中的葉綠素/類胡蘿卜、葉綠素和干物質含量具有相對較強的評估能力。其中，電子能傳遞到電子鏈末端的推動力性能參數DFTotal與葉綠素與類胡蘿卜素的比值、葉綠素含量均具有較高的正相關性（r > 0.5，P < 0.01），與干物質含量則呈顯著的負相關（r < -0.5，P < 0.01）。

（3）缺氮一定程度上會降低苗期油菜葉片的PSII和PSI性能，通過φPo和RE0 /RC等熒光參數可以有效評估氮素脅迫。而不同葉位則在PSI性能即電子末端傳遞效率上具有顯著的差異，熒光參數DFTotal可以有效表征冠層生化參數的垂直異質性。

上述結果表明，葉綠素熒光技術可作為一種評估作物生化參數垂直異質性有效的替代方法，為實現基于高通量表型技術的作物生長信息監(jiān)測提供了思路和技術支撐。擬進一步對不同生長期的油菜冠層內生化參數進行表征，實現油菜全生育期的生化參數垂直分布監(jiān)測。

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Vertical Heterogeneity Analysis of Biochemical Parameters in Oilseed Rape Canopy Based on Fast Chlorophyll Fluorescence Technology

ZHANG Jiafei1，2， WAN Liang1，2， HE Yong1，2，3， CEN Haiyan1，2，3*

（1.College of Biosystems Engineering and Food Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China;

2.Key Laboratory of Spectroscopy Sensing， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Hangzhou 310058， China;

3.State Key Laboratory of Modern Spectroscopic Instruments， Zhejiang University， Hangzhou 310027， China）

Abstract： Accurate acquisition of crop canopy biochemical information is of great significance for monitoring crop growth and guiding precise fertilization. Previous vertical distribution researches of crop biochemical information were mainly based on hyperspectral inversion， which was lack of the association of plant photosynthesis physiology. This study mainly investigated the vertical distribution characteristics of biochemical parameters such as chlorophyll， carotenoid， dry matter， and water content in the oilseed rape canopy under different nitrogen treatments at the mid-seedling stage. The photosynthetic performance of leaves was measured by using fast chlorophyll fluorescence technology， and linear regression and principal component analysis were further implemented to explore the internal relationship between fluorescence response and biochemical parameters. The results showed that： （1） The chlorophyll content， carotenoid content， dry matter and water content of the rape canopy at the mid-seedling stage all showed a parabolic vertical distribution， while the ratio of chlorophyll to carotenoids content gradually decreases with the leaf position and nitrogen treatments， which was the same as the vertical distribution pattern of fluorescence parameters such as driving force comprehensive performance （DFTotal） and end electron chain quantum yield （φRo） and other fluorescence parameters could be used to diagnose nitrogen stress; （2） JIP-test parameters， especially DFTotal， had a good performance to evaluate the chlorophyll/carotenoids， chlorophyll and dry matter content of oilseed rape leaves; （3） Nitrogen deficiency would weaken the PSII and PSI performance of oilseed rape leaves at the mid-seedling stage， and the maximum photochemical efficiency （φPo） could be used to diagnose nitrogen stress. There was a significant difference in the PSI performance， namely electron transfer efficiency at the end acceptors of leaves in the different leaf position， hence the comprehensive performance parameter DFTotal could be an effective characterization of the vertical heterogeneity of canopy biochemical parameters. These findings indicated the feasibility of applying the rapid chlorophyll fluorescence technology to crop biochemical information heterogeneity monitoring and provided new ideas and technical support for guiding precise fertilization and achieving high-quality and high-yield.

Key words： fast chlorophyll fluorescence transient; JIP-test; vertical heterogeneity; chlorophyll; carotenoid; nitrogen