張琳琳 呂華瑛 王琳 石亮 李克明

摘 要：為了優(yōu)化板栗殼中的黃酮類(lèi)成分的提取工藝，分別采用不同溶劑、不同提取方式浸提板栗殼中的黃酮成分，并選取提取次數(shù)、加醇量（料液比）、提取時(shí)間、醇濃度作為考察因素，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，用可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取物中總黃酮的含量，比較總黃酮提取物的收得率，優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果表明，當(dāng)選用60%乙醇回流提取，提取2次，加醇量為10倍量，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)板栗殼總黃酮提取率最高，平均提取率為19.36%。

關(guān)鍵詞：板栗殼;黃酮;提取工藝

板栗殼為殼斗科植物板栗（Castanea mollissima Bl.）的干燥外果皮，除青海、新疆以外，在遼寧以南各?。ㄊ?、區(qū)）均有栽培，作為中藥收載于《中華人民共和國(guó)藥典 四部》（2015年版）中[1]，其藥性甘、澀、平，具有降逆化痰、清熱散結(jié)、止血之功效，常用于治療反胃、消渴、咳痰、瘰疬、衄血、便血及腮腺炎等。

板栗殼為板栗的帶刺毛殼，即板栗總苞。歷代“本草”對(duì)其稱(chēng)呼不同，《證類(lèi)本草》中稱(chēng)其為“栗毛殼”，《滇南本草》中稱(chēng)其為“子上殼刺”，《本草綱目》《中華本草》《中藥大辭典》中均稱(chēng)其為“栗毛球”，江西《草藥手冊(cè)》中稱(chēng)其為“板栗殼斗”，《中國(guó)藥典》中稱(chēng)其為“板栗殼”，至今，各名稱(chēng)均有不同程度沿用。

近年研究表明，板栗殼含有豐富的黃酮、多糖、酚類(lèi)等成分[2-4]，文獻(xiàn)報(bào)道栗殼中含有豐富的天然棕色素，屬于黃酮類(lèi)，不僅可廣泛用于食品、日用化學(xué)品和藥品的著色劑，現(xiàn)代藥理研究還顯示栗殼黃酮具有抗菌、抗氧化、自由基清除等多方面作用[5-7]，故本課題系統(tǒng)研究并優(yōu)化板栗殼中黃酮類(lèi)成分的提取工藝，為其工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

板栗，濟(jì)南市售。

電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）;FA 2004分析天平（上海第二分析儀器廠）;TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;KQE-400B型超聲清洗機(jī)（濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司）;KFS-C2電子天平（凱豐集團(tuán)）。

無(wú)水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮成分測(cè)定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL（相當(dāng)于蘆丁0 μg、75 μg、150 μg、300 μg、450 μg和600 μg），加蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，各加入30%乙醇溶液4 mL和5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，振搖后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以零管為空白，以吸光度A為縱坐標(biāo)、蘆丁含量C（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程為A=11.67C-0.016 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，蘆丁溶液的濃度在0.017～0.104 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

樣品測(cè)定。取2 mL樣品按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，同樣于510 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定。

2.2 工藝流程

將板栗殼洗凈后放于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)40目篩，精密稱(chēng)取栗殼粉樣品2 g，加入一定體積的溶劑，在相應(yīng)溫度水浴和浸提時(shí)間內(nèi)浸提，浸提液經(jīng)5 000 r/min離心15 min，取上清液，定容至40 mL，放置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 不同溶劑浸提產(chǎn)率

分別采用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯為溶劑浸提板栗殼中的黃酮成分，將提取成分純化后用超純水定容至100 mL作為供試品試液，按照2.1的方法，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程得出不同浸提液中黃酮的濃度，根據(jù)公式（1）計(jì)算黃酮得率。

（1）

式（1）中，W為總黃酮產(chǎn)率，%，C為測(cè)定總黃酮的濃度，mg/mL，D為稀釋倍數(shù)，V為供試液的體積，mL，M為板栗殼的質(zhì)量，g。

不同溶劑浸提板栗殼總黃酮產(chǎn)率見(jiàn)表1。從表1可以看出，乙醇作為溶劑提取黃酮的產(chǎn)率最高。

2.4 不同濃度乙醇提取黃酮產(chǎn)率

精確稱(chēng)取板栗殼粉樣品2.00 g共18份，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入25 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%的乙醇溶液，每個(gè)處理重復(fù)3次。各組樣品均在室溫下浸泡24 h，之后減壓、抽濾，濾液放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下。將蒸干的樣品稱(chēng)重，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用30%乙醇定容至刻度，搖勻后測(cè)定，按公式（1）計(jì)算黃酮產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，從表2可以看出，55%乙醇提取的黃酮產(chǎn)率最高。

2.5 不同提取方法提取黃酮產(chǎn)率

（1）回流提取法。精確稱(chēng)取板栗殼粉樣品2.00 g，置于250 mL平底燒瓶中，加入25.0 mL的55%乙醇溶液，浸泡20 min后加熱回流提取30 min，放冷，減壓抽濾，濾液放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，測(cè)定黃酮產(chǎn)率。平行測(cè)定4份，計(jì)算平均產(chǎn)率。

（2）超聲提取法。精確稱(chēng)取板栗殼粉樣品2.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡20 min后在超聲波清洗儀上室溫超聲30 min，超聲完畢后減壓抽濾，濾液放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下，向干浸膏中加入適量30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，測(cè)定黃酮產(chǎn)率。平行測(cè)定4份，計(jì)算平均產(chǎn)率。

（3）微波輔助提取法。精確稱(chēng)取板栗殼粉樣品2.00 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡55 min（保證樣品與浸提溶劑接觸的總時(shí)間與其他方法一致），再用微波中火提取5 min（提取中每隔1～2 min停30 s），放冷，減壓抽濾，濾液放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，測(cè)定黃酮產(chǎn)率。平行測(cè)定4份，計(jì)算平均產(chǎn)率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可以看出，55%乙醇回流提取的黃酮產(chǎn)率最高。

2.6 正交設(shè)計(jì)

影響板栗殼總黃酮含量的因素主要有提取次數(shù)、加醇量（倍量）、提取時(shí)間、醇濃度，故以這4個(gè)影響因素的3個(gè)水平，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察板栗殼中總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

由表5的正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，影響總黃酮含量提取的4個(gè)因素按順序?yàn)镈>B>C>A，即提取醇濃度>加醇量>提取時(shí)間>提取次數(shù)。通過(guò)4因素3水平的考察，得出最佳提取條件為A1B3C3D3，即提取1次，加醇量為10倍量，提取時(shí)間1.5 h，提取醇濃度60%時(shí)，所得板栗殼總黃酮含量最高，為19.21%。通過(guò)方差分析表6可見(jiàn)，因素D、B、C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，綜合分析實(shí)驗(yàn)條件后選擇A2B3C3D3為最佳提取條件，即采用60%醇提取法，提取2次，加醇量為10倍量，提取時(shí)間1.5 h。在以上工藝優(yōu)選條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，平均提取率為19.36%。

3 討論

板栗營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，口感美味，受到廣大人民的喜愛(ài)，在全國(guó)栽培廣泛，但板栗殼目前大多被當(dāng)作廢棄物丟棄，造成了資源的浪費(fèi)，主要原因是人們并未意識(shí)到板栗殼的價(jià)值所在，對(duì)板栗殼的開(kāi)發(fā)利用也未普及推廣。黨的十八大提出了建設(shè)環(huán)境友好型、資源節(jié)約型社會(huì)的要求，加強(qiáng)板栗殼的開(kāi)發(fā)利用也正是響應(yīng)國(guó)家號(hào)召的一大舉措。

本文通過(guò)前期對(duì)板栗殼的藥理作用的文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的科研人員開(kāi)始重視板栗殼的重大開(kāi)發(fā)價(jià)值，對(duì)板栗殼的研究也越來(lái)越多，通過(guò)研究人們發(fā)現(xiàn)了板栗殼具有的許多藥理作用，包括抗菌抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖降血脂和改善腦缺血等人們非常關(guān)注的一些作用，當(dāng)然具體的臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究。

在本實(shí)驗(yàn)研究中通過(guò)對(duì)不同溶劑浸提板栗殼中的黃酮成分，比較總黃酮提取物的收得率，優(yōu)選最佳提取溶劑為55%乙醇提取;通過(guò)不同提取方式的研究確定了最佳提取方式為55%乙醇回流提取;通過(guò)對(duì)影響實(shí)驗(yàn)的4個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)最終確定了最佳提取工藝為選用60%的乙醇回流提取，加醇量為10倍量，提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間為1.5 h，此時(shí)板栗殼總黃酮提取率最高，為19.36%。本研究為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)及促進(jìn)栗殼的臨床藥用提供了理論依據(jù)。

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