周可欣 文 鑫 鄧 成 陳帥龍 齊興柱 駱 劍

(海南大學海洋學院, 海南省水產(chǎn)種業(yè)工程研究中心, 海洋生物國家級實驗教學示范中心, 南海海洋資源利用國家重點實驗室,海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室, ?？?570228)

體色是魚類形態(tài)多樣性的特征之一, 魚類的體色是由色素細胞及其所含的色素體產(chǎn)生的, 色素細胞的類型、大小、形態(tài)及分布的不同形成了豐富的體色, 為發(fā)育和進化提供了良好的材料[1]。魚類皮膚包括黑色素細胞、紅色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞等基本色素細胞[2]。魚類體色相關(guān)基因的突變和缺失能夠?qū)е缕つw著色的異常[3], 體色也受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié), 隨著環(huán)境的改變而產(chǎn)生適應性變化[4,5]。這種變化可以通過鱗片和皮膚中色素細胞內(nèi)的色素體選擇性地吸收特定波長的光而反射其他波長的光來完成[6]。魚類在生長過程中, 會產(chǎn)生生理上的體色變化, 可以通過色素細胞的運動改變魚類的體色[7—9], 同時也可通過色素細胞數(shù)量的增加或者減少對體色產(chǎn)生影響[10,11]。魚類在適應環(huán)境過程中, 光感受也會導致體色變化,例如光照強度和光照周期等會影響內(nèi)分泌系統(tǒng)對色素細胞生成代謝的調(diào)控[12]。

石斑魚種類眾多, 是全球珊瑚礁、海草場和海藻場生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵種, 不同種類的石斑魚擁有著不同的體色, 豐富的體色變化為其提供了關(guān)鍵的偽裝[13]。豹紋鰓棘鱸(Plectropomus leopardus)是一種主要分布于熱帶和亞熱帶海域的名貴礁棲石斑魚,其體色鮮艷呈紅色, 全身布滿藍白色斑點, 既可作為觀賞魚類, 也可作為高食用價值的經(jīng)濟物種。然而,豹紋鰓棘鱸的體色和斑紋會受到生理或環(huán)境因素的影響, 呈現(xiàn)出黑色和紅色, 并在應激狀態(tài)下發(fā)生顏色深淺的改變及斑紋的變異[14]。目前, 豹紋鰓棘鱸體色形成和變異的機理尚不明確, 因此, 深入探討豹紋鰓棘鱸的體色調(diào)控規(guī)律, 探究其皮膚色素細胞的種類和分布, 及應激狀態(tài)下色素細胞的變化, 將為探究其體色發(fā)育與變異的機制提供組織學的支撐。

本文以紅色和黑色的豹紋鰓棘鱸為對象, 對其不同部位的皮膚進行組織學切片和觀察, 揭示其色素細胞的組成、形態(tài)及分布規(guī)律, 并研究其受環(huán)境影響而產(chǎn)生應激狀態(tài)下的色素細胞形態(tài)變化, 不僅能揭示石斑魚類體色變異的多樣性機制, 為培育優(yōu)良體色的石斑魚品種奠定理論基礎, 也能夠加深對于色彩豐富的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的理解。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本文的實驗用魚選自海南省瓊海市鴻茂水產(chǎn)有限公司基地, 選取呈現(xiàn)體色差異的豹紋鰓棘鱸成魚, 黑色和紅色個體各30尾, 平均體重為(520.30±20.50) g, 平均每尾體長為(35.50±5.40) cm。

1.2 實驗分組

本實驗分為8組: 黑色魚背部組(BB)、黑色魚腹部組(BF)、黑色魚尾部組(BW)、紅色魚背部組(RB)、紅色魚腹部組(RF)、紅色魚尾部組(RW)、紅色魚應激組(RS)和紅色魚非應激組(RE)。

1.3 體色觀察

將魚體擦拭干凈后, 用相機(DSC-WX500)拍照, 并用色差儀(KONICA MINOLTA-CR-10Plus)對應激和非應激魚體的背部、腹部和尾部進行測量,色差儀使用標準白色板校準后測量樣品顏色, 并輸出比色后的色差數(shù)據(jù)。

剪下相同大小的黑色和紅色豹紋鰓棘鱸第一背鰭到第二背鰭下方, 測線鱗上方的背部皮膚、腹鰭到臀鰭上方, 測線鱗下方的腹部皮膚和尾柄處皮膚, 用生理鹽水潤洗后, 在體視顯微鏡下觀察, 利用五點取樣法[15]進行色素體統(tǒng)計, 來計算平均單位面積下黑色素體和紅色素體的數(shù)量, 從而得出色素體的密度。

1.4 石蠟切片

取豹紋鰓棘鱸的背部、腹部和尾部皮膚組織保存于Bouin氏液固定液中, 采用石蠟切片的方法,經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和展片、HE染色和封片等步驟后, 用組織切片掃描儀(Pannoramic MIDI)進行掃描和光學顯微鏡下觀察。

1.5 冰凍切片

取豹紋鰓棘鱸的尾部皮膚保存于4%多聚甲醛24h, 經(jīng)過蔗糖溶液脫水、OCT包埋和切片等步驟制成冰凍切片, 切片厚8—10 μm, 將組織貼于載玻片上, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 應激和非應激狀態(tài)處理

豹紋鰓棘鱸被捕撈即發(fā)生應激反應, 皮膚斑紋出現(xiàn)顯著變化, 為應激組; 在水體中緩慢加入魚用麻醉劑(MS-222), 麻醉后再撈出, 豹紋鰓棘鱸體色和斑紋不改變, 為非應激組。用剪刀將2組魚體的背部、腹部和尾部剪下面積為1 cm×1 cm, 厚度為2 mm的皮膚組織, 用PBS清洗后制作成裝片置于體視鏡(Motic SMZ-168)下觀察。

2 結(jié)果

2.1 豹紋鰓棘鱸體色差異分析

豹紋鰓棘鱸在應激狀態(tài)下呈現(xiàn)出快速的體色變化, b、d個體為非應激狀態(tài), 分別呈現(xiàn)出較黑和較紅的體色, 個體體色較深, 顏色分布均勻(圖 1)。在應激條件下, 3—5s即可發(fā)生變化, 色素體在不同的部位收縮情況有較大差異, 呈現(xiàn)出明顯的斑紋(a、c個體), 在側(cè)線上方黑色個體和紅色個體分別平均分布著黑色斑點和紅色斑點, 均圍繞著魚體的藍點分布, 斑點的大小和顏色沒有明顯差異, 其他部位皮膚顏色偏白, 斑點和其他部位皮膚顏色有著顯著深淺差異。而鰭條變化程度較低, 顏色變淺,尾鰭和臀鰭呈現(xiàn)出斑塊狀花紋。測線下方的腹部皮膚呈現(xiàn)條帶狀斑塊, 皮膚顏色較背部更深。

圖1 豹紋鰓棘鱸應激狀態(tài)和非應激狀態(tài)Fig. 1 The body color in stressed and unstressed state of Plectropomus leopardus

利用色差儀分別對不同的身體部位進行色差分析, 得出豹紋鰓棘鱸的背部和尾部顏色較深, 腹部顏色較淺。如表 1所示, 在紅色個體中非應激狀態(tài)下的背部色差值顯著高于應激狀態(tài), 在黑色個體中非應激狀態(tài)下的背部和腹部色差值顯著高于應激狀態(tài), 在應激狀態(tài)下紅色個體的背部和腹部色差值顯著高于黑色個體; 在非應激狀態(tài)下紅色個體的背部和尾部色差值顯著高于黑色個體。通過對不同體色豹紋鰓棘鱸色素細胞數(shù)量的觀察得出(圖 2),在黑色個體中, 黑色素體的分布較紅色個體更密;在紅色個體中, 僅存在少量的黑色素細胞。

圖2 非應激狀態(tài)下豹紋鰓棘鱸皮膚色素體密度比較Fig. 2 Comparison of pigment density of Plectropomus leopardus under non-stress state

表1 豹紋鰓棘鱸皮膚色差值比較Tab. 1 Comparison of color difference of Plectropomus leopardus

2.2 豹紋鰓棘鱸皮膚黑色素細胞組織學分析

觀察豹紋鰓棘鱸的皮膚石蠟切片(圖 3)可以得出, 皮膚的表皮層是由5—8層上皮細胞組成, 色素細胞主要分布于真皮層中, 色素細胞平行于表皮層排列緊密, 形成一條連續(xù)的色素條帶。

圖3 豹紋鰓棘鱸皮膚組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Microscopical observation on skin section of Plectropomus leopardus

分別觀察豹紋鰓棘鱸的紅色和黑色個體不同部位的皮膚切片(圖 4), 可以得出不同部位的皮膚黑色素細胞的分布數(shù)量也不相同。背部和尾部皮膚黑色素細胞密度比較大, 腹部的黑色素細胞數(shù)量較少; 對不同體色豹紋鰓棘鱸的腹部進行觀察, 可以得出黑色個體的黑色素細胞呈塊狀聚集在一起,而紅色個體的黑色素細胞分布比較稀疏; 觀察尾部皮膚, 可以看出黑色個體的黑色素細胞連續(xù)分布,數(shù)量顯著多于紅色個體, 而紅色個體的黑色素細胞則局部分散于尾部。

圖4 豹紋鰓棘鱸皮膚組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig. 4 Microscopical observation on skin section of Plectropomus leopardus

觀察不同體色豹紋鰓棘鱸皮膚冰凍切片可得出(圖 5), 黑色豹紋鰓棘鱸的尾部中含有大量的黑色素細胞和紅色素細胞, 相間分布。在紅色豹紋鰓棘鱸的尾部皮膚中, 可以明顯觀察到大面積分布的紅色素體, 幾乎不存在黑色素細胞。尾部皮膚組織中不僅色素細胞數(shù)量存在較大差異, 色素細胞的分布也存在差異, 在黑色個體中, 色素細胞平行于表皮基底層分布; 在紅色個體中, 色素細胞呈現(xiàn)不規(guī)則分布。

圖5 豹紋鰓棘鱸組織冰凍切片顯微結(jié)構(gòu)Fig. 5 microscopical observation of frozen section of tail tissue in Plectropomus leopardus

2.3 豹紋鰓棘鱸應激和非應激狀態(tài)下色素細胞觀察

對豹紋鰓棘鱸在應激狀態(tài)和非應激狀態(tài)下的觀察可以發(fā)現(xiàn), 應激狀態(tài)時體色會迅速變淺, 如圖 6，通過體視鏡顯微觀察可以發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)下色素細胞的形態(tài)。

圖6 非應激狀態(tài)和應激狀態(tài)下的豹紋鰓棘鱸表皮色素體Fig. 6 Microscopic observation results of the Plectropomus leopardus in unstress state and stress state

在非應激狀態(tài)下, 大多數(shù)的紅色素細胞和黑色素細胞為樹突狀、散射狀, 少數(shù)細胞形態(tài)為點狀。在非應激狀態(tài)下色素細胞體積較大、顏色較淺。其中, 黑色素細胞大小為20—35 μm, 紅色素細胞相較于黑色素細胞較小為20—25 μm。在應激狀態(tài)下, 色素細胞體積較小、顏色較深, 呈點狀、團塊狀分布, 細胞為圓形或橢圓形。其中, 黑色素細胞大小為15—30 μm, 紅色素細胞較小為10—15 μm。

3 討論

3.1 色素細胞與豹紋鰓棘鱸體色的關(guān)系

魚類的體色呈現(xiàn)出多樣性, 這主要是由色素細胞及其色素體的的分布、數(shù)量和種類決定的, 在大口黑鱸(Micropterus salmoides)、羅非魚(Tilapia)鰓細胞和斑馬魚(Brachydanio rerio var)幼魚中黑色素細胞主要分布在真皮層的疏松層中[16]。在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)的色素細胞遷移和分化研究中, 在表皮上也提取出了黑色素細胞[17]; 通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)匙吻鱘(Polyodon spathula)在表皮和真皮中均可觀察到色素體, 其黑色素細胞為圓形或不規(guī)則, 可以自由流動[18]。這說明色素細胞在表皮層和真皮層中均可分布。本實驗通過對紅色和黑色豹紋鰓棘鱸不同部位進行組織學觀察, 其皮膚主要可以分為表皮層和真皮層, 其色素細胞均分布于真皮層的疏松層中, 與大口黑鱸和羅非魚中色素細胞的分布特征較為一致。

當魚類受到環(huán)境因子[19]、飼料[20]和基因遺傳等因素的影響[21]時, 體色會通過色素細胞的種類、大小、形狀、數(shù)量和排列方式[22]及色素細胞的比例和色素小體的分布發(fā)生改變[23,24]。本實驗通過觀察豹紋鰓棘鱸的皮膚得出不同部位的色素細胞數(shù)量存在著顯著的差異, 其中背部和尾部黑色素細胞分布較多, 呈現(xiàn)出明顯的色素條帶, 而腹部色素細胞數(shù)量較少, 呈團塊狀分布, 并且在紅色的豹紋鰓棘鱸中, 紅色素細胞的比例顯著高于黑色的豹紋鰓棘鱸。在對不同魚類的研究中發(fā)現(xiàn), 隨著魚體的發(fā)育，色素細胞的類型也會發(fā)生改變, 當色素細胞聚集在一起時，魚類體表就會出現(xiàn)色素條帶和斑塊[25]。已有的研究發(fā)現(xiàn), 在紅、藍和金屬色系的暹羅斗魚(Betta splendensRegan)中, 影響紅色系深淺的關(guān)鍵因素是紅、黃色素細胞的比例, 當黑色素細胞越多, 魚體體色越深[26]。橘色雙冠麗魚(Amphilophus citrinellus)的體色鮮艷程度在發(fā)育過程中和其色素細胞數(shù)量變化是一致的, 黑色素細胞的減少及黃色素細胞和紅色素細胞的增多有可能和魚體體色變淺相關(guān), 不同種類色素細胞的比例和分布有可能導致魚類體色的變化[27]。這與本實驗中不同體色豹紋鰓棘鱸紅色素細胞和黑色素細胞比例存在差異的現(xiàn)象一致, 因此, 魚體不同部位的呈色程度受到色素細胞數(shù)量的影響, 呈色較深的部位色素細胞數(shù)量多, 分布密集。該實驗結(jié)果中不同部位色素細胞的分布差異可能與豹紋鰓棘鱸生長過程中規(guī)避敵害和自我保護有關(guān), 其腹部色素細胞較少呈色較淺有利于自我隱蔽, 而背部和尾部色素細胞較多呈色較深可能與皮膚中感光調(diào)節(jié)有關(guān)。

3.2 在應激狀態(tài)下豹紋鰓棘鱸的體色變化

兩棲動物及其他的變色動物的體色改變, 主要是由于色素細胞及色素體的分布不同而導致的[28],包括色素體的聚集和分散, 使得皮膚的顏色發(fā)生改變[11]。通過觀察得到豹紋鰓棘鱸的皮膚中主要有紅色素細胞和黑色素細胞, 其中呈樹突狀的黑色素細胞大量分布在體表。色素細胞的體積影響著其細胞分支, 體積越大, 色素細胞分支越多, 則含有更多的色素小體, 使得皮膚顏色加深[29]。例如在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的研究中, 通過使用低劑量的MCH使黑色素細胞分支增多, 從而加深了魚的體色[30]。這和本實驗的研究結(jié)果相一致, 豹紋鰓棘鱸色素體聚集會導致色素在皮膚上的覆蓋度顯著降低, 從而呈現(xiàn)淺色; 而色素體的分散使得覆蓋度增加, 導致表觀體色加深。

一些魚類所處環(huán)境改變或應激時, 其體表的色素細胞會發(fā)生聚集或分散, 當色素細胞分散時魚的體色會變深, 而當色素細胞聚集時, 魚的體色會變淺[31,32]。在本實驗研究結(jié)果中, 豹紋鰓棘鱸在環(huán)境條件發(fā)生改變時能夠迅速變?yōu)閼顟B(tài), 黑色素細胞和紅色素細胞變小呈顆粒狀聚集在一起, 使得魚的體色變淺。有關(guān)研究結(jié)果表明, 雄性雨蛙(Litoria wilcoxii)在抱合期間經(jīng)歷從棕色到黃色的快速顏色變化, 并在被捕獲后逐漸失去黃色, 這可能是受到外界壓力后黑色素細胞移位的結(jié)果[11]。在大口黑鱸的研究中發(fā)現(xiàn), 色素細胞膨大時, 色素展開,體色格外鮮明, 而當色素細胞收縮時, 色素隱沒, 體色亦隨之黯淡或隱沒[16]。在大黃魚(Larimichthys crocea)的相關(guān)研究中表明, MSH多肽可以分散大黃魚的黃色素細胞, 使其體色緩慢變黃[33]。比目魚(Pleuronectiformes)能夠相當逼真地與多種環(huán)境相匹配, 調(diào)整體表斑塊, 其變色時間為2—8s[34]。綜上所述, 豹紋鰓棘鱸的體色變化原因與已有報道一致,是由色素細胞的形態(tài)導致。然而當豹紋鰓棘鱸受到外界環(huán)境的刺激時, 可能由神經(jīng)調(diào)控其紅色素細胞和黑色素細胞色素體發(fā)生迅速的運動, 使背部和腹部呈現(xiàn)出不同的斑紋和顏色, 可能與珊瑚礁魚類躲避敵害有關(guān), 3—5s即可完成變化, 其體色變化的速度與其他魚類存在顯著差異。