季艷杰，羅 浩，蔡海燕，劉欣宇，金詩佳，粟深月，徐含章，雷 虎，吳英理

1.上海交通大學醫(yī)學院病理生理學教研室，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025；2.濰坊醫(yī)學院基礎醫(yī)學院臨床病理系，濰坊 261053

泛素特異性蛋白酶2a（ubiquitin-specific protease 2a，USP2a）屬于去泛素蛋白酶家族。該家族約有100個成員，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化修飾，影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、細胞內(nèi)定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，從而在細胞增殖、DNA損傷修復、細胞代謝、干細胞自我更新、免疫調(diào)節(jié)等多個方面發(fā)揮作用。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)USP2a及其底物的過表達，如侵襲性淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌和預后不良的乳腺癌［1］。USP2a可以調(diào)節(jié)一些重要的腫瘤相關蛋白，如脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）、β連環(huán)素（β-catenin）、鼠雙微體蛋白2（murine double minute 2，MDM2）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosisfactor receptor-associated factor 6，TRAF6）等［2-6］。因此，USP2a是良好的抗腫瘤靶點。但是，現(xiàn)有USP2抑制劑的效能相對較低，尚無可用于臨床的特異性USP2抑制劑，USP2抑制劑的篩選和研究仍處于起步階段。

天然藥物用于疾病治療歷史悠久，是抗腫瘤藥物的重要來源。齊墩果酸是從龍膽科植物獐牙菜屬的青葉膽全草或女貞子的果實中分離提取而得到的一種五環(huán)三萜類化合物。甲基巴多索隆（bardoxolone methyl，CDDOMe）是以齊墩果酸為先導物和前體發(fā)展起來的，其通過與Kelch樣ECH相關蛋白（Kelch-like ECH-associated protein 1，KEAP1）結合并激活核轉錄因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，NRF2），促進NRF2向細胞核轉運，并與靶基因啟動子中的抗氧化反應元件結合，進而誘導表達抗氧化相關蛋白及細胞保護酶。CDDO-Me也可以通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥途徑，減少促炎信號的產(chǎn)生。因此，CDDO-Me在抗氧化、抗炎和抗癌等方面展現(xiàn)出了巨大潛力［7］。過去的研究［8］表明，五環(huán)三萜類化合物可能具有泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，USP）的抑制活性。本研究通過篩選天然化合物發(fā)現(xiàn)CDDO-Me在體外能夠抑制USP2a活性，并以三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）細胞作為疾病細胞模型，探究CDDO-Me對TNBC細胞中USP2a蛋白的作用，以及對細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與質(zhì)粒

人TNBC細胞株MDA-MB-231和MDA-MB-231-LN2由上海交通大學醫(yī)學院趙倩課題組饋贈，人TNBC細胞株MDA-MB-468由上海交通大學醫(yī)學院鐘清課題組饋贈。

原核表達質(zhì)粒pET28a-His-USP2a core和pGEX-6P-1-GST-UbA52，以及USP2a過表達質(zhì)粒pLVX-USP2a由本實驗室構建和保存。空載pLVX質(zhì)粒購自美國Addgene公司。

1.2 主要試劑與儀器

CDDO-Me、安羅替尼（anlotinib）（Sigma，美國），科羅索酸（corosolic acid）、齊墩果酸（oleanolic acid）、熊果酸（ursolic acid）、地膚子皂苷（momordin lc）、補骨脂酚（bakuchiol）、丹酚酸a（salvianolic acid A）（普利斯，中國），Japonicone A（由上海交通大學藥學院金惠子課題組饋贈），抗USP2多克隆抗體（Abcam，英國），抗β-catenin抗體、抗TRAF6抗體、抗胱天蛋白酶3（caspase3）抗體、抗cleaved-caspase3抗體（CST，美國），抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly（ADPribose）polymerase1，PARP1］抗體（Abclonal，中國），抗β肌動蛋白（β-actin）抗體、抗黏著斑蛋白（vinculin）抗體（Abways，中國），辣根過氧化物酶（HRP）標記的鼠源或兔源二抗（雅酶，中國），快速考馬斯亮藍染色液（中暉赫彩，中國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、Opti-MEM培養(yǎng)基（ThermoFisher，美國），細胞活性檢測試劑盒8（cell counting kit-8，CCK8）（諾唯贊，中國），碘化丙啶（propidium iodide，PI）（BD，美國）。

細胞計數(shù)儀（Beckman，美國），Western blotting設備（Bio-Rad，美國），多功能酶標儀（BioTek，美國），流式細胞儀（BD，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 泛素特異性蛋白酶抑制劑篩選 篩選系統(tǒng)的原理是去泛素化蛋白酶能夠使底物去泛素化。在體外測試體系中，去泛素化蛋白酶USP2a可以使GST-UbA52（UbA52是常用的去泛素化蛋白酶的底物，由Ub和A52兩個結構域構成；GST為谷胱甘肽巰基轉移酶，屬標簽蛋白）發(fā)生剪切。GST-UbA52（相對分子質(zhì)量45 000）被剪切后，會產(chǎn)生2個片段，其中較大的片段為GST-Ub（相對分子質(zhì)量36 000）。電泳后，用考馬斯亮藍染色法可以清楚地看到GST-UbA52被剪切的條帶。當反應體系中的化合物具有抑制去泛素化蛋白酶活性的時候，剪切的產(chǎn)物減少。

USP2a和GST-UbA52蛋白純化按照本實驗室報道的方法［9］。USP2a抑制劑篩選系統(tǒng)緩沖液含1 mmol/L EDTA-Na2、0.5 mmol/L DTT、50 mmol/L Tris-HCl。設置空白組（緩沖液）、DMSO組（USP2a蛋白、DMSO、緩沖液）、藥物組（USP2a蛋白、小分子藥物、緩沖液）。各組加樣后混勻離心，37℃孵育15 min，使小分子藥物和USP2a蛋白結合。然后各組分別加入GST-UbA52蛋白（體系中USP2a蛋白濃度為125 nmol/L，GST-UbA52蛋白濃度為1μmol/L），混勻離心后37℃孵育25 min，使GST-UbA52被剪切。加入5×SDS裂解液，95℃加熱5 min。最后取15μL進行蛋白電泳，考馬斯亮藍染色。利用ImageJ軟件對各組的GST-UbA52條帶進行灰度掃描，GraphPad Prism 8.0軟件分析得到CDDO-Me抑制USP2a活性的50%抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。抑制率計算公式：抑制率=（藥物組灰度值-DMSO組灰度值）/（空白組灰度值-DMSO組灰度值）×100%。

1.3.2 分子對接分析 使用軟件AutoDock4.2進行分子對接分析［10］。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb）中檢索了USP2催化域（PDB ID：2HD5）的X射線衍射晶體結構，用于分子對接計算［11］。為了準備蛋白質(zhì)和小分子的結構，首先添加所有氫原子，計算Gasteiger電荷，并合并非極性氫。使用AutoGrid4準備格點文件，格點中心定義為USP2晶體結構中Tyr514殘基的坐標中心，圍繞中心定義一個70×70×70（格點數(shù)）的盒子，格點間距為0.375?（1?=0.1 nm）。在對接分析中，USP2蛋白質(zhì)被認為是剛性的，對接參數(shù)的設置與之前的研究［12］相同；使用Lamarckian遺傳算法解釋蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用；最后，根據(jù)預測的結合自由能選擇構象。

1.3.3 細胞培養(yǎng) 細胞均使用高糖DMEM培養(yǎng)基在含有5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10%FBS以及100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，根據(jù)細胞生長狀態(tài)及時更換培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.4 細胞熱遷移實驗 收取至少1×107個目的細胞進行細胞熱遷移實驗（cellular thermal shift assay，CETSA）。用PBS（按1∶100加入蛋白酶抑制劑Cocktail）重懸細胞。將細胞懸液放入液氮中2～3 min，然后室溫融化，重復3次；4℃下，20 000×g離心20 min。取上清液，分成2份，分別加入50μmol/L CDDO-Me和等體積DMSO，充分混勻后在37℃孵育30 min。然后分到八連管中，在PCR儀上加熱3 min（設置不同的溫度梯度：52.0～64.1℃），室溫冷卻3 min。處理完成的樣品于4℃20 000×g離心20 min，吸取上清液（盡量不吸到沉淀）至新的EP管中，加入等體積2×SDS裂解液，95℃加熱5 min使蛋白變性，離心取上清液進行Western blotting檢測。

1.3.5 Western blotting分析 細胞經(jīng)PBS清洗后加入2×SDS裂解液；95℃加熱5 min，置于冰上5 min，重復3次。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上。封閉1 h后加入一抗，4℃孵育過夜。次日用1×TBST緩沖液洗滌后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后進行化學發(fā)光顯影。

1.3.6 質(zhì)粒轉染 采用瞬時轉染的方法，分別將質(zhì)粒pLVX（pLVX組）和pLVX-USP2a（pLVX-USP2a組）轉染到MDA-MB-468細胞中。首先，將MDA-MB-468細胞接種在10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至密度達60%～70%時開始轉染。將10μg質(zhì)粒和25μg PEI分別加入500μL Opti-MEM中，混勻靜置5 min；然后將質(zhì)?；旌弦杭拥絇EI混合液中，混勻靜置20 min后滴加到細胞中，4～6 h換液1次，持續(xù)48 h或72 h。

1.3.7 CCK8檢測 將MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-231-LN2細胞接種于96孔板中，設置空白組、陰性組（加入DMSO）和CDDO-Me處理組（2.5、5、10μmol/L），并在加樣孔周圍的邊孔中加入等體積的培養(yǎng)液。細胞處理后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個孔中滴加CCK8試劑，混勻后放置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每隔0.5 h用酶標儀檢測一次吸光度值（D），檢測波長為450 nm?？刂脐幮越M的D（450 nm）值介于0.8～1.2，以1.0左右為最佳；根據(jù)檢測結果，計算CDDO-Me對細胞的增殖抑制率：增 殖 抑 制 率=［（D陰性組-D空白組）-（D處理組-D空白組）］/（D陰性組-D空白組）×100%。

1.3.8 臺盼藍拒染法 將MDA-MB-468細胞以3×105個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加2 mL細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，每個處理組設3個復孔。待細胞貼壁后，以不同濃度的CDDO-Me（0、0.5、1、2μmol/L）處理細胞24 h，取細胞懸液與臺盼藍溶液以1∶1的比例均勻混合，然后在細胞計數(shù)儀下計數(shù)藍染（死亡）及不染色（存活）的細胞數(shù)。

1.3.9 細胞周期檢測 收集至少1×106個MDA-MB-468細胞，預冷PBS洗3次，離心棄上清液，輕彈殘留的PBS使細胞團塊散開，滴加預冷的75%乙醇，-20℃固定過夜。離心收集細胞沉淀并用PBS重懸細胞，加入RNA酶，37℃孵育30 min。離心棄上清液，加入PI染液，室溫避光孵育15 min。上機前用孔徑300μm尼龍網(wǎng)膜過濾細胞，用流式細胞儀檢測，結果數(shù)據(jù)用Flowjo10軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CDDO-Me在體外對USP2a活性的抑制作用

首先，利用USP抑制劑篩選系統(tǒng)對多種天然化合物進行篩選，發(fā)現(xiàn)CDDO-Me可以抑制USP2a對GSTUbA52的切割，由此推測CDDO-Me可能是USP2a的抑制劑（圖1A）。然后我們對CDDO-Me進行倍比稀釋，測試不同濃度CDDO-Me在體外對USP2a活性的抑制作用（圖1B）。利用ImageJ軟件對各組的GST-UbA52條帶進行灰度掃描，GraphPad Prism 8.0軟件分析得到CDDO-Me體外抑制USP2a活性的IC50是3.84μmol/L（圖1C）。

圖1 CDDO-Me在體外對USP2a活性的抑制作用Fig 1 Inhibition of CDDO-Meon theactivity of USP2a in vitro

2.2 CDDO-Me與USP2分子對接分析結果

為了進一步明確CDDO-Me與USP2之間的作用關系，我們通過分子對接分析軟件在蛋白質(zhì)結構水平探索它們的結合方式。分析結果顯示，CDDO-Me與USP2的H456殘基之間形成氫鍵，與F409和Y514殘基之間具有疏水相互作用。CDDO-Me分子鍵合到USP2催化裂隙附近的狹窄口袋中（圖2）。

圖2 USP2a與CDDO-Me結合的分子對接分析Fig 2 Predicted interaction between CDDO-Me and USP2aby molecular docking

2.3 CDDO-Me與TNBC細胞中USP2a的相互作用

為明確CDDO-Me是否能與TNBC細胞中的USP2結合，我們分別收取至少1×107個MDA-MB-231、MDAMB-468、MDA-MB-231-LN2細胞，液氮反復凍融獲取細胞裂解液后，將CDDO-Me與細胞裂解液孵育后進行CETSA實驗。Western blotting結果顯示，與對照組（DMSO）相比，在不同的溫度（60℃以下）環(huán)境下檢測到CDDO-Me處理組的USP2a蛋白水平更高；提示CDDO-Me能靶向結合TNBC細胞中的USP2a，從而使其更加穩(wěn)定（圖3）。

圖3 CETSA實驗檢測CDDO-Me與USP2a在TNBC細胞內(nèi)的結合情況Fig 3 Interaction between CDDO-Me and USP2ain the TNBCcellsdetected by CETSAassay

2.4 CDDO-Me對USP2a底物水平的影響

鑒于CDDO-Me在體外對USP2a具有抑制作用，本研究在細胞水平進一步檢測USP2a底物蛋白水平是否受CDDO-Me的影響。取MDA-MB-468細胞以3×105個/mL的密度接種在6孔板中，細胞貼壁后用2μmol/L CDDOMe處理不同時間（0、6、12、24 h）。Western blotting實驗發(fā)現(xiàn)，處理12 h后USP2a底物β-catenin和TRAF6蛋白水平即明顯降低（圖4A）。把質(zhì)粒pLVX和pLVX-USP2a瞬時轉染到MDA-MB-468細胞中，48 h后用2μmol/L CDDO-Me分別處理pLVX組和pLVX-USP2a組細胞，12 h后進行Western blotting實驗。結果顯示，與pLVX組相比，pLVX-USP2a組細胞中β-catenin和TRAF6的蛋白水平未出現(xiàn)明顯減少（圖4B）。

圖4 CDDO-Me對MDA-MB-468細胞中USP2a底物蛋白水平的影響Fig 4 Effectsof CDDO-Me on thelevelsof USP2asubstrateproteinsin the MDA-MB-468 cells

2.5 CDDO-Me對TNBC細胞增殖以及凋亡的影響

利用CCK8試劑盒檢測不同濃度（2.5、5、10μmol/L）CDDO-Me對MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-231-LN2細胞增殖的影響；結果顯示，隨著CDDO-Me濃度的升高，其對3種TNBC細胞的抑制率均逐漸升高（圖5A）。

為了檢測CDDO-Me對TNBC細胞凋亡的影響，取經(jīng)不同濃度CDDO-Me處理的MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-231-LN2細胞，Western blotting檢測后發(fā)現(xiàn)，2μmol/L CDDO-Me處理24 h可導致3種TNBC細胞發(fā)生caspase3蛋白活化以及PARP1蛋白的剪切（圖5B～D）。

圖5 CDDO-Me對TNBC細胞增殖和凋亡的影響Fig 5 Effectsof CDDO-Me on theproliferation and apoptosis of TNBCcells

2.6 MDA-MB-468細胞中過表達USP2a對CDDO-Me增殖抑制作用的影響

為探討USP2a在CDDO-Me生物學效應中的重要性，在MDA-MB-468細胞中瞬時轉染了pLVX或pLVX-USP2a質(zhì)粒，轉染后48 h和72 h pLVX-USP2a組較pLVX組USP2a蛋白水平顯著升高（圖6A）。臺盼藍拒染法結果顯示，MDA-MB-468細胞轉染質(zhì)粒后48 h再以不同濃度CDDO-Me處理24 h，PLVX-USP2a組的活細胞數(shù)目顯著多于pLVX組（圖6B）。流式細胞術檢測細胞周期結果顯示，經(jīng)1μmol/L CDDO-Me處理24 h后，pLVX組細胞出現(xiàn)明顯的S期和G2/M期阻滯（圖6C），而PLVX-USP2a組細胞則沒有明顯的細胞周期阻滯（圖6D）。

圖6 MDA-MB-468細胞中過表達USP2a對CDDO-Me增殖抑制作用的影響Fig 6 Effects of overexpression of USP2a in the MDA-MB-468 cells on CDDO-Me proliferation inhibition

3 討論

USP2a在TNBC干細胞群中表達上調(diào)，抑制USP2a可顯著抑制干細胞群的自我更新、增殖和耐藥性，因此USP2a被認為是一個新的TNBC治療靶標［13］。本研究證實，CDDO-Me可通過直接抑制USP2a的活性抑制TNBC細胞的增殖和存活。

本研究發(fā)現(xiàn)CDDO-Me是USP2a的抑制劑，證據(jù)如下：①利用USP抑制劑篩選系統(tǒng)進行體外篩選，發(fā)現(xiàn)CDDO-Me能夠在體外抑制USP2a活性。②CDDO-Me與USP2a的分子對接結果顯示，CDDO-Me可鍵合到USP2催化裂隙附近的狹窄口袋中，并與His456殘基之間形成氫鍵，與Phe409和Tyr514殘基之間具有疏水相互作用。③CETSA實驗證明CDDO-Me可以與TNBC細胞內(nèi)的USP2a相互結合，增加其蛋白穩(wěn)定性。④Western blotting和CCK8實驗結果表明在MDA-MB-468細胞內(nèi)過表達USP2a可以減弱CDDO-Me導致的USP2a底物水平下調(diào)、細胞周期阻滯和增殖抑制效應。

CDDO-Me是一個多靶標分子，能夠影響腫瘤細胞分化、增殖、凋亡和自噬相關的諸多信號通路［14］。CDDO-Me在乳腺癌中的作用也有報道。Wnt/β-catenin過表達是導致轉錄因子激活的最常見途徑，其負責刺激干細胞中的上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉變。此外，β-catenin蛋白的過度表達和累積會刺激細胞遷移，從而導致腫瘤轉移［15］。有報道［16］稱，CDDO-Me可以抑制乳腺癌細胞的細胞活力、增殖、集落形成、干性和鼠乳腺腫瘤病毒（mouse mammary tumor virus，MMVT）-Wnt1轉基因小鼠的腫瘤生長，這些抑制作用是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)的。也有研究［17］發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，減輕乳腺腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，增強CD8+T細胞腫瘤浸潤，可作為乳腺癌、黑色素瘤和其他癌癥潛在的免疫療法。另外，用CDDOMe處理乳腺癌易感基因1（breastcancer susceptibility gene1，Brca1）缺陷的小鼠的乳腺，可以抑制小鼠腫瘤組織中受體酪氨酸激酶ErbB2（屬表皮生長因子受體家族）的組成型磷酸化；在BRCA1缺陷細胞系中發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me直接與ErbB2相互作用，降低ErbB2的組成型磷酸化，抑制增殖，并誘導G0/G1期阻滯［18］。目前，有關CDDO-Me在TNBC中直接靶標的報道比較少見。本研究表明，USP2a是CDDO-Me的直接作用靶標。在MDA-MB-468細胞中，CDDO-Me能夠通過抑制USP2a的活性下調(diào)β-catenin和TRAF6的蛋白水平；這在一定程度上解釋了此前報道的CDDO-Me對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。此外，有報道［19-20］稱TRAF6在乳腺癌中高表達，促進乳腺癌的增殖與轉移；CDDO-Me可能通過促進TRAF6降解而抑制乳腺癌的增殖與轉移。本課題組曾報道過CDDO-Me可以抑制泛素特異性蛋白酶7（ubiquitinspecific protease7，USP7）的活性［12］。USP7在乳腺癌中被認為是一個癌基因，通過介導組蛋白甲基化酶鋅指蛋白8（plant homeodomain finger protein 8，PHF8）的穩(wěn)定性促進乳腺癌的發(fā)生［21］。因此，尚不能排除有USP7參與了CDDO-Me在TNBC細胞中發(fā)揮的效應。在TNBC細胞中，CDDO-Me可能同時抑制了USP2a和USP7的活性，進而抑制細胞增殖和存活。

體外實驗顯示，CDDO-Me對正常細胞的毒性不大，包括人成纖維細胞［22］、外周血單核細胞［23］和乳腺正常上皮細胞［24］，因此其作用具有一定的特異性。CDDOMe目前已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于奧爾波特綜合征和肺動脈高壓治療的Ⅱ期臨床試驗。然而，CDDO-Me在治療Ⅱ型糖尿病慢性腎病的Ⅲ期臨床試驗中的結果顯示，給藥組心血管事件發(fā)生率更高。因此，CDDO-Me還有待進一步完善。就USP2a抑制劑而言，CDDO-Me與現(xiàn)有USP2a抑制劑的結構不同，可為發(fā)展USP2a抑制劑提供新的骨架。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CDDO-Me可抑制USP2a活性，進而抑制TNBC細胞增殖以及誘導細胞凋亡；本研究也為開發(fā)新的USP2a抑制劑提供了先導化合物。

參·考·文·獻

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