洪亮

摘 要：PCR作為分子生物學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)，已經(jīng)在環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等眾多領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。目前，多項(xiàng)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中在微生物鑒定環(huán)節(jié)也已引入PCR檢測(cè)方法。中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)引用該方法。本文就傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法存在的問(wèn)題引出對(duì)各項(xiàng)PCR檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行列舉分析，提出各檢測(cè)方面的實(shí)際用途以及優(yōu)缺點(diǎn)，以期為未來(lái)的PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)展提供方向。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);食品;檢測(cè)

1 傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法存在的問(wèn)題

每年夏季都是食源性疾病高發(fā)期，金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌和副溶血性弧菌等都是食品中較為常見(jiàn)的致病菌，易引發(fā)人畜疾病，應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)檢，確保食品安全。目前，食品微生物檢測(cè)的國(guó)家通用標(biāo)準(zhǔn)主要為GB 4789系列，共計(jì)40多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法，大部分標(biāo)準(zhǔn)方法都是采用培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)分析。少數(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如GB 4789.6中致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)、GB 4789.42中諾如病毒檢驗(yàn)等采用了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法。傳統(tǒng)檢測(cè)方法（培養(yǎng)法）的一般流程為樣品稱量、增菌（預(yù)培養(yǎng)）、分離純化、生理生化鑒定、菌株血清分型等，菌落形態(tài)觀察、菌株生化鑒定及血清學(xué)分型等冗繁的操作歷時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件要求也較嚴(yán)苛，易導(dǎo)致漏檢，且無(wú)法滿足部分廠商要求的快速檢測(cè)周期，不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、解決問(wèn)題。此外，部分檢測(cè)用試劑毒性較大，對(duì)檢測(cè)人員身體健康也容易造成威脅。同時(shí)，對(duì)于新冠病毒等不便于培養(yǎng)的微生物來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法也無(wú)從解決檢測(cè)需求。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，微生物檢測(cè)的方法也日趨多元化、現(xiàn)代化。流式細(xì)胞儀、PCR儀（Real-time PCR、RT-PCR等）、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析測(cè)定等多種較新的檢測(cè)方法或儀器的加入[1]，也使得食品微生物檢測(cè)的靈敏度、特異性和檢測(cè)速度得到了極大的提升，這些更為快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)也更能適應(yīng)人們對(duì)食品產(chǎn)品質(zhì)量的要求。

2 PCR檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是通過(guò)儀器和試劑在體外模擬天然DNA復(fù)制的過(guò)程，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量目的基因片段，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和熒光檢測(cè)技術(shù)等對(duì)目的片段進(jìn)行分析確認(rèn)，最終可實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析。目前PCR作為分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)，目前已經(jīng)在環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等多領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用[2]，特別是新冠疫情爆發(fā)之后，基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)得到了更為廣泛的應(yīng)用，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域及鮮活農(nóng)產(chǎn)品及食品領(lǐng)域的應(yīng)用較之前更為頻繁。

PCR檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用與其在其他領(lǐng)域的應(yīng)用類似，需要特異性的引物與靶序列進(jìn)行結(jié)合引導(dǎo)反應(yīng)的開(kāi)始，整個(gè)反應(yīng)包括DNA模板的變性解鏈、復(fù)性（或稱退火）模板與引物結(jié)合、子鏈延伸等過(guò)程的不斷循環(huán)，實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，最終在短時(shí)間內(nèi)獲得更多的目的DNA片段，用于后續(xù)的凝膠電泳和基因測(cè)序等分析，以確定擴(kuò)增DNA的具體序列信息。PCR檢測(cè)技術(shù)非常適用于對(duì)生長(zhǎng)條件要求特殊，不容易實(shí)現(xiàn)常規(guī)增菌培養(yǎng)的微生物的檢測(cè)、鑒定和分型。較常采用的有常規(guī)PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、RT-PCR檢測(cè)技術(shù)以及基于PCR的基因芯片檢測(cè)技術(shù)等4種[3]。

目前在食品領(lǐng)域這4種檢測(cè)技術(shù)不僅可用于微生物檢測(cè)，還能應(yīng)用在疫病檢測(cè)、食品種質(zhì)資源鑒定、食物中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、食物中過(guò)敏源成分檢測(cè)、藥食同源樣品基源鑒定和產(chǎn)品真?zhèn)舞b別等方面。

2.1 常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用一般用于同時(shí)檢測(cè)多種食源性微生物以及對(duì)分離純化后的微生物進(jìn)行菌種鑒定等領(lǐng)域。前者主要通過(guò)在反應(yīng)體系中同時(shí)加入多種致病微生物的特異性引物以實(shí)現(xiàn)多個(gè)目的基因片段同時(shí)擴(kuò)增，共同分析，縮短檢測(cè)周期、縮減檢測(cè)費(fèi)用的目標(biāo)。后者主要用于提高傳統(tǒng)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率，防止漏檢、錯(cuò)檢，也適用于對(duì)未知菌株進(jìn)行鑒定分型，為食品生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中準(zhǔn)確分析污染源和制定針對(duì)性的除菌措施提供指導(dǎo)方向[4]。但是常規(guī)PCR技術(shù)雖然造價(jià)較便宜，應(yīng)用最為廣泛，但是也只能單純的用作基因擴(kuò)增，后續(xù)的基因分析還需要借助電泳技術(shù)、熒光檢測(cè)技術(shù)或測(cè)序技術(shù)才能達(dá)到最終的檢測(cè)目標(biāo)。而且在后續(xù)染色環(huán)節(jié)還會(huì)用到溴化乙錠，易對(duì)檢測(cè)人員的身體健康造成威脅。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入熒光信號(hào)再利用儀器對(duì)信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)行定量和定性分析的方法。利用該技術(shù)對(duì)食品微生物進(jìn)行分析，可以避免在檢測(cè)過(guò)程中的交叉污染，也省去了后續(xù)溴化乙錠等有毒物質(zhì)染色及紫外熒光檢測(cè)等步驟，自動(dòng)化程度更高，特異性更強(qiáng)。當(dāng)前，食品中多種致病菌檢測(cè)以及霉菌、酵母、乳酸菌等定性及定量檢測(cè)都可采用該方法[5]，雖然設(shè)備成本相對(duì)較高，但是節(jié)省人力，且更為精準(zhǔn)，目前應(yīng)用較為廣泛[6-8]。

2.3 基于PCR的基因芯片檢測(cè)技術(shù)

基因芯片是目前較先進(jìn)的一種高通量核酸分子雜交技術(shù)，它通過(guò)原位合成或顯微打印技術(shù)將核酸分子探針按照擬定的順序固定到固相介質(zhì)芯片的表面，在將樣品的核酸分子提取經(jīng)PCR擴(kuò)增后與該具有高密度的寡核苷酸陣列的芯片上的探針進(jìn)行雜交，最后再借助熒光掃描等技術(shù)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，以確定樣品中特定微生物的存在情況[9]。

大部分食品營(yíng)養(yǎng)較為豐富，同時(shí)具備碳源、氮源、生長(zhǎng)因子等微生物生長(zhǎng)需要的成分，適合多種微生物的生長(zhǎng)繁殖，因此很多食品樣品中微生物的種類較為繁雜、品種分布隨機(jī)性強(qiáng)，而傳統(tǒng)的增菌、培養(yǎng)、純化鑒定等方法可能會(huì)導(dǎo)致部分低豐度以及不容易培養(yǎng)的微生物漏檢，常規(guī)PCR多限于檢測(cè)幾種微生物的基因，無(wú)法全面分析食品受污染的具體狀況，對(duì)于生產(chǎn)者改良工藝提升產(chǎn)品質(zhì)量指導(dǎo)意義不強(qiáng)。而基因芯片具備的高通量、高度自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，可以為食品微生物種類研究、致病菌毒力研究、藥敏基因檢測(cè)等提供有力的數(shù)據(jù)支持[10-11]。此方法準(zhǔn)確度高、可操作性強(qiáng)，但是成本相對(duì)較高，目前在食品微生物檢測(cè)中應(yīng)用尚不廣泛[6]。但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因芯片的制作成本日益下降，相信在不久的將來(lái)，應(yīng)該也會(huì)得到大范圍的應(yīng)用。

2.4 RT-PCR檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是通過(guò)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過(guò)常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）實(shí)現(xiàn)在體外快速擴(kuò)增cDNA的過(guò)程。該技術(shù)多用于檢測(cè)食品中RNA病毒污染，例如新冠病毒等檢測(cè)。疫情期間，三文魚、櫻桃等檢測(cè)出新冠病毒，多采用該法進(jìn)行。但是該法使用范圍較窄，一般僅用于以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒的檢測(cè)中，其他微生物檢測(cè)不適用于該法。

3 結(jié)語(yǔ)

由微生物（致病細(xì)菌、生物毒素、病毒等）造成的食源性危害嚴(yán)重時(shí)可危及生命，檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步使得人們能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)，預(yù)防其對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害。目前基于PCR技術(shù)的食品微生物檢測(cè)應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，商業(yè)化程度較高，它一方面可以用于檢測(cè)食品中的致病菌存在情況，從而有效防止食源性風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生，另一方面也可以對(duì)食品中的菌相進(jìn)行分析，對(duì)于食品發(fā)酵和食品工藝改進(jìn)等方面也有重大意義。此外，在水生動(dòng)物疫病檢測(cè)、畜禽疫病檢測(cè)、農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定、食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、食品中過(guò)敏源檢測(cè)、物種鑒定、中藥材及食品真?zhèn)舞b別等方面，PCR作為基礎(chǔ)技術(shù)也被廣泛應(yīng)用?？傊?，無(wú)論是植物源食品還是動(dòng)物源食品，只要是涉及基因檢測(cè)，就一定會(huì)使用到PCR技術(shù)，PCR已經(jīng)成為檢測(cè)技術(shù)中最為常見(jiàn)的基礎(chǔ)技術(shù)手段[12]。

目前，雖然PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是基于PCR的食品微生物檢測(cè)技術(shù)對(duì)于復(fù)雜樣品仍然存在背景干擾和假陽(yáng)性等諸多問(wèn)題，為了更好地防范由有害微生物污染帶來(lái)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步探索針對(duì)不同樣品合適的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，摸索開(kāi)發(fā)出更靈敏、快捷、準(zhǔn)確、通用的檢測(cè)技術(shù)條件也迫在眉睫。此外，圍繞PCR進(jìn)行的很多化學(xué)試劑、酶、儀器等成本相對(duì)還是較高，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和機(jī)械工業(yè)不斷發(fā)展，試劑耗材儀器成本的降低，相信PCR技術(shù)的使用前景將更為廣闊。

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