魏 倩，張穎婷，林龍帥，，何恩俊，何詠元，蘇瀅泓，段澄澄，王斯源，趙慶華，趙 倩，3，賀 明

1.上海交通大學醫(yī)學院病理生理學系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025；2.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院骨科，上海 201620；3.上海交通大學應激與腫瘤創(chuàng)新單元（2019RU043），中國醫(yī)學科學院，上海 200025

鐵死亡（ferroptosis）是一種由大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和活性氧（reactiveoxygen species，ROS）堆積而導致的鐵依賴的調(diào)控性細胞死亡［1-2］。在生化特征上，鐵死亡主要表現(xiàn)為鐵沉積和脂質(zhì)過氧化［3-4］，其中鐵沉積通過芬頓反應產(chǎn)生高活性的羥基自由基或激活脂氧合酶來促進氧化損傷［4］。同時，氧自由基與生物膜上的磷脂以及多不飽和脂肪酸等分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，形成大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）和丙二醛（malondialdehyde，MDA），從而使細胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變，進而導致細胞發(fā)生損傷［5］。同時，鐵死亡誘導劑可以引起基因表達的改變從而誘導細胞脂質(zhì)過氧化或死亡，包括前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandinendoperoxide synthase2，PTGS2）［3］和?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetaselong-chain family member 4，ACSL4）［6］表達明顯增加，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）表達下調(diào)。

鐵死亡在多種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7］。在酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）的研究中，酒精飲食誘導肝臟鐵死亡，而且，酒精性肝損傷可以顯著被鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）所抑制［8-9］。近年來的研究［10］發(fā)現(xiàn)，鐵代謝紊亂引起的細胞內(nèi)鐵超載是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及NASH加重的病因之一，提示鐵死亡在NASH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。而且，多種藥物可以通過調(diào)節(jié)相應的基因表達誘導肝星狀細胞（hepatic stellatecells，HSCs）發(fā)生鐵死亡從而抑制肝纖維化的發(fā)展［11］。而單純長期的高鐵飼料飼喂是常用的鐵死亡動物模型［12-14］，高鐵飼料可以使肝臟發(fā)生鐵沉積，進而引起肝細胞鐵死亡的發(fā)生。研究［12］表明，由高鐵飲食誘導的小鼠肝細胞死亡可以被鐵死亡抑制劑Fer-1和去鐵胺（deferoxamine，DFO）顯著緩解，而其他細胞死亡形式的抑制劑沒有這種效果。目前高鐵飲食導致肝細胞鐵死亡的機制仍不明確，探尋新的介導肝細胞鐵死亡的信號分子和機制對于肝病治療非常必要。

結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp）是肝臟合成的一種急性期時相反應蛋白（acute phase protein，APP）。作為主要的血漿蛋白之一，Hp蛋白的主要功能是與游離血紅蛋白（hemoglobin，Hb）結(jié)合成穩(wěn)定復合物，使肝臟回收血紅素鐵進行代謝，以防止腎臟受損［15］。同時Hp多態(tài)性可引起血紅蛋白結(jié)合能力、抗氧化和鐵循環(huán)活性的改變，在細胞的氧化應激反應中具有重要作用［15］。臨床研究［16］發(fā)現(xiàn)，嚴重肝病時血清Hp表達水平降低。而且Hp也可以作為早期預測和診斷肝硬化患者發(fā)生肝細胞癌的潛在標志物［17］。但是Hp在正常肝細胞發(fā)生鐵死亡過程中是否發(fā)揮作用以及作用的機制尚未見報道。

本研究結(jié)合RNA測序（RNA-sequencing，RNA-seq）技術(shù)和生物信息技術(shù)，利用高鐵飲食小鼠模型和鐵死亡誘導肝細胞實驗探尋新的參與肝細胞鐵死亡的信號分子的表達、作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

C57BL/6J品系小鼠購買于上海靈暢生物科技有限公司，在上海交通大學醫(yī)學院的實驗動物科學部SPF（specific pathogen-free）級動物房中飼養(yǎng)。使用許可證號為SYXK（滬）2018-0027，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2018-0007。小鼠進食和飲水自由，每籠5只小鼠。動物房溫度18～26℃，相對濕度40%～60%，晝夜交替時間各12 h。所有實驗動物相關(guān)操作均已經(jīng)過上海交通大學醫(yī)學院實驗動物使用和管理委員會批準。

正常小鼠AML-12肝細胞購自美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 主要試劑和儀器

AIN76A高鐵飼料（Dyets公司，美國），RAS合成致死分子3（RAS-selective lethal small molecule 3，RSL3）、SCH772984（Selleck公司，美國），C11 BODIPY581/591（Thermo Fisher公司，美國），horchest、MDA檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Hp抗體（Abcam公司，英國），細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）抗體、磷酸化的ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）抗體（CST公司，美國），相應辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的β-微管蛋白（β-tubulin）抗體（GNI公司，日本），HRP標記的二抗anti-rabbit IgG（Santa Cruz公司，美國），4-HNE抗體（ADI公司，美國），鐵（ferrum，F(xiàn)e）含量檢測試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）檢測試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司），TRIzol、lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國），AMV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司，日本），10%胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco BRL公司，美國），ITS液體培養(yǎng)基補充劑（100×）（Sigma公司，美國）。

LX-20全自動生化分析儀（Bio-Tek公司，美國），LAS 4000 mini化學發(fā)光成像儀（富士公司，日本），BD FACSAria流式細胞儀（BD Biosciences公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 高鐵飼料飲食誘導肝細胞鐵死亡小鼠模型的構(gòu)建

體質(zhì)量20～25 g的C57BL/6J品系雄性小鼠，8周齡，共13只。隨機分為2組，分別是正常飼料喂養(yǎng)的小鼠（normal iron diet，NID組，n=5）和高鐵飼料（8.3 g羰基鐵/kg）喂養(yǎng)的小鼠（high iron diet，HID組，n=8）。連續(xù)喂食12周，實時監(jiān)測小鼠飲食飲水量和體質(zhì)量變化。12周后處死小鼠取血和肝臟。

1.4 小鼠肝臟病理學觀察

將4%多聚甲醛固定的肝組織包埋于石蠟中。石蠟切片后分別進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色、普魯士藍染色和天狼星紅染色，脫水封片，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 肝損傷血清學生化指標檢測

將收集至肝素抗凝管的小鼠全血4℃下587×g離心20 min，取上層血清至干凈EP管中并做好標記。利用GPT和GOT檢測試劑盒（96T）檢測小鼠血清中的GPT和GOT水平，測量510 nm處的反應孔吸光度值，計算血清樣品中GPT和GOT的水平。

1.6 免疫組織化學法檢測肝組織中4-HNE的表達

將包埋在石蠟中的肝組織切片進行脫蠟水化、修復抗原和封閉后，用4-HNE抗體4℃孵育過夜，隨后加入二抗，室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，蘇木精復染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，環(huán)氧樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察4-HNE表達，肝細胞胞質(zhì)顯示棕黃色即為陽性細胞。

1.7 肝組織中MDA含量檢測

切取小塊肝組織（30 mg）稱重并記錄，置于2 mL EP管內(nèi)，根據(jù)肝組織質(zhì)量加入1×PBS（每10 mg肝臟組織加入100μL PBS）。加入干凈的磁珠2顆，置入提前預冷的勻漿器內(nèi)勻漿（強度為60 Hz，時長為2.5 min，模式為運行10 s、停止10 s）。最大轉(zhuǎn)速離心后將勻漿后的液體吸入干凈的1.5 mL EP管內(nèi)，4℃、12 000×g離心10 min，取上清液置于干凈1.5 mL EP管內(nèi)，后續(xù)檢測步驟根據(jù)MDA試劑盒說明書進行。

1.8 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR實驗

肝組織和AML-12（alpha mouse liver 12）肝細胞用TRIzol進行裂解，按照標準操作方法抽提RNA，定量后利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實時熒光定量（real-time）PCR實驗。采用Power SYBPgreen PCR Master Mix熒光定量試劑盒，針對待測的目的基因設計PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。每個待測樣品設置3個復孔以防實驗誤差。內(nèi)參基因選擇小鼠核糖體蛋白（ribosomal protein L13a，Rpl13a），采用2-ΔΔCT計算每個基因的相對表達量。

表1 Real-time PCR引物序列Tab 1 Primer sequencesfor realtime-PCR

1.9 肝組織樣本RNA測序

1.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

抽提小鼠肝臟蛋白和AML-12肝細胞蛋白后，根據(jù)待測蛋白的相對分子質(zhì)量大小利用相應的8%～15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，隨后用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃孵育Hp抗體（1∶500）或p-ERK1/2抗體（1∶500）或ERK1/2抗體（1∶500）或β-tubulin-HRP抗體（1∶5 000）在搖床上振蕩過夜?；厥找豢?，TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。HRP標記的二抗anti-rabbit IgG（1∶5000）室溫搖床孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次5min。將含有HRP底物的顯影液滴在膜上，LAS4000 mini成像儀拍照并保存。

1.11 Hp過表達和Hp siRNA轉(zhuǎn)染實驗

AML-12細胞使用補充有10%胎牛血清、40 ng/mL地塞米松和5 ng/mL ITS的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2恒溫箱中進行培養(yǎng)。待細胞密度達到50%～70%后使用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行HpsiRNA或Hp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，按照說明書推薦的用量和步驟進行，6 h后換成新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，所用siRNA序列見表2。48 h后將上述細胞接種至6孔板和12孔板中，給予終濃度為5μmol/L的RSL3處理，刺激24 h后收集細胞樣品。

表2 所用siRNA序列Tab 2 Sequencesof siRNA

1.12 ERK1/2介導Hp作用實驗

ERK1/2介導Hp作用實驗前序步驟與Hp過表達和HpsiRNA轉(zhuǎn)染實驗相同，在給予RSL3之前1 h給予終濃度為5μmol/L的SCH772984，刺激24 h后收集細胞樣品，進行后續(xù)實驗。

1.13 肝細胞C11-BODIPY 581/591流式檢測

在AML-12肝細胞培養(yǎng)上清液中加入C11-BODIPY581/591，終濃度為5μmol/L，37℃孵育30 min。對標記細胞用胰蛋白酶37℃孵育4 min，再重懸于完全培養(yǎng)基中，流式細胞術(shù)檢測每個樣本細胞的熒光強度。每個條件至少分析10 000個細胞。

1.14 肝細胞C11-BODIPY 581/591免疫熒光檢測

在細胞培養(yǎng)基上清液中加入C11-BODIPY581/591，終濃度為5μmol/L，37℃孵育30 min，隨后10μg/mL horchest 37℃孵育5 min，用PBS洗滌2次，去除多余的C11-BODIPY581/591，在激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

1.15 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel和GraphPad Prism 6.0軟件計算處理，連續(xù)性定量數(shù)據(jù)用±s表示，采用Student′st檢驗進行2組間比較，以P<0.05判定為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高鐵飲食誘導小鼠肝細胞鐵死亡和肝損傷

NID組小鼠和HID組小鼠在飼喂12周過程中體質(zhì)量及攝食量均無明顯差異，2組小鼠肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量無明顯差異（圖1A、B）。但相較于NID組小鼠，HID組小鼠肝臟的邊緣較鈍，呈不規(guī)則凹陷且質(zhì)地較硬（圖1A）。同時，肝臟H-E染色和天狼星紅染色顯示，NID組肝臟細胞形態(tài)正常，未見明顯肝纖維化，而HID組小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯的肝細胞壞死及肝纖維化（圖1C、D）。而且，血清學生化指標檢測結(jié)果顯示，HID組小鼠血清GPT和GOT水平較NID組顯著增高（圖1E、F），以上提示高鐵飲食可以明顯誘導小鼠發(fā)生肝損傷和纖維化。為了驗證高鐵飲食引起的小鼠肝損傷是否與鐵死亡有關(guān)，我們比較了2組小鼠肝臟的鐵沉積和脂質(zhì)過氧化水平。肝臟普魯士藍染色（圖1G）和肝臟鐵含量檢測（圖1H）均顯示，HID組小鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的鐵沉積。4-HNE免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)，NID組小鼠沒有4-HNE累積，而HID組小鼠肝臟中4-HNE累積明顯（圖1I）。同時，HID組小鼠的肝臟中MDA的含量明顯高于NID組（圖1J）。此外，PTGS2、ACSL4和GPX4作為鐵死亡發(fā)生過程中的重要參與分子，其mRNA的表達是評價是否發(fā)生鐵死亡的重要指標。real-time PCR結(jié)果顯示，HID組小鼠肝臟中PTGS2和ACSL4mRNA表達水平明顯上升（圖1K、L），而GPX4mRNA的表達水平受到了明顯抑制（圖1M）。以上結(jié)果提示高鐵飲食可以誘導小鼠肝臟發(fā)生鐵沉積和脂質(zhì)過氧化從而引起鐵死亡。

圖1 高鐵飲食誘導小鼠發(fā)生肝細胞鐵死亡和肝損傷Fig 1 High iron diet-induced hepatocyte ferroptosis and liver injury in mice

2.2 高鐵飼料飲食對小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組表達的調(diào)控

圖2 高鐵飲食引起的小鼠肝臟中轉(zhuǎn)錄組的表達變化Fig 2 Dysregulated mRNAs in livers of micefed with high iron diet

2.3 Hp在肝細胞鐵死亡中表達減少

進一步通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)HID組中急性時相反應被明顯抑制，但是其在NID組得到明顯富集且富集評分（enrichment score，ES）排名第一（圖3A）。其中，表達下調(diào)的Hp均參與了GO和GSEA分析中發(fā)生調(diào)節(jié)變化的通路（圖3B），因此推測Hp可能參與了高鐵飲食導致的肝細胞鐵死亡。利用real-time PCR和Western blotting分別檢測了小鼠肝組織中Hp的mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)相比NID組，HID組小鼠肝臟中Hp的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)（圖3C、D），這與RNA-seq結(jié)果一致。給予AML-12肝細胞鐵死亡誘導劑RSL3后Hp的mRNA和蛋白表達水平也同樣顯著下調(diào)（圖3E、F）。鐵死亡發(fā)生過程中Hp的表達受到明顯抑制，提示Hp可能在肝細胞鐵死亡中發(fā)揮作用。

圖3 高鐵飲食和RSL3抑制肝細胞Hp的mRNA和蛋白表達Fig 3 High iron diet and RSL3 inhibiting theexpression of Hp mRNA and protein in hepatocytes

2.4 Hp過表達抑制RSL3誘導的肝細胞鐵死亡

為了驗證Hp是否在肝細胞鐵死亡中發(fā)揮作用，我們在正常小鼠肝細胞AML-12細胞中轉(zhuǎn)染Hp質(zhì)粒48 h后，給予鐵死亡誘導劑RSL3刺激24 h。Real-time PCR和Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Hp質(zhì)粒后，AML-12肝細胞內(nèi)的HpmRNA和蛋白表達水平顯著上調(diào)（圖4A、B）。細胞計數(shù)結(jié)果顯示，給予RSL3刺激后細胞死亡增加，細胞數(shù)量明顯減少，而過表達Hp可明顯減少RSL3引起的細胞的死亡（圖4C）。而且，Hp可顯著抑制由RSL3誘導引起的PTGS2表達增加和GPX4表達下調(diào)（圖4D、E）。利用C11-BODIPY581/591熒光探針標記細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，給予RSL3刺激后，流式檢測和免疫熒光結(jié)果顯示C11-BODIPY581/591染色陽性的AML-12肝細胞明顯增多，而Hp過表達后C11-BODIPY581/591熒光染色明顯減少，提示Hp過表達可以顯著抑制RSL3誘導的脂質(zhì)過氧化反應（圖4F、G）。以上結(jié)果表明，Hp可以抑制RSL3誘導的肝細胞過氧化反應和鐵死亡。

圖4 Hp過表達抑制RSL 3誘導的肝細胞鐵死亡Fig 4 Hp overexpression inhibiting hepatocyteferroptosis induced by RSL3

2.5 Hp通過抑制ERK1/2磷酸化減輕肝細胞鐵死亡

ERK通路的激活與鐵死亡密切相關(guān)［14］，因此，為了進一步揭示Hp抑制肝細胞鐵死亡的分子機制，我們首先利用Western blotting檢測了ERK1/2蛋白磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)給予RSL3刺激后，AML-12肝細胞中ERK1/2蛋白的磷酸化增強，而Hp過表達可以明顯抑制RSL3引起的ERK1/2蛋白磷酸化（圖5A）。而且，Hp敲低可明顯加重RSL3誘導的AML-12肝細胞死亡（圖5B、C），PTGS2和ACSL4mRNA表達的增加（圖5D、E），GPX4mRNA表達的降低（圖5F），以及脂質(zhì)過氧化反應的增強（圖5G、H），提示Hp敲低可明顯加重肝細胞鐵死亡。而ERK1/2抑制劑SCH772984可以明顯減輕Hp敲減后對脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的加重（圖5C～H）。以上結(jié)果表明，Hp主要通過抑制ERK1/2磷酸化減輕肝細胞鐵死亡。

圖5 Hp通過抑制ERK1/2磷酸化減輕肝細胞鐵死亡Fig 5 Hp suppressed hepatocyte ferroptosis by inhibiting ERK1/2 phosphorylation

3 討論

細胞鐵死亡主要通過Fe2+和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物累積對細胞造成損傷和死亡。Fe2+作為含鐵酶的輔助因子在氧化應激反應、能量代謝和鐵硫蛋白產(chǎn)生等代謝生化過程中均發(fā)揮重要作用［1，18-19］。細胞內(nèi)Fe2+增多會誘導細胞發(fā)生鐵死亡［1，20-22］。在本研究中，我們利用高鐵飲食飼喂構(gòu)建了小鼠肝臟鐵死亡的模型，通過肝臟H-E染色（圖1C），血清GPT（圖1E）和GOT檢測（圖1F）結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)高鐵飲食可以明顯誘導小鼠的肝臟損傷。同時，普魯士藍染色（圖1G）和肝臟鐵含量檢測（圖1H）證實了高鐵飲食可以引起肝細胞鐵沉積。4-HNE和MDA的檢測證實了高鐵飲食導致了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的累積（圖1I、J）。而realtime PCR結(jié)果顯示，鐵死亡過程中重要的分子PTGS2［3，12］、ACSL4［23-24］和GPX4［3-4］發(fā)生了相應的變化（圖1K～M），提示高鐵飲食誘導的肝細胞死亡形式主要為鐵死亡，這些結(jié)果與文獻報道一致［12，25］。同時RNA-seq結(jié)果分析也表明，氧化還原反應和細胞死亡通路被明顯激活，這些結(jié)果均進一步證明高鐵飲食可以促進肝細胞的鐵死亡進而引起肝損傷和纖維化，高鐵飲食小鼠模型是一種比較理想的研究肝細胞鐵死亡機制的動物模型。

利用RNA-seq結(jié)果進行GO和GSEA分析發(fā)現(xiàn)，急性時相蛋白Hp參與了高鐵飲食調(diào)控的鐵死亡相關(guān)信號通路，而且實驗證實Hp在HID組小鼠肝臟及RSL3誘導的肝細胞中表達水平明顯下調(diào)，提示Hp可能參與了鐵死亡發(fā)生過程。為了進一步驗證Hp在肝細胞鐵死亡中的功能，我們給予Hp過表達的AML-12肝細胞鐵死亡誘導劑RSL13，利用細胞計數(shù)、real-time PCR和C11-BODIPY581/591免疫熒光及流式分析分別檢測了細胞的死亡、鐵死亡相關(guān)基因（PTGS2、ACSL4、GPX4）以及肝細胞的脂質(zhì)氧化水平，發(fā)現(xiàn)Hp過表達可以明顯減輕RSL3引起的AML-12肝細胞的死亡和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物累積（圖4）。而相反的，Hp敲低則可明顯加重RSL3引起的肝細胞鐵死亡（圖5）。由此，我們證實Hp是肝細胞鐵死亡的新的抑制分子。而有文獻報道，鐵死亡誘導劑erastin或RSL3可上調(diào)肺癌細胞中Hp的表達，敲除Hp后可以減輕RSL3引起的肺癌細胞鐵死亡并增加肺癌細胞對erastin或者RSL3的耐藥性［15］。這與我們結(jié)果存在的差異可能是由于我們使用的是正常的肝細胞，而正常體細胞與腫瘤細胞對于鐵死亡的敏感性和機制不同［26-28］。Hp在肝癌細胞鐵死亡中發(fā)揮什么作用還有待于進一步研究。

ERK1/2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，廣泛存在于真核細胞中。ERK1/2在細胞表面受體到細胞核的信號轉(zhuǎn)導中起關(guān)鍵作用，激活的p-ERK1/2磷酸化細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)的底物，從而誘導特定蛋白的表達或激活，導致細胞增殖、分化、凋亡等過程的調(diào)控［29-30］。而且，ERK信號通路異常參與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究［31］表明，在ALD小鼠模型中，肝細胞ERK1/2的活性受到抑制；但是也有文獻［32-33］指出，慢性酒精飲食可以增強庫普弗細胞中ERK1/2激活的反應，促進腫瘤壞死因子合成增加和炎癥反應增強。這可能是由于研究的細胞和酒精處理時間不同［34］，但以上研究結(jié)果提示ERK1/2信號通路在ALD中是失調(diào)的。而在NAFLD中，小鼠肝細胞特異性敲除IL-11受體亞基α-1（interleukin 11 receptor，alpha chain 1，IL11ra1）可以減少IL-11誘導的肝細胞ROS產(chǎn)生，以及ERK和JNK通路激活，從而減輕高脂高糖飲食誘導的肝細胞損傷和NASH［35］。同時，ERK通路激活后通過負調(diào)控TGF-β/Smad信號，促進成纖維細胞的增殖和分化，上調(diào)膠原基因的表達和合成以及細胞外基質(zhì)沉積，進而促進肝纖維化的進展［30］。由此，ERK1/2通路在鐵死亡相關(guān)的肝病（ALD、NAFLD和肝纖維化）［7］的發(fā)生與發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，但ERK1/2通路是否可以調(diào)控肝細胞鐵死亡以及是否通過調(diào)控鐵死亡參與肝病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。而目前有文獻［14］報道在大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株（PC12細胞）鐵死亡發(fā)生過程中，ERK通路被激活，ERK1/2磷酸化水平上調(diào)。我們的結(jié)果表明，高鐵飲食和RSL3可以明顯上調(diào)肝細胞ERK1/2磷酸化水平，而Hp過表達后ERK通路得到抑制，提示ERK1/2信號通路可能介導了Hp抑制肝細胞鐵死亡的功能。隨后的實驗進一步證實，ERK1/2抑制劑SCH772984可以明顯減輕Hp敲減導致的鐵死亡的加重，提示Hp是通過抑制ERK1/2活性抑制肝細胞鐵死亡，可能在鐵死亡相關(guān)的肝病中發(fā)揮重要的作用。

總之，本研究表明Hp是一種新的肝細胞鐵死亡抑制因子，可以通過抑制ERK1/2信號通路活化來抑制肝細胞鐵死亡。這為治療鐵死亡引起的肝損傷或利用鐵死亡治療肝癌提供了新的靶點和證據(jù)。

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