薛明洋，周 勇，梁宏偉，李 翔，范玉頂，曾令兵，曲春娟，孟 彥

（1中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2安徽省喜佳農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司，安徽蚌埠 233000；3安徽省蚌埠市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，安徽蚌埠 233000）

0 引言

中華鱉(Pelodiscus Sinensis)，俗稱甲魚，團(tuán)魚等，隸屬于爬行綱(Reptilia)、龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Tironychidae)、鱉屬(Pelodiscus)，是中國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，具有重要的營(yíng)養(yǎng)、藥用和觀賞價(jià)值[1]。近年來，國(guó)內(nèi)鱉養(yǎng)殖產(chǎn)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，養(yǎng)殖區(qū)域主要集中在浙江、安徽、廣東、湖北、江蘇、江西等地，養(yǎng)殖呈現(xiàn)出工廠化、規(guī)?；图s化的發(fā)展趨勢(shì)[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度不斷提高，而且加之長(zhǎng)期的人工控溫養(yǎng)殖，致使中華鱉自身免疫力、抗病力都有所下降，因而養(yǎng)殖過程中發(fā)病頻率和不同病原感染導(dǎo)致的疾病均有所增加，病害問題日益突出，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)中華鱉疾病的研究。

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)于弧菌科、氣單胞菌屬，是一種廣泛分布于自然界中的革蘭氏陰性桿菌，通常被認(rèn)為是條件致病菌，是多種水生動(dòng)物的致病菌，為典型的“人-畜-魚”共患病病原[3-4]。嗜水氣單胞菌是中華鱉的主要致病菌，目前已從多種癥狀的病鱉中都分離出嗜水氣單胞菌，如紅脖子病、紅底板病、白底板病、腐皮病、疥瘡病、出血性腸炎等多種不同癥狀的疾病[5]。嗜水氣單胞菌還能引發(fā)多種并發(fā)癥，如“紅脖子、紅底板”并發(fā)癥，“腐皮、疥瘡”并發(fā)癥等[6]。所以在中華鱉養(yǎng)殖過程中疾病診斷、病原的確定尤為重要。目前抗生素是防治鱉嗜水氣單胞菌感染的主要藥物。研究表明，不同區(qū)域和來源的嗜水氣單胞菌對(duì)藥物的敏感性不同[7]。林峰[8]從中華鱉中分離出1 株嗜水氣單胞菌對(duì)慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感。趙小平等[9]分離的嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。此外，研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的耐藥性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[10]。因此，要做好藥敏檢測(cè)，要有針對(duì)性用藥。

嗜水氣單胞菌的致病性與毒力因子密切相關(guān)，對(duì)于毒力因子的作用，一般認(rèn)為都是多功能和多因子協(xié)同致病的結(jié)果[11]。嗜水氣單胞菌所分泌的氣溶素、溶血素、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶及細(xì)胞毒性腸毒素等是重要的毒力因子，與嗜水氣單胞菌有無毒力或者毒力強(qiáng)弱有很高的相關(guān)性[12]。

2019年，安徽某中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)中華鱉出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、脖頸紅腫、伸縮困難、腹甲及四肢有紅色出血斑點(diǎn)（塊）為主要癥狀的傳染性疾病，主要感染對(duì)象為1 齡以上溫室養(yǎng)殖和室外池塘養(yǎng)殖的成鱉，發(fā)病周期持續(xù)2周，死亡率達(dá)30%，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。為了探究此次導(dǎo)致安徽省中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病的致病原，本研究無菌條件下從患病中華鱉體內(nèi)分離病原，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA 序列分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定；利用回歸感染試驗(yàn)對(duì)病原菌致病性進(jìn)行確定，采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；成功地分離并鑒定了一株高致病性的嗜水氣單胞菌AM-1，并對(duì)其毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，為此次中華鱉疾病的防治提供了重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年5月從安徽省某中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)采集患典型癥狀的瀕死中華鱉(350 g±30 g)，冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離和鑒定。健康1齡中華鱉(350 g±30 g)購自安徽蚌埠某中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)。試驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚類病害實(shí)驗(yàn)室，于2019 年5—10 月進(jìn)行。

1.2 主要試劑和儀器

所需生化試劑和藥品均購自國(guó)藥集團(tuán)；腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購于美國(guó)BD公司；LB培養(yǎng)基購自上海博微生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、DPBS緩沖液、瓊脂糖等試劑購自Sigma公司；細(xì)菌總基因組提取試劑盒Bacterial DNA Kit 購自O(shè)MEGA 公司，病毒基因組DNA 提取Viral DNAkit 購自O(shè)MEGA 公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒2×Hieff?PCR Master Mix 購自上海翊圣生物科技有限公司，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒Gel Extraction Kit 購自O(shè)MEGA公司。藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)來自于美國(guó)BIOLOG 公司的Biolog GEN Ⅲ。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 中華鱉虹彩病毒檢測(cè)

取瀕死中華鱉的肝臟、脾臟和腎臟組織，加入含雙抗的PBS，在混勻振蕩器中充分研磨，反復(fù)凍融3 次后，4℃條件下3000 rpm離心30 min后取上清液，利用病毒DNA提取試劑盒，按試劑盒說明書進(jìn)行病毒基因組DNA 提取。參考中華鱉虹彩病毒(STIV)引物[13]對(duì)提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體引物信息見表1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL，包括12.5 μL PCR Mix，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，1 μL 模板DNA 以及9.5 μL雙蒸水。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃復(fù)性30 s，72℃延伸10 min，共35 個(gè)循環(huán)。以中華鱉虹彩病毒DNA 為陽性對(duì)照，并設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 細(xì)菌病原的分離和純化

用70%酒精對(duì)患病中華鱉的體表消毒后，置于生物安全柜中進(jìn)行解剖，挑取部分肝臟，涂布于BHI瓊脂平板上，于30℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取平板中菌落，重新劃線培養(yǎng)于BHI瓊脂平板上，于相同的條件下培養(yǎng)，得到純化的單菌落。挑取單菌落接種到5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，于30℃、200 rpm 條件下培養(yǎng)48 h。菌液加入甘油后分裝到1.5 mL EP 管中，置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩７蛛x的菌株命名為AM-1。

1.5 病原的鑒定

1.5.1 細(xì)菌形態(tài)鑒定28℃條件下將分離的菌株在LB固體培養(yǎng)基純培養(yǎng)18 h后觀察菌落形態(tài)。用生理鹽水制備菌懸液做革蘭氏染色。

1.5.2 細(xì)菌生理生化鑒定 取經(jīng)LB 固體培養(yǎng)基純培養(yǎng)的菌株，單菌落劃線接種于BUG（Biolog通用培養(yǎng)基）鑒定平板上，28℃培養(yǎng)16～24 h，待菌落大小適宜時(shí)取Biolog細(xì)菌鑒定試劑盒IF-A接種液，將管外壁擦拭干凈，置入Biolog 濁度儀中調(diào)整其讀數(shù)為100%T；用無菌棉簽蘸取適量的單菌落至接種液中，使?jié)岫葍x讀數(shù)在92%T～98%T之間，用移液器將混合液以每孔100 μL體積轉(zhuǎn)移至GEN Ⅲ鑒定板中，然后將鑒定板裝載于Biolog系統(tǒng)中培養(yǎng)，系統(tǒng)自動(dòng)讀數(shù)并輸出鑒定結(jié)果。

1.5.3 分子生物學(xué)鑒定 將純培養(yǎng)的菌懸液以10000 rpm離心2 min 后收集菌體，然后按照Bacterial DNA Kit(OMEGA)試劑盒說明書上的方法提取細(xì)菌基因組DNA。采用16S rDNA 基因通用引物[14]（表1）對(duì)分離到的菌株16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL PCR Mix，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，2 μL 模板DNA 以及19 μL 雙蒸水。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃復(fù)性45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果置于 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 的Blast(Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行序列同源性比對(duì)，然后取不同來源的嗜水氣單胞菌16S rDNA 基因序列用MEGA7.0(http://www.megasoftware.net/previousVersions.ph) 中的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以1000 次自舉分析(Bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列

1.6 人工感染實(shí)驗(yàn)

分離菌株培養(yǎng)后通過平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度，并分別制備1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL 和1×1010CFU/mL 共5 個(gè)濃度梯度的菌懸液。將室內(nèi)暫養(yǎng)1周的48只健康1齡中華鱉（體重350 g±30 g）以8只/組隨機(jī)均分為6組。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別從腹甲基部以腹腔感染1 mL/只劑量接種5種不同濃度的菌懸液，另外一組對(duì)照組注射同樣體積的PBS。感染后在23℃±2℃的室內(nèi)連續(xù)觀察8 天，期間定期飼喂餌料，記錄死亡數(shù)量及癥狀，并剖檢以確定死亡的中華鱉體內(nèi)能分離得到攻毒的菌株。

1.7 藥物敏感性測(cè)定

培養(yǎng)試驗(yàn)菌株并用無菌PBS 調(diào)整菌液濃度為1× 108CFU/mL，吸取100 μL菌液涂布于MH(Mueller-Hinton)培養(yǎng)基表面，靜置10 min待培養(yǎng)基表面的菌液被完全吸收，將抗生素藥敏片分別貼在培養(yǎng)基表面，然后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。測(cè)量并記錄抑菌圈大小(mm)，按照藥敏試劑盒使用說明判定敏感性。

1.8 毒力基因檢測(cè)

參照Nawaz 等的方法，分別合成6 種毒力因子的特異性引物，氣溶素(Aerolysin,aero)、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Heat-labile enterotoxin,alt)、細(xì)胞毒性腸毒素基因(Cytotoxic enterotoxin,act)、熱穩(wěn)定性腸毒素(Heatstable enterotoxin,ast)、溶血素(Hemolysin A,hly)、彈性蛋白酶(Elastase,ahy)，引物序列信息見表1。以分離菌株AM-1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并觀察判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病中華鱉癥狀

患病中華鱉最典型的癥狀為反應(yīng)遲鈍，頸部有出血點(diǎn)，腫大，伸縮困難，腹甲和四肢有紅色出血點(diǎn)或斑塊。剖檢后發(fā)現(xiàn)腮腺部位粘膜出血，肝臟和脾臟腫大，部分個(gè)體肝臟有出血現(xiàn)象（見圖1）。

圖1 患病中華鱉主要癥狀

2.2 病毒病原檢測(cè)

對(duì)患病中華鱉組織提取物全基因組DNA 進(jìn)行中華鱉虹彩病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，從上述組織液中未檢出任何擴(kuò)增條帶。

2.3 分離細(xì)菌的菌落形態(tài)及菌體特征

從患病中華鱉肝臟中分離的菌株AM-1在普通瓊脂營(yíng)養(yǎng)平板上經(jīng)28℃培養(yǎng)18～24 h 后，長(zhǎng)出直徑0.7～1.2 mm，圓形、中央隆起，濕潤(rùn)，半透明，露滴狀，灰白色或灰黃色帶有特殊氣味的菌落，染色后顯示為革蘭氏陰性（圖2A和2B）。

圖2 菌株AM-1的形態(tài)特征。營(yíng)養(yǎng)瓊脂(A)和革蘭氏染色(B)

利用BIOLOG 微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對(duì)分離菌株AM-1 進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明AM-1 菌屬于嗜水氣單胞菌。鑒定的部分生理生化指標(biāo)如表2所示。

表2 利用BIOLOG自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)分離菌株AM-1的生化鑒定結(jié)果

2.4 分離菌株16S rDNA序列分析

通過PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定獲得分離菌株AM-1 16S rDNA基因1407 bp長(zhǎng)度的序列片段，將其在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與嗜水氣單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966(CP000462)的相似度達(dá)98%，而且與菌株AM184306 等嗜水氣單胞菌分離株的相似度也高達(dá)98%，確定該菌株為嗜水氣單胞菌。基于16S rDNA基因序列，從NBCI數(shù)據(jù)庫選擇不同來源的嗜水氣單胞菌14株，與中華鱉嗜水氣單胞菌分離株AM-1 構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明：AM-1首先與來源于鯽魚腎臟分離的嗜水氣單胞菌(KC812106.1)和患“白底板”病的中華鱉體內(nèi)分離的嗜水氣單胞菌(GU563992.1)聚為在一起。

圖3 構(gòu)建不同來源嗜水氣單胞菌16S rDNA序列NJ進(jìn)化樹;AM-1為本研究分離株

2.5 分離菌株的致病性

利用分離純化的分離菌株AM-1制備5個(gè)濃度梯度1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL和1×1010CFU/mL的菌液，分別腹腔注射健康中華鱉，然后連續(xù)對(duì)其觀察8天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組而言，注射第2天，除了1×106CFU/mL濃度注射組未出現(xiàn)中華鱉死亡現(xiàn)象，其余4 個(gè)組中華鱉都有不同程度的死亡，其中以1×1010CFU/mL濃度組的死亡率最高。觀察死亡中華鱉的癥狀主要表現(xiàn)為脖頸發(fā)紅。在注射第4天，1×1010CFU/mL菌液濃度組中華鱉全部死亡，死亡率為100%，1×106CFU/mL 濃度組從注射第2 天后出現(xiàn)持續(xù)死亡，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡率為75%，1×107CFU/mL 和1×108CFU/mL 濃度組的死亡率均為87.5%，1×109CFU/mL濃度組的死亡率為100%。在第4天和第5天感染后死亡的中華鱉個(gè)體中觀察到有一定程度的脖頸紅腫和腹甲出血現(xiàn)象，與自然發(fā)病類似。對(duì)照組在試驗(yàn)期間累積死亡中華鱉1 只，無任何脖頸紅腫等癥狀。統(tǒng)計(jì)中華鱉攻毒后的死亡率和生存曲線如表3 和圖4 所示。此外，對(duì)人工感染死亡的中華鱉進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果與嗜水氣單胞菌AM-1 一致。綜合上述結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌AM-1是導(dǎo)致此次中華鱉脖頸紅腫病的致病菌。

表3 分離菌株AM-1對(duì)中華鱉致病性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 中華鱉攻毒后的生存曲線

2.6 藥物敏感試驗(yàn)

分離菌株AM-1 常見的藥物敏感性檢驗(yàn)如表4 所示。按照藥敏試劑盒使用說明判定，分離菌株嗜水氣單胞菌AM-1 對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、慶大霉素、頭孢他啶和氨曲南敏感，對(duì)氟苯尼考和多粘菌素中度敏感，而對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素等藥物具有耐藥性。

表4 分離菌株AM-1的藥物敏感性

2.7 毒力基因檢測(cè)

用嗜水氣單胞菌6 種毒力基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，發(fā)現(xiàn)氣溶素、熱不穩(wěn)定性腸毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素、溶血素、彈性蛋白酶5種毒力基因都能擴(kuò)增到單一且與預(yù)期片段相符合的條帶（圖5），而細(xì)胞毒性腸毒素基因未見擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖5 分離菌株毒力基因擴(kuò)增電泳圖

3 討論

3.1 病原的分離與鑒定

嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌，在自然界中廣泛存在，一定條件下對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物、畜禽和人類均有致病性[15-17]。其可以引起草魚、大菱鲆、羅非魚、大鯢和中華絨螯蟹等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類、甲殼類和兩棲類動(dòng)物患病[17-19]。嗜水氣單胞菌可以引起中華鱉出血性腸道壞死癥、紅脖子病、紅底板病、癤瘡病、白斑病和腐皮病等病癥[20]?！凹t脖子病”是中華鱉發(fā)現(xiàn)比較早的疾病，也是危害相對(duì)最嚴(yán)重的疾病之一。前期，不同學(xué)者對(duì)其病原的研究得到不同結(jié)論：其中包括虹彩病毒[21]，嗜水氣單胞菌[22]，維氏氣單胞菌[23]，嗜水氣單胞菌和蠟樣芽胞桿菌混合感染等[24]等，但僅邱德全等[22]鑒定病原之后在中華鰲上開展了詳細(xì)的回歸感染實(shí)驗(yàn)。本研究中，我們對(duì)患病中華鱉分別開展了細(xì)菌和中華鱉虹彩病毒檢測(cè)，其中通過分子生物學(xué)方法未檢出有中華鱉虹彩病毒存在；另外，在細(xì)菌檢測(cè)過程中，從患病中華鱉的肝臟組織中分離到單一的、數(shù)量眾多的嗜水氣單胞菌，回歸感染實(shí)驗(yàn)復(fù)制出與自然發(fā)病類似的病癥。確定引起中華鱉脖頸紅腫、呼吸困難、腹甲出血點(diǎn)/斑的致病原為嗜水氣單胞菌。

3.2 人工感染

本研究采用5個(gè)濃度的菌液對(duì)中華鱉進(jìn)行腹腔注射感染以驗(yàn)證其致病性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度菌液可以導(dǎo)致中華鱉出現(xiàn)急性死亡，例如在注射4 天內(nèi)，1×1010CFU/mL 注射濃度組中華鱉全部死亡，死亡癥狀為脖頸發(fā)紅。而低濃度注射組，從注射第2 天開始出現(xiàn)死亡，在第4天和第5天死亡的個(gè)體中觀察到與自然發(fā)病有一定程度相似的脖頸紅腫和腹甲出血現(xiàn)象。邱德全等[22]從患紅脖子的中華鱉體內(nèi)分離到一株嗜水氣單胞菌，然后分別利用腹腔注射感染、灌胃感染、傷口感染和水體浸泡感染檢測(cè)其致病性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射會(huì)導(dǎo)致多數(shù)中華鱉急性死亡，灌胃和傷口感染不會(huì)產(chǎn)生頸部紅腫的現(xiàn)象，而浸泡感染的個(gè)體會(huì)在感染20天左右出現(xiàn)脖子變粗，頸部充血，底板和四肢有出血點(diǎn)的癥狀。這與本研究嗜水氣單胞菌導(dǎo)致中華鱉脖頸腫脹，底板和四肢有出血點(diǎn)/斑的結(jié)果相似，這充分證明嗜水氣單胞菌是導(dǎo)致中華鱉脖頸紅腫癥狀的致病菌，但是癥狀是否典型則與嗜水氣單胞菌感染的方式和感染時(shí)間有關(guān)。

3.3 發(fā)病原因分析

本次發(fā)病中華鱉主要出現(xiàn)在溫室養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水溫普遍在30℃左右。目前中華鱉養(yǎng)殖多為工廠化集約養(yǎng)殖，養(yǎng)殖密度大。水體中常見的嗜水氣單胞菌在高密度養(yǎng)殖和加溫(28～30℃)飼養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)條件最佳，繁殖能力最快，致病性也會(huì)增強(qiáng)，是導(dǎo)致鱉病的主要致病菌[11]。在中華鱉溫室養(yǎng)殖中，與嗜水氣單胞菌病發(fā)生相關(guān)的主要環(huán)境因子有溫度、溶解氧、pH、氨氮、生物因子和亞硝酸氮等[24]，所以高密度養(yǎng)殖情況下，投餌飼喂導(dǎo)致水體中容易富集餌料殘?jiān)图S便等物質(zhì)，養(yǎng)殖水體循環(huán)緩慢會(huì)造成水體污染，而且高溫還會(huì)使中華鱉自身的抵抗力下降[25]，所以嗜水氣單胞菌這一條件性致病菌就會(huì)“趁虛而入”導(dǎo)致機(jī)體感染。

3.4 嗜水氣單胞菌藥敏性質(zhì)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明中華鱉脖頸紅腫的病原菌嗜水氣單胞菌AM-1 對(duì)菌對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、頭孢他啶和氨曲南敏感，對(duì)氟苯尼考和多粘菌素中度敏感，而對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素等藥物具有耐藥性，該藥敏結(jié)果與康紹珠[26]和王帥兵等[27]報(bào)道有一定差異，這可能與用藥習(xí)慣及菌株差異有關(guān)。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的耐藥性呈上升趨勢(shì)，甚至出現(xiàn)多重耐藥性。因此，在養(yǎng)殖過程中，要做好藥敏試驗(yàn)，有針對(duì)性用藥，應(yīng)做好用藥記錄，盡量使用窄譜抗生素，聯(lián)合用藥和輪換用藥相結(jié)合。

3.5 嗜水氣單胞菌毒力基因分析

細(xì)菌所攜帶毒力因子與其致病性緊密相關(guān)，氣溶素、溶血素、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶及細(xì)胞毒性腸毒素是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子[28]，其中氣溶素、溶血素和細(xì)胞毒性腸毒素基因是典型的3種外毒素[29]，與動(dòng)物出血病、敗血癥密切相關(guān)。經(jīng)毒力基因檢測(cè)，本次分離株AM-1攜帶氣溶素、熱不穩(wěn)定性腸毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素、溶血素、彈性蛋白酶5 種毒力基因，這可能與其具有較強(qiáng)致病性有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究從患病中華鱉體內(nèi)分離純化得到一株細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16SrDNA 序列分析鑒定分離菌株為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。人工感染試驗(yàn)顯示該菌對(duì)中華鱉具有較強(qiáng)致病性，且發(fā)病癥狀與自然發(fā)病中華鱉癥狀一致，表明該菌是此次中華鱉疾病的病原菌。藥敏試驗(yàn)顯示該菌對(duì)恩諾沙星和左氧氟沙星等藥物敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、氨芐西林和四環(huán)素等不敏感。毒力基因檢測(cè)顯示，該嗜水氣單胞菌分離株攜帶氣溶素、熱不穩(wěn)定性腸毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素、溶血素、彈性蛋白酶5 種毒力基因。