解鴻翔，沈 燕，龐珍珍，孫 彬，王珍妮，謝姝惠，周永列

1浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心 檢驗(yàn)中心，杭州 3100142山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 山東省千佛山醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 2500143臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，浙江臺(tái)州 318000

自動(dòng)化血細(xì)胞分析儀的出現(xiàn)提高了全血細(xì)胞計(jì)數(shù)的檢測(cè)通量和準(zhǔn)確性。然而，分析前和分析過(guò)程中依然有許多因素可能會(huì)影響全血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，冷凝集素(cold agglutinins，CAs)就是嚴(yán)重干擾血細(xì)胞分析儀檢測(cè)結(jié)果的原因之一。CAs是一種紅細(xì)胞自身抗體，主要為IgM型，少部分是IgG和IgA[1]。這些抗體在31 ℃以下溫度時(shí)易與紅細(xì)胞上的I、i或SP1 3種抗原結(jié)合，造成紅細(xì)胞凝集，從而干擾紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的分析，如紅細(xì)胞壓積(hematocrit，HCT)、平均血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)和平均血紅蛋白濃度(mean cell hemoglobin concentration，MCHC)。同時(shí)，文獻(xiàn)報(bào)道白細(xì)胞和血小板表面也存在I/i抗原，所以CAs對(duì)白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)也會(huì)造成一定的影響[2- 3]。對(duì)于含有CAs的標(biāo)本，日常工作中通常將其放置于37 ℃水浴一定時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)，以消除CAs對(duì)血常規(guī)檢驗(yàn)的干擾。37 ℃水浴法對(duì)于CAs效價(jià)較低的標(biāo)本可基本糾正，但對(duì)于CAs效價(jià)高者往往糾正程度不夠。有研究表明，在39 ℃～41 ℃短時(shí)高溫的情況下，血紅蛋白構(gòu)象和紅細(xì)胞形態(tài)基本能維持在正常范圍內(nèi)[4- 5]。在實(shí)際工作中，筆者遇到2例含有高效價(jià)CAs的患者標(biāo)本，用37 ℃水浴法處理后，紅細(xì)胞參數(shù)未得到完全糾正。由于CAs抗體效價(jià)及凝集強(qiáng)度隨溫度上升而降低，本研究嘗試41 ℃水浴30 min處理標(biāo)本并探討其可行性。

資料和方法

病歷資料病例1，患者中年女性，40歲，因“發(fā)現(xiàn)左側(cè)乳腺癌1月余，為行第2次術(shù)前化療”入院?；颊?月余前因“自覺(jué)左乳腫塊2周”來(lái)浙江省人民醫(yī)院行穿刺活檢術(shù)，病理結(jié)果提示浸潤(rùn)性癌伴導(dǎo)管內(nèi)癌(高核級(jí))?；颊哂枰员砣岜刃?45 mg、環(huán)磷酰胺0.95 g方案化療，化療后患者無(wú)明顯不適；現(xiàn)患者為求第2次術(shù)前化療來(lái)浙江省人民醫(yī)院就診。查體：左乳外上象限可及2.0 cm大小腫塊，界清，質(zhì)稍硬，活動(dòng)可。入院后B超提示脂肪肝，血常規(guī)提示冷凝集素存在，其他實(shí)驗(yàn)室檢查：4 ℃時(shí)冷凝集素效價(jià)>512，Coomb’s試驗(yàn)陽(yáng)性(C3d型)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶67 U/L，堿性磷酸酶124 U/L，三酰甘油5.37 mmol/L，非高密度脂蛋白膽固醇4.42 mmol/L，乳酸脫氫酶289 U/L，雌二醇<10 pg/ml。病例2，患者老年女性，74歲，因“卵巢癌復(fù)發(fā)術(shù)后20余天，要求第1次化療”入院?；颊?6年前診斷為卵巢惡性腫瘤(微乳頭性漿液性癌)并行手術(shù)治療。1月余前因“卵巢癌復(fù)發(fā)可能”于浙江省人民醫(yī)院行開(kāi)腹探查及腫瘤切除治療，術(shù)后病理提示：淋巴結(jié)(45/61)轉(zhuǎn)移性癌(低級(jí)別漿液性癌)?，F(xiàn)患者為行第1次化療來(lái)浙江省人民醫(yī)院。查體：缺如子宮，空虛附件。入院后PET檢查提示腫瘤多發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血常規(guī)提示冷凝集素存在，其他實(shí)驗(yàn)室檢查：4 ℃時(shí)冷凝集素效價(jià)>512，CA- 125 1674.0 U/ml，CA- 199 105.1 U/ml，CA72- 4 32.0 U/ml，D-二聚體3960.0 μg/L，大便常規(guī)白細(xì)胞鏡檢++/高倍鏡視野。

檢測(cè)方法每例患者采集靜脈血4 ml用EDTA-K2抗凝，分為2管。其中一管分別在室溫(25 ℃)及37 ℃溫育不同時(shí)間混勻后，以手動(dòng)進(jìn)樣方式用Sysmex XN- 9000血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析，另一管41 ℃溫育30 min后以同樣方式上機(jī)檢測(cè)。血細(xì)胞分析儀配套稀釋液、溶血?jiǎng)┚鶠樵瓘S(chǎng)試劑。同時(shí)將上述標(biāo)本分別用預(yù)熱玻片制作外周血涂片進(jìn)行瑞氏染色，用顯微鏡觀(guān)察紅細(xì)胞分布情況。

為了評(píng)估孵育本身對(duì)結(jié)果的影響，收集門(mén)診和住院患者的血常規(guī)標(biāo)本共74例，排除冷凝集素、溶血、黃疸和乳糜血的干擾，所有標(biāo)本在室溫下檢測(cè)完成后，置于41 ℃水浴箱水浴30、60 min后分別再次上機(jī)檢測(cè)。采用MedCalc軟件進(jìn)行Passing-Bablok回歸分析對(duì)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。進(jìn)一步以1/2 美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法規(guī)88允許總誤差和中國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS/T406- 2012 臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》為標(biāo)準(zhǔn)判斷偏差是否可接受，各參數(shù)相對(duì)偏差可接受的樣本比例應(yīng)≥80%。

結(jié) 果

標(biāo)本在不同溫度條件下的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果患者1標(biāo)本在室溫條件下進(jìn)行血細(xì)胞分析，結(jié)果顯示血紅蛋白(hemoglobin，HGB)與紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell count，RBC)嚴(yán)重比例失調(diào)，HCT明顯減低，MCH及MCHC明顯增高(表1)。觀(guān)察標(biāo)本顯示試管壁上懸浮大量微小的顆粒，血涂片顯示大量紅細(xì)胞聚集成團(tuán)，或成緡錢(qián)狀排列(圖1A)。隨后改用37 ℃溫育60 min，結(jié)果顯示RBC值得到部分糾正，但HCT、MCH、MCHC仍顯著異常。37 ℃溫育120 min后進(jìn)行檢查，RBC明顯升高，HCT、MCH、MCHC亦得到明顯改善，但血涂片瑞氏染色鏡檢仍可見(jiàn)少量紅細(xì)胞聚集成團(tuán)(圖1B)。將標(biāo)本41 ℃水浴30 min 后再進(jìn)行檢查，顯示紅細(xì)胞參數(shù)均得到較好的糾正，RBC計(jì)數(shù)、HCT、MCH、MCHC較室溫條件有顯著提升，涂片染色鏡檢紅細(xì)胞分布均勻，無(wú)聚集現(xiàn)象(圖1C)；同時(shí)處理前后白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell count，WBC)、HGB和血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)等無(wú)差異。與室溫檢測(cè)結(jié)果相比，WBC在37 ℃ 60 min、37 ℃ 120 min、41 ℃ 30 min 溫育后的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差分別為5.7%、8.3%、3.0%，HGB相對(duì)偏差分別為1.4%、2.1%、0.7%，PLT相對(duì)偏差分別為10.3%、8.9%、10.8%(表1)。

患者2標(biāo)本在不同溫度條件檢測(cè)結(jié)果顯示，與室溫檢測(cè)結(jié)果相比，WBC在37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、41 ℃ 30 min溫育后的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差分別為23.7%、21.9%、26.3%，HGB相對(duì)偏差分別為2.1%、1.1%、2.1%，PLT相對(duì)偏差分別為3.0%、5.9%、2.3%(表1)。

41 ℃溫育對(duì)無(wú)冷凝集素標(biāo)本血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)一步收集74例不含冷凝集素的血常規(guī)標(biāo)本進(jìn)行結(jié)果一致性和可比性驗(yàn)證，評(píng)估41 ℃孵育本身對(duì)結(jié)果的影響。74例標(biāo)本在41 ℃溫育30、60 min后的檢測(cè)結(jié)果分別與室溫條件下的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Passing-Bablok回歸分析。結(jié)果顯示W(wǎng)BC、RBC、HCT、HGB、MCV、MCH和MCHC各參數(shù)回歸方程的截距95%CI均包括0，斜率95%CI均包括1，說(shuō)明各參數(shù)41 ℃溫育后的檢測(cè)結(jié)果和室溫檢測(cè)結(jié)果之間無(wú)系統(tǒng)差異和比例差異；PLT無(wú)系統(tǒng)差異，但有一定的比例差異(表2)。根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)果可比性驗(yàn)證，結(jié)果顯示與室溫檢測(cè)結(jié)果相比，41 ℃溫育30、60 min后的血常規(guī)結(jié)果各項(xiàng)目相對(duì)偏差可接受的樣本比例均≥80%，從專(zhuān)業(yè)上考慮41 ℃溫育和室溫檢測(cè)結(jié)果之間的相對(duì)偏差均在臨床可接受范圍內(nèi)(表3)。

表1 不同溫育條件下全血細(xì)胞計(jì)數(shù)部分項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果

A.室溫(×40)；B.37 ℃溫育120 min(×40；37 ℃玻片)；C.41 ℃溫育30 min(×40；41 ℃玻片)

表2 74例血常規(guī)標(biāo)本在41 ℃溫育30、60 min后的檢測(cè)結(jié)果分別與室溫檢測(cè)結(jié)果的Passing-Bablok回歸分析Table 2 Passing-Bablok regression analysis of the test results of 74 complete blood count specimens incubated at 41 ℃ for 30 minutes or 60 minutes and at the room temperature，respectively

討 論

CAs是常見(jiàn)的影響血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾因素之一。Finland等[6]早在1945年就提出了在37 ℃溫育作為一種消除細(xì)胞計(jì)數(shù)中CAs干擾的方法。雖然已經(jīng)提出了其他方法，如血漿置換、預(yù)稀釋以及標(biāo)本與試劑雙重溫育等方法，但37 ℃溫育仍是迄今為止應(yīng)用最廣泛的方法之一。然而在實(shí)際工作中遇到CAs效價(jià)較高的標(biāo)本時(shí)，37 ℃加熱法和預(yù)稀釋法并不能完全消除CAs干擾，且標(biāo)本稀釋后可導(dǎo)致某些患者(如重度貧血)的RBC、HGB等檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性下降[7]。標(biāo)本與試劑雙重溫育法既要溫育試劑，又要排去儀器內(nèi)原有試劑，檢測(cè)空白標(biāo)本，增加檢測(cè)成本，可行性較差[7]。血漿置換法雖然能對(duì)紅細(xì)胞參數(shù)很好地糾正，但會(huì)引起白細(xì)胞與血小板丟失，且置換次數(shù)越多丟失現(xiàn)象越嚴(yán)重。對(duì)于含有高效價(jià)CAs的血常規(guī)標(biāo)本，如何獲得更加真實(shí)的檢測(cè)結(jié)果仍是值得探究的問(wèn)題。

表3 41 ℃溫育30、60 min與室溫下血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的可比性驗(yàn)證

為較好消除CAs尤其是高效價(jià)CAs對(duì)血常規(guī)檢驗(yàn)的干擾，本研究通過(guò)對(duì)2例CAs效價(jià)>512的患者標(biāo)本進(jìn)行41 ℃溫育30 min，并與37 ℃溫育法的檢測(cè)結(jié)果比較，顯示41 ℃溫育可以得到更真實(shí)的檢測(cè)結(jié)果。與傳統(tǒng)37 ℃水浴2 h相比，該法周轉(zhuǎn)時(shí)間明顯縮短，又可避免血漿置換這一繁瑣而耗時(shí)的過(guò)程中可能會(huì)引入的一些不確定因素。最近有研究提示，對(duì)于含有CAs的標(biāo)本，41 ℃預(yù)熱1 min后利用網(wǎng)織紅細(xì)胞通道可以獲得比傳統(tǒng)的37 ℃預(yù)熱2 h更準(zhǔn)確的紅細(xì)胞參數(shù)，但MCHC除外[8- 9]。本研究結(jié)果進(jìn)一步支持41 ℃溫育用于快速糾正RBC及其參數(shù)的可行。同時(shí)，研究顯示2例冷凝集標(biāo)本在不同溫度水浴后的WBC、PLT均較室溫直接檢測(cè)有一定程度的升高。研究表明CAs除直接對(duì)紅細(xì)胞有作用外，也可影響中性粒細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)[2- 3]，這可能是患者標(biāo)本溫育后WBC和PLT計(jì)數(shù)升高的原因。

溫度作為血紅蛋白和紅細(xì)胞的一個(gè)重要變構(gòu)因子，過(guò)高的溫度可引起從血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)、功能以至紅細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能的顯著改變[10- 11]。孫秋瑾等[12]報(bào)道43 ℃溫育后會(huì)造成標(biāo)本脂蛋白變性，呈現(xiàn)出絮狀沉淀物，對(duì)紅細(xì)胞多個(gè)參數(shù)構(gòu)成干擾。為了進(jìn)一步探尋41 ℃水浴法本身對(duì)血常規(guī)檢測(cè)各個(gè)參數(shù)的影響，本研究收集74例無(wú)冷凝集素干擾的患者標(biāo)本，分別在41 ℃水浴30、60 min后與室溫檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示除PLT外，其余WBC、RBC、HCT、HGB、MCV、MCH和MCHC各參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果和室溫檢測(cè)結(jié)果之間無(wú)系統(tǒng)差異和比例差異。雖然PLT統(tǒng)計(jì)學(xué)上有一定的比例差異，但根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)果可比性驗(yàn)證顯示，包括PLT在內(nèi)的各參數(shù)其偏移均在臨床可接受范圍內(nèi)。因此，對(duì)于37 ℃水浴無(wú)法糾正的高效價(jià)CAs標(biāo)本，41 ℃溫育或許是一種較好的獲取真實(shí)紅細(xì)胞參數(shù)的替代方法。雖然這一方法仍需要在更大范圍的樣本選擇中得到證實(shí)，如原始細(xì)胞、非典型淋巴細(xì)胞或其他異常細(xì)胞存在的標(biāo)本，因?yàn)檫@些細(xì)胞固有的脆弱性，它們可能會(huì)因加熱而被破壞。另外，在所有方法中都應(yīng)考慮凝集不完全可逆的可能性。目前血細(xì)胞分析儀還不能提供可靠的參數(shù)來(lái)確認(rèn)凝集的完全解決，在計(jì)數(shù)前利用預(yù)熱玻片進(jìn)行血涂片鏡檢可有助于發(fā)現(xiàn)殘余凝集，以及排除其他MCHC升高的原因，例如球形紅細(xì)胞增多癥。

此外，本研究也提示了實(shí)體瘤與冷凝集之間的罕見(jiàn)關(guān)聯(lián)。CAs通常與感染、藥物反應(yīng)、自身免疫性疾病和血液系統(tǒng)惡性腫瘤有關(guān)，在實(shí)體腫瘤中的報(bào)道非常罕見(jiàn)。眾所周知，ABH血型抗原并非紅細(xì)胞所特有，在正常上皮細(xì)胞中也表達(dá)，但在各種癌癥細(xì)胞中顯著減少。I抗原是ABH抗原的前體，并在癌細(xì)胞中積累，可能是由于轉(zhuǎn)化不完全所致[13]。在癌癥組織中ABH抗原決定簇的缺失和I抗原增加可能是實(shí)體瘤患者出現(xiàn)冷凝集素的重要原因[14]。雖然2例患者均有冷凝集素，但患者血清乳酸脫氫酶水平正常或僅有輕微升高，HGB和膽紅素均在正常范圍，缺乏溶血的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)；此外，患者也沒(méi)出現(xiàn)遇冷或受涼后手足發(fā)紺或有雷諾氏現(xiàn)象，因此，尚不符合自身免疫性溶血性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)。研究顯示患者體內(nèi)是否發(fā)生補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血與冷凝集素的效價(jià)和熱幅均有一定關(guān)系[15]。此外，氣溫和季節(jié)也可能是影響患者發(fā)病的重要因素之一[16]。

綜上，本研究報(bào)道了2例實(shí)體瘤患者出現(xiàn)的冷凝集現(xiàn)象，并提出了41 ℃溫浴糾正高效價(jià)CAs樣本血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的可行性。CAs的存在通常是在實(shí)驗(yàn)室日常工作中隨機(jī)發(fā)現(xiàn)的，對(duì)于紅細(xì)胞參數(shù)尤其是MCHC異常升高，或RBC與HGB比例明顯失調(diào)，應(yīng)考慮冷凝集素的影響，并采取恰當(dāng)?shù)奶幚矸绞将@得更真實(shí)的結(jié)果。