姚朝瑞 馬 聘 李大鵬 李 莉 湯 蓉

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

硒(Selenium, Se)是動(dòng)物的必需微量元素之一。自1957年Schwar等[1]研究發(fā)現(xiàn)硒是阻止大鼠(Raltus norvegicus)食餌性肝壞死的第三因子的主要組分, 首次證實(shí)動(dòng)物需要硒元素。目前研究已顯示硒元素的重要生物功能包括抗氧化、抗應(yīng)激、加強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗腫瘤等[2,3]。Ferbal等[4]發(fā)現(xiàn)在鯉(Cyprinus carpio)飼料中添加適量硒元素, 能有效抵抗鉛導(dǎo)致的肝臟和腦部的氧化損傷。Talise等[5]發(fā)現(xiàn), 在飼料中添加亞硒酸鈉能有效預(yù)防百草枯對(duì)斑馬魚(Danio rerio)的氧化損傷。Saffari等[6]證實(shí)在鯉幼魚飼料中補(bǔ)充納米硒能顯著提升鯉生長性能和飼料利用率。而硒缺乏會(huì)損傷幼齡草魚的免疫器官和免疫功能[7]。由于飼料中硒的利用率偏低及各種應(yīng)激因子的不利影響, 養(yǎng)殖魚類對(duì)硒元素的需求可能會(huì)不斷提高[8]。

亞硝酸鹽是生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的一個(gè)天然組成部分, 養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度偏高也是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中一個(gè)不容忽視的問題[9]。近年來高密度的集約化養(yǎng)殖方式造成的高蛋白殘餌和高含氮排泄物不斷沉積于池底, 造成水體內(nèi)源性來源的亞硝酸鹽含量不斷增高[10]。淡水魚類對(duì)亞硝酸鹽的吸收主要是通過與CⅠ-有效地競爭鰓上氯化物的主動(dòng)吸收機(jī)制[11—13]。高濃度或長時(shí)間的亞硝酸鹽暴露會(huì)致使魚體應(yīng)激增強(qiáng), 組織缺氧, 體內(nèi)氧自由基積累, 抑制抗氧化系統(tǒng), 直接或間接的影響魚類的免疫活力[14—16], 嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)生物的暴發(fā)性死亡, 如何提高養(yǎng)殖魚類對(duì)亞硝酸鹽暴露的抵抗能力成為近些年來的研究熱點(diǎn)。

Keap1-Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)通路具有抗氧化應(yīng)激和維持氧化還原平衡的功能, 能夠誘導(dǎo)其下游的抗氧化相關(guān)基因(如GPX、SOD和CAT等)表達(dá), 提高機(jī)體抗氧化能力[17,18], Fontagne′-Dicharry等[19]發(fā)現(xiàn)膳食硒能通過上調(diào)Nrf2通路, 提高GPX和CAT等抗氧化酶活性, 來提高虹鱒育苗的抗氧化能力,Noha等[20]在大鼠中也有發(fā)現(xiàn)硒能通過上調(diào)Nrf2通路來抵抗肝臟砷中毒現(xiàn)象。

草魚(Ctenopharyngodon idella)屬于鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬, 生長速度快, 單位面積產(chǎn)出高, 而且肉質(zhì)嫩白, 含豐富的營養(yǎng)成分, 具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益和營養(yǎng)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn), 給草魚適當(dāng)補(bǔ)充硒元素能有效提高肝臟抗氧化性, 維持組織結(jié)構(gòu)完整[21]。肝臟是魚體重要的代謝和解毒器官, 本研究以草魚肝細(xì)胞為研究對(duì)象, 觀察和檢測硒孵育后肝細(xì)胞在不同濃度的亞硝酸鈉暴露后, 其氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的狀況, 以探究硒對(duì)亞硝酸鈉導(dǎo)致的草魚肝細(xì)胞損傷的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚肝細(xì)胞系(L8824)購自中國典型培養(yǎng)物典藏中心; M199培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗(Penicillin Streptomycin, PS)均購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自四季青公司; 磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered solution, PBS)購自HyClone公司; 細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8)購自同仁化學(xué)科技有限公司; 總蛋白定量(BCA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒均購自南京建成試劑公司; Annexin V-FITC /PI凋亡試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司; 熒光定量試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司; 亞硝酸鈉(NaNO2)為分析純, 購自國藥集團(tuán); 亞硒酸鈉(Na2SeO3)為分析純, 購自天津市化學(xué)試劑研究所。

1.2 草魚肝細(xì)胞L8824的培養(yǎng)

L8824細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、鏈霉素(100 μg/mL)和青霉素(100 IU/mL)的M199培養(yǎng)基中, 在28℃和5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞生長狀況, 2—3d傳代1次, 傳代時(shí)用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化, 取生長狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活性檢測

采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性, 取生長良好處于對(duì)數(shù)生長期的L8824細(xì)胞(6—8×105個(gè)/mL)接種于96孔板中, 保證每孔數(shù)量不低于1000個(gè), 每孔100 μL,培養(yǎng)12h, 待細(xì)胞在孔底鋪至70%—80%, 分別加入不同濃度的亞硒酸鈉和亞硝酸鈉, 使亞硒酸鈉的終濃度為0、0.5、1、2、5、10、15、20、25和35 μmol/L,培養(yǎng)3h、6h、12h、24h、36h和48h, 亞硝酸鈉終濃度為0、1、2.5、7.5、10、15、20、25、30和50 mg/L,培養(yǎng)24h, 空白組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 每組8個(gè)復(fù)孔, 每孔加入10 μL的CCK-8, 28℃孵育2h, 置于多功能酶標(biāo)儀上, 檢測波長為450 nm的吸光值(Optical density,OD), 細(xì)胞存活率(%)=[實(shí)驗(yàn)組-空白組]/[對(duì)照組-空白組] ×100。

將實(shí)驗(yàn)分為4組, 對(duì)照組: 加入等量M199培養(yǎng)基; Se組: 10 μmol/L的Na2SeO3作用36h; NaNO2組:不同濃度的NaNO2暴露, 使NaNO2的終濃度為5、10和25 mg/L, 暴露24h; Se+NaNO2組: 先加入終濃度為10 μmol/L的Na2SeO3預(yù)處理12h, 再加入5、10和25 mg/L的NaNO2, 暴露24h。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的L8824接種于12孔板中, 經(jīng)對(duì)照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 用PBS洗滌2次, 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化, 用CCD系統(tǒng)拍照。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的L8824接種于12孔板中, 經(jīng)對(duì)照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 胰蛋白酶消化,1000 r/min離心6min得到細(xì)胞沉淀, 用PBS洗滌2次,PBS懸浮細(xì)胞, 分裝至1.5 mL離心管中, 在液氮和28℃水浴鍋中反復(fù)凍融3次, -20℃凍存。BCA法測定樣品蛋白濃度, 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作, 用酶標(biāo)儀在562 nm處測定, 并計(jì)算樣品蛋白活性; 超氧化物歧化酶(SOD): 按照SOD試劑盒操作, 用酶標(biāo)儀在550 nm處測定, 并計(jì)算SOD的活性; 過氧化氫酶(CAT): 按照CAT試劑盒操作, 用酶標(biāo)儀在405 nm處測定, 并計(jì)算CAT的活性; GSH-PX 活性測定: 按照GSH-PX試劑盒操作, 用酶標(biāo)儀在 412 nm 處測定, 并計(jì)算 GSH-PX 的活性。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

取生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的L8824接種于12孔板中, 經(jīng)對(duì)照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 不含EDTA的胰蛋白酶消化, 300×g, 4℃離心5min收集細(xì)胞, 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次, 每次均需300×g, 4℃離心5min,收集1—5×105細(xì)胞。吸棄PBS, 加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞, 再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution, 輕輕混勻, 然后避光, 室溫反應(yīng)10—15min, 最后加入400 μL 1×Binding Buffer, 混勻后放置于冰上, 樣品在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 基因表達(dá)檢測

取生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的L8824接種于6孔板中, 經(jīng)對(duì)照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 每孔加入1 mL Trizol, 用Trizol法抽提細(xì)胞RNA, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測其濃度和質(zhì)量。用Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 實(shí)際操作根據(jù)試劑盒進(jìn)行。得到cDNA后, 再用Hifair?qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus) 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析,β-actin作為內(nèi)參基因, 設(shè)計(jì)各個(gè)基因的引物(表 1), 反應(yīng)體系為: Master Mix 10 μL,上游引物0.4 μL, 下游引物0.4 μL, cDNA1.2 μL,ddH2O 8 μL, 反應(yīng)條件為: 95℃ 5min, 95℃ 10s,55—60℃ 20s, 40個(gè)循環(huán), 72℃ 20s, 每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

表1 qPCR引物Tab. 1 Primers used for qPCR

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,數(shù)據(jù)分析由SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 然后通過 Duncan氏法進(jìn)行多重比較, 顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉和亞硝酸鈉對(duì)L8824細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示, 低濃度亞硒酸鈉處理后的細(xì)胞活力高于對(duì)照組, 較對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05), 活力呈先上升后下降趨勢(shì), 在10 μmol/L 3—36h階段活力值最高(圖 1), 在實(shí)驗(yàn)分組時(shí), 選擇10 μmol/L,12h作為Se+NaNO2組的預(yù)處理?xiàng)l件。在亞硝酸鈉暴露后, 細(xì)胞活力隨著濃度的升高而降低(圖 2)。

圖1 不同濃度亞硒酸鈉孵育不同時(shí)間對(duì)L8824細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of sodium selenite incubation at different times on the viability of L8824 cells

圖2 不同濃度亞硝酸鈉暴露24h對(duì)L8824細(xì)胞活力的影響Fig. 2 Effect of sodium nitrite exposure for 24h on the viability of L8824 cells

2.2 亞硒酸鈉對(duì)亞硝酸鈉暴露后的L8824細(xì)胞形態(tài)的影響

結(jié)果顯示, 對(duì)照組L8824細(xì)胞呈梭形, 正常貼壁生長, 細(xì)胞邊界清晰, 圓潤, 未出現(xiàn)細(xì)胞空泡; Se組細(xì)胞正常貼壁生長, 形態(tài)清晰, 較對(duì)照組無明顯差異; 在NaNO2組中, 5 mg/L組細(xì)胞貼壁能力開始變?nèi)? 有小范圍細(xì)胞脫落現(xiàn)象, 脫落細(xì)胞周圍開始出現(xiàn)空泡; 10 mg/L組細(xì)胞脫落范圍變大, 漂浮細(xì)胞增多, 細(xì)胞空泡較明顯; 25 mg/L組細(xì)胞開始大面積脫落, 皺縮, 毒性作用明顯; Se+NaNO2(5、10 和25 mg/L)組細(xì)胞貼壁良好, 邊界清晰, 無皺縮現(xiàn)象, 有極少數(shù)空泡, 經(jīng)硒孵育后, 在亞硝酸鈉暴露下細(xì)胞仍生長良好(圖 3)。

圖3 亞硒酸鈉和亞硝酸鈉暴露后L8824細(xì)胞形態(tài)觀察(10×)Fig. 3 Morphological observation of L8824 cells after exposure to sodium selenite and sodium nitrite

2.3 亞硒酸鈉對(duì)亞硝酸鈉誘導(dǎo)L8824細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果表明, 不同濃度的NaNO2對(duì)L8824細(xì)胞有不同程度的促凋亡作用, 隨著濃度的增高, 早期和晚期凋亡細(xì)胞逐步增多, 較對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05), 當(dāng)NaNO2濃度在25 mg/L時(shí), 細(xì)胞凋亡率可達(dá)18.69%, 在Se+NaNO2組中, 細(xì)胞凋亡水平顯著下降, 平均凋亡率為11.34%。結(jié)果顯示, 硒的預(yù)孵育能有效緩解亞硝酸鹽暴露導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡(圖 4)。

圖4 亞硒酸鈉預(yù)孵育對(duì)亞硝酸鈉誘導(dǎo)L8824細(xì)胞凋亡的影響Fig. 4 Effects of sodium selenite and sodium nitrite on apoptosis of L8824 cells

2.4 亞硒酸鈉對(duì)亞硝酸鈉誘導(dǎo)L8824細(xì)胞氧化損傷的影響

結(jié)果表明, 在NaNO2濃度為5 mg/L時(shí), SOD顯著上升, GPX顯著降低(P＜0.05), CAT無明顯變化,在NaNO2濃度為10和25 mg/L時(shí), GPX、SOD和CAT的活性均逐漸降低(P＜0.05), 在NaNO2濃度為25 mg/L時(shí), SOD和CAT持續(xù)降低(P＜0.05), GPX無明顯變化, 在亞硒酸鈉預(yù)孵育12h后, 各組細(xì)胞的GPX、SOD和CAT的活性基本能維持在正常水平,較對(duì)照組無顯著性差異。結(jié)果顯示, 硒的預(yù)孵育能提高細(xì)胞抗氧化能力, 抵抗NaNO2暴露帶來的氧化損傷(P＞0.05; 圖 5)。

圖5 亞硒酸鈉預(yù)孵育對(duì)亞硝酸鈉誘導(dǎo)L8824細(xì)胞氧化損傷的影響Fig. 5 Effect of sodium selenite on oxidative damage of L8824 cells induced by sodium nitrite

2.5 亞硒酸鈉對(duì)亞硝酸鈉暴露后的L8824細(xì)胞抗氧化及凋亡相關(guān)基因的影響

結(jié)果顯示, 與對(duì)照組細(xì)胞相比, Se組細(xì)胞中的chop、bax、bcl-2和keap1 mRNA表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05),Nrf2、gpx、sod和catmRNA表達(dá)量顯著上升(P＜0.05), NaNO2組細(xì)胞中,chop和baxmRNA表達(dá)量顯著上升(P＜0.05), 當(dāng)NaNO2濃度為5 mg/L時(shí),sodmRNA表達(dá)量顯著上升(P＜0.05), 濃度為10和25 mg/L時(shí),sod、gpx和catmRNA表達(dá)量顯著下降(P＜0.05), 在Se+NaNO2組中,chop、bax、gpx、sod和catmRNA表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05),其中NaNO2濃度為5和10 mg/L時(shí),bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)。結(jié)果表明, 細(xì)胞抗氧化能力的增強(qiáng)可能是通過Nrf2-Keap1通路來實(shí)現(xiàn)的(圖 6)。

圖6 亞硒酸鈉預(yù)孵育對(duì)L8824細(xì)胞酶活及凋亡相關(guān)基因的影響Fig. 6 Effect of sodium selenite preconditioning on enzyme activity and expression of apoptosis-related genes in L8824 cells

3 討論

3.1 硒對(duì)草魚肝細(xì)胞抗氧化功能的影響

已有研究表明, 硒可通過增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化功能, 清除過氧化物, 保護(hù)生物膜和生物大分子免受氧化損傷, 降低水產(chǎn)動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率[22—25]。在草魚日糧中添加0.6—1.2 mg/kg的硒(Na2SeO3)能增強(qiáng)草魚機(jī)體抗氧化功能[21], 在鯉和虹鱒幼魚日糧中分別添加0.7和0.5—1.7 mg/kg的硒元素, 也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象[6,19], 與本實(shí)驗(yàn)中硒元素濃度基本一致。在本實(shí)驗(yàn)中, 10 μmol/L 亞硒酸鈉的預(yù)孵育能有效提高肝細(xì)胞S O D、C A T 和G P X 的活性(P＜0.05)。GPX的活性中心是硒半胱氨酸, 是衡量機(jī)體硒水平的一項(xiàng)重要生化指標(biāo)[19], 硒孵育后能顯著提高GPX的活性, 表明10 μmol/L 的亞硒酸鈉作用12h后, 硒元素已進(jìn)入胞內(nèi)并發(fā)揮作用。

高濃度亞硝酸鹽暴露會(huì)使魚體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(ROS), 如超氧陰離子自由基(), 羥自由基(·OH)和 H2O2等[26,27], 還會(huì)抑制細(xì)胞清除活性氧的相關(guān)酶的活性, 魚體對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力下降,免疫代謝功能失調(diào), 免疫力下降, 則會(huì)誘發(fā)魚類發(fā)病[28,29]。在NaNO2暴露后, 肝細(xì)胞SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì), 較對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05),CAT和GPX活性均有顯著性抑制(P＜0.05)。這可能是由于低濃度短時(shí)間的亞硝酸鹽暴露激活了細(xì)胞自身抗氧化系統(tǒng), SOD升高, 清除胞內(nèi)自由基; 而高濃度亞硝酸鹽使細(xì)胞產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基(), 消耗大量SOD, 隨著亞硝酸鈉濃度逐漸升高, 細(xì)胞自身清除的平衡機(jī)制被打破, SOD受到抑制。同樣, SOD在歧化反應(yīng)及與其他抗氧化酶反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生較多的H2O2, 消耗大量CAT和GPX, 且過氧化氫酶系統(tǒng)可能會(huì)通過氧化來解NaNO2的毒性機(jī)制[30], 在一段時(shí)間后, CAT和GPX便開始下降。

而在硒預(yù)孵育12h后再用亞硝酸鈉暴露, 肝細(xì)胞GPX、SOD和CAT均能基本維持在正常水平(P＞0.05)?？赡苁羌?xì)胞經(jīng)硒預(yù)孵育后, 胞內(nèi)抗氧化酶活性升高, 當(dāng)亞硝酸鹽暴露產(chǎn)生大量自由基后, 這些抗氧化酶能及時(shí)有效的清除自由基, 使細(xì)胞維持正常的生理機(jī)制, 表明此時(shí)細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng), 并能抵抗一定濃度亞硝酸鹽暴露導(dǎo)致的氧化損傷。

3.2 硒對(duì)抗氧化基因和Nrf2/Keap1通路基因表達(dá)的影響

Nrf2/Keap1介導(dǎo)的信號(hào)通路具有抗氧化應(yīng)激和維持氧化還原平衡的功能, 非應(yīng)激狀態(tài)時(shí),Keap1在細(xì)胞質(zhì)和Nrf2相結(jié)合, 促進(jìn)Nrf2蛋白泛素化和蛋白酶體降解, 維持Nrf2在低水平狀態(tài), 應(yīng)激狀態(tài)時(shí),Nrf2的泛素化和蛋白酶體降解被阻斷,Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi), 誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)相關(guān)基因的表達(dá)[31,32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在補(bǔ)硒組中,keap1、sod、cat和gpxmRNA表達(dá)量顯著上升(P＜0.05), 在硒預(yù)孵育后, 再經(jīng)亞硝酸鹽暴露, 細(xì)胞中g(shù)px、sod和catmRNA表達(dá)量也能維持在正常水平, 較正常組無顯著性差異(P＞0.05)。Nrf2/Keap1通路能夠誘導(dǎo)與ROS清除相關(guān)的基因表達(dá), 如SOD和CAT等, 減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量[33]。在雞的肝細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)硒能通過激活Nrf2/Keap1通路來抵抗重金屬鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[34]。在本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞可能通過上調(diào)Nrf2/Keap1通路, 誘導(dǎo)gpx、sod和cat基因表達(dá), 提高抗氧化酶活性, 來增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力, 并能在一定程度上抵抗亞硝酸鹽暴露帶來的抗氧化酶活性降低, 維持細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)平衡。

3.3 硒對(duì)草魚肝細(xì)胞凋亡的作用

細(xì)胞凋亡是指為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定, 由凋亡相關(guān)基因調(diào)控的細(xì)胞自主和有序的死亡, 又稱程序性細(xì)胞死亡, 是細(xì)胞為了更好的適應(yīng)環(huán)境而采取的一種主動(dòng)的方式[35]。長時(shí)間或高濃度的亞硝酸鹽暴露能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[36]。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)上看, 隨著亞硝酸鹽的濃度升高, 細(xì)胞貼壁能力下降, 成片脫落, 而硒預(yù)孵育12h后的細(xì)胞生長良好, 形態(tài)正常, 基本接近正常細(xì)胞組, 表明硒的預(yù)孵育有利于細(xì)胞在亞硝酸鹽的暴露中維持正常生長形態(tài), 維持貼壁能力。在FITC和PI雙熒光染色后, 觀察細(xì)胞凋亡特點(diǎn),由亞硝酸鹽引起的細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性, 且主要變化集中在凋亡晚期, 較正常組及補(bǔ)硒組凋亡細(xì)胞顯著增加(P＜0.05), 相反的是, 硒的預(yù)孵育能顯著降低L8824的凋亡率, 并使其恢復(fù)至正常水平。

硒能有效降低細(xì)胞中bax/bcl-2比值[37], 而長時(shí)間高濃度亞硝酸鹽的暴露會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[38], 在基因表達(dá)的結(jié)果中, 亞硝酸鹽暴露能上調(diào)L8824細(xì)胞中chop和bax的表達(dá),bax/bcl-2比值顯著上升(P＜0.05), 而在硒預(yù)孵育12h后的細(xì)胞中,bcl-2上調(diào),bax/bcl-2比值顯著下降(P＜0.05), 但在25 mg/L時(shí),bcl-2下降到無顯著性差異(P＞0.05), 在亞硝酸鹽5 mg/L組下調(diào)了chop和bax的表達(dá)。從流式和凋亡基因結(jié)果分析, 隨著亞硝酸鹽暴露濃度升高, 硒的保護(hù)作用可能會(huì)逐漸失效。亞硝酸鹽能啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路, 引發(fā)了L8824的凋亡, 而亞硒酸鈉的預(yù)孵育能上調(diào)抗凋亡基因表達(dá), 維持促凋亡基因表達(dá)在正常水平, 能有效緩解亞硝酸鹽帶來的細(xì)胞損傷和凋亡。

綜上所述, 給草魚肝細(xì)胞適當(dāng)補(bǔ)充硒元素能在一定程度和范圍內(nèi)有效緩解亞硝酸鹽暴露帶來的抗氧化系統(tǒng)失衡, 其中Keap1-Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)通路可能發(fā)揮了重要作用, 同時(shí)可以降低細(xì)胞凋亡率,維持細(xì)胞正常生長, 但隨著亞硝酸鹽濃度的增高,硒的保護(hù)作用可能會(huì)逐漸失效。