董慧明

摘 要：為提高微生物實驗室金黃色葡萄球菌的檢測能力，于2020年參加乳粉中金黃色葡萄球定量檢測能力驗證，依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）進(jìn)行檢驗，同時應(yīng)用科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色平板和3M金黃色葡萄球菌測試片作為對照手段進(jìn)行實驗，并應(yīng)用VITEK2進(jìn)行生化鑒定，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，樣品CODE TF02490061結(jié)果報告為1 100 CFU/g、樣品CODE TF02490062結(jié)果報告為4 800 CFU/g，反饋結(jié)果為滿意，z值均<2。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌;能力驗證;平板計數(shù)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種食源性病原菌，為無芽孢、無鞭毛的革蘭氏陽性球菌。金黃色葡萄球菌是食品致病菌污染主要的病原菌，其產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒，導(dǎo)致腹瀉和上呼吸道感染[1];該菌也可以引起局部化膿炎癥感染、肺炎、心包炎等，甚至導(dǎo)致敗血癥、膿毒癥等全身感染[2]。

能力驗證活動是利用實驗室間的比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價參加者的能力[3]。為有效提高實驗室檢測水平和人員技術(shù)能力，遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心于2020年參加了中國食品藥品檢定研究院組織的乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測（NIFDC-PT-249）能力驗證。

1 材料與方法

1.1 樣品

待測能力驗證樣品為兩件，每件樣品由1個菌球及相應(yīng)奶粉組成，編碼分別為CODE TF02490061、CODE TF02490062。在生物安全柜內(nèi)將金黃色葡萄球菌樣品的西林瓶打開，將西林瓶內(nèi)小球加入到225 mL無菌生理鹽水稀釋液中，充分溶解，然后再將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述稀釋液中，充分均質(zhì)混勻。依此方法，分別對2件樣品進(jìn)行處理。

1.2 試劑和儀器

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538及表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12228，購自廣東環(huán)凱微生物有限公司;Baird-Parker平板（B-P平板）、0.85%無菌生理鹽水、平板計數(shù)瓊脂（PCA）、革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯（BHI），均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;凍干兔血（美國BD公司）;漿金黃色葡萄球菌顯色平板（法國科瑪嘉公司）;金黃色葡萄球菌測試片（美國3M公司）;革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡（GP卡）（法國梅里埃公司）。

A2型生物安全柜（美國NUAIRE公司）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder公司）;生物顯微鏡（日本奧林帕斯公司）;高壓滅菌鍋（日本Tomy公司）;均質(zhì)器（法國梅里埃公司）;VITEK 2全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（法國梅里埃公司）。

1.3 方法

依據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書及《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）[4]第二法平板計數(shù)法進(jìn)行檢測。同時用科瑪嘉金葡顯色平板和金葡測試片作為對照手段進(jìn)行實驗，金葡顯色平板每皿接種量為0.1 mL，3M金葡測試片每片接種量為1 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型菌落計數(shù)

金黃色葡萄球菌在B-P平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2～3 mm，顏色灰黑至黑色，有光澤，周圍有不透明圈（沉淀環(huán)），其外有一透明圈（卵磷脂環(huán)），菌落有黃油樣粘稠感;在金葡顯色培養(yǎng)基上顯紫紅色，其他菌顯藍(lán)綠色或無色;在3M金葡測試片上為紫紅色點，需要確認(rèn)片進(jìn)行確認(rèn)。典型菌落特征見圖1。

選擇同一稀釋度所有典型菌落數(shù)合計在20～200 CFU的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。金黃色葡萄球菌3種計數(shù)方法結(jié)果見表1，可見3種方法結(jié)果無明顯差異，3個結(jié)果都在同一數(shù)量級上。

2.2 確證試驗（鑒定）

從CODETF02490061和CODE TF02490062適宜稀釋度的B-P平板典型菌落中選取5個菌落，分別做革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗，并應(yīng)用VITEK2進(jìn)行生化鑒定，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2.1 染色鏡檢

取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性球菌，直徑為0.5～1.0 μm，顯微鏡下排列成葡萄串狀排列。

2.2.2 血漿凝固酶試驗

挑取B-P平板上典型菌落5個，進(jìn)行血漿凝固酶試驗，同時以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉湯培養(yǎng)物作對照，典型菌落和陽性菌株對照血漿凝固酶試驗均在2 h產(chǎn)生凝固，陰性菌株對照菌株觀察6 h不產(chǎn)生凝固。典型菌落均為血漿凝固酶陽性，陽性比例為100%。

2.2.3 VITEK2生化鑒定

將挑取B-P平板上典型菌落劃線接種至PCA平板，36 ℃

培養(yǎng)24 h，取新鮮培養(yǎng)的菌落進(jìn)行VITEK2生化儀器鑒定，鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌，說明B-P平板對金黃色葡萄球菌的選擇性非常好，特征明顯能夠明確區(qū)別于其他葡萄球菌。

2.3 結(jié)果報告及反饋

以國家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為本次能力驗證的報告結(jié)果，即證實為金黃色葡萄球菌菌落陽性比例乘以相應(yīng)稀釋度B-P平板計數(shù)典型菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，為樣品中金黃色葡萄球菌結(jié)果報告數(shù)，單位為CFU/g。編號CODE TF02490061樣品結(jié)果報告為1 100 CFU/g，編號CODE TF02490062樣品結(jié)果報告為4 800 CFU/g。

經(jīng)能力驗證組織機構(gòu)反饋，本實驗室CODE TF02490061

金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果為3.041，指定值為3.176，z值為-0.5;CODE TF02490062金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果為3.681，指定值為3.712，z值為-0.1;z值均<2，兩個樣品的結(jié)果評價為滿意。

3 結(jié)論與討論

本能力驗證中采用多種方法同步進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測，以保證實驗室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。3種計數(shù)方法結(jié)果無明顯差異，3個結(jié)果均在同一數(shù)量級上，說明實驗準(zhǔn)確無誤，B-P平板與金葡顯色平板計數(shù)結(jié)果相近，而3M金葡測試片計數(shù)結(jié)果略低。金葡測試片中相對營養(yǎng)成分較少，且含有抑制其他菌生長的物質(zhì)[5]，故其檢測結(jié)果略低。最后的結(jié)果報告以B-P平板上菌落數(shù)為主，金葡顯色平板和3M金葡測試片上的菌落數(shù)為參考，經(jīng)反饋兩個樣品的結(jié)果評價為滿意。

金黃色葡萄球菌檢測的關(guān)鍵控制點，①在實驗前將B-P平板提前放在培養(yǎng)箱中，使平板表面干燥。涂布時用L棒小心涂勻，注意不要觸及平板邊緣，涂布后先正置培養(yǎng)，保證水分完全吸收后再倒置培養(yǎng)，以免細(xì)菌在平板邊緣縫隙生長，影響觀察計數(shù)。②進(jìn)行血漿凝固酶試驗時，以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉湯培養(yǎng)物作對照，典型菌落和陽性菌株對照血漿凝固酶試驗應(yīng)在6 h內(nèi)產(chǎn)生凝固，陰性菌株對照菌株觀察6 h不產(chǎn)生凝固，以確保血漿凝固酶試驗準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)

[1]曾博雅.食品微生物金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證[J].現(xiàn)代食品，2020（11）：176-177.

[2]劉云國.食品衛(wèi)生微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[3]中國合格評定國家認(rèn)可委員會.能力驗證規(guī)則：CNAS-RL02：2018[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[4]國家食品藥品監(jiān)督管理總局，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5]范田麗，付曉靜，吳海江.金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結(jié)果與分析[J].現(xiàn)代食品，2020（3）：196-198.