陳博威，劉柏炎，2＊＊，黃 昕，易 健，唐榮梅，王小菊

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 長沙410007；2.益陽醫(yī)學高等?？茖W校 益陽413002；3.益陽醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院 益陽413002）

腦梗死是我國常見的致死性疾病，并常遺留神經(jīng)后遺癥，給社會、家庭和個人帶來了沉重的負擔[1]。目前，針對腦梗死急性期的治療以靜脈溶栓為主[2]，但其適應癥狹窄，在臨床運用中仍存在諸多限制。補陽還五湯是我國治療中風的經(jīng)典名方，既往循證研究表明，補陽還五湯治療急性腦梗死在療效與安全性方面有一定的優(yōu)勢[3]。課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能通過誘導神經(jīng)再生[4]，促進血管新生[5]，抑制炎癥反應[6]及調(diào)控細胞自噬[7]等方式，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。然而以往研究都是針對單一靶點與單一通路，無法系統(tǒng)闡明補陽還五湯治療急性腦梗死的多靶點效應機制。

哺乳動物中有大約98%的RNA是非翻譯的調(diào)節(jié)性RNA分子，其中長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）占絕大部分。lncRNA因其不被翻譯成蛋白質(zhì)的特點，長期以來一直被認為是“轉(zhuǎn)錄噪音”。但隨著研究的深入，lncRNA被發(fā)現(xiàn)可以通過細胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控、RNA降解、基因印記及染色質(zhì)重塑等形式，積極參與許多重要的生物過程[8]。此外，目前亦發(fā)現(xiàn)大量lncRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有特異表達，并廣泛參與了對大腦發(fā)育、神經(jīng)分化及認知與記憶功能的調(diào)控[9]，提示其可能是治療腦梗死的新靶點。然而，目前l(fā)ncRNA與急性腦梗死的研究多為基礎研究，故仍需在臨床背景下深入研究lncRNA在腦梗死發(fā)病機制中的作用。外泌體是一類直徑約40-100 nm的小囊泡，廣泛的存在于血液、唾液等體液中，為細胞間通訊的重要媒介，可保護各類信號分子不被降解[10]。既往研究表明外泌體可通過融合、吞噬等方式攜帶包括lncRNA等的各類信號分子快速通過血腦屏障，參與神經(jīng)血管單元的細胞信號傳遞，在腦梗死后發(fā)揮神經(jīng)保護作用[11]，提示外泌體在急性腦梗死的診斷及治療過程中具有潛在價值。

目前，基于基因芯片的高通量檢測技術(shù)能夠從整個轉(zhuǎn)錄組水平探索疾病的發(fā)生、發(fā)展，已廣泛用于一些疾病基因表達譜分析和尋找特異性分子標志物。但截至目前，還未見補陽還五湯治療急性腦梗死lncRNA表達譜的研究報道。因此，基于前期研究認識，本研究首次同時從外泌體及l(fā)ncRNA的角度，采用基因芯片技術(shù)分析補陽還五湯對急性腦梗死患者血清外泌體lncRNA表達譜的影響，以期系統(tǒng)闡明補陽還五湯抗腦缺血損傷的機理，并為后續(xù)的臨床及基礎研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

急性腦梗死患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中的診斷標準[12]：急性起??；局灶性神經(jīng)功能缺損（一側(cè)面部麻木或肢體無力，語言障礙等），少數(shù)為全面神經(jīng)功能缺損；影像學出現(xiàn)責任病灶或癥狀/體征持續(xù)24 h以上；排除非血性病因；顱腦CT/MRI排除腦出血。

1.2 納入和排除標準

納入標準：年齡35歲-80歲；首次發(fā)病；發(fā)病時間6 h-7天；未能進行靜脈溶栓或介入取栓治療；美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（national institutes of health stroke scale，NIHSS）評分在7分-10分之間，患者或其家屬對本研究的目的知情同意并簽署知情同意書。

排除標準：房顫引發(fā)的心源性腦栓塞；近1個月內(nèi)曾服用激素等免疫抑制劑；合并有風濕性心臟病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病及嚴重各臟器功能不全；近2周內(nèi)有明確的急性感染跡象；在研究期間自然脫離的病例，使臨床資料不全者。

1.3 一般資料

選擇2019年8月-10月在益陽醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院、桃江縣中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦梗死患者6例，按隨機數(shù)字表法分為觀察組和對照組。其中觀察組4例患者予以補陽還五湯聯(lián)合西醫(yī)基礎治療，對照組2例患者予以單純西醫(yī)治療。兩組在年齡、性別構(gòu)成方面差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本試驗方案經(jīng)益陽醫(yī)學高等?？茖W校倫理委員會批準。

1.4 治療方法

觀察組4例患者給予補陽還五湯聯(lián)合西醫(yī)基礎治療，對照組2例患者給予單純西醫(yī)基礎治療。補陽還五湯由黃芪60 g、赤芍15 g、川芎10 g、當歸10 g、地龍10 g、桃仁10 g、紅花6 g組成，每天1劑，水煎劑，分兩次口服或鼻飼管注入。西醫(yī)基礎治療方案包括應用阿司匹林（批號20171021德國拜耳醫(yī)藥有限公司）100 mg，1次/天或氯吡格雷（批號20180029賽諾菲（杭州）制藥有限公司）75 mg，1次/天；阿托伐他汀鈣片（批號20070060輝瑞制藥有限公司）20 mg，1次/天；依達拉奉注射液（批號20031342南京先聲東元制藥有限公司）30 mg，2次/天；營養(yǎng)支持等治療。對合并糖尿病、高血壓者均給予降糖、降壓及對癥治療,并詳細記錄合并治療的藥物。

1.5 檢測方法

1.5.1 標本收集

治療后的第7天清晨空腹抽取10 mL靜脈血，使用真空采血管收集標本，4℃1600 rpm離心10 min，離心半徑20 cm，借助移液槍小心吸取上層血清，-80℃保存送檢。

1.5.2 分離血清外泌體

按操作手冊采用外泌體exoRNeasy Serum-Plasma Midi Kit（貨號：7704，Qiagen公司，德國）先分離外泌體，然后采用Trizol法提取總RNA，包括mRNA、lncRNA和其他非編碼RNA等，經(jīng)安捷倫2100生物分析儀（安捷倫公司，美國）電泳質(zhì)檢合格后備用。

1.5.3 lncRNA芯片檢測

采用SBC Human LncRNA 4x180k芯片（貨號：074348，安捷倫公司，美國）按說明書標準操作流程進行，包括RNA熒光標記、標記物芯片雜交、芯片洗滌和掃描等環(huán)節(jié)。

1.5.4 差異lncRNA數(shù)據(jù)分析

運用R語言“l(fā)imma”軟件包[13]，將基因芯片掃描得到的原始數(shù)據(jù)進行歸一化處理，隨后將歸一化數(shù)據(jù)采用表達差異倍數(shù)（log2（FC）的絕對值）小于0.5或大于2.0以及P<0.05對差異表達基因進行篩選。

1.5.5 差異表達lncRNA的富集分析

運用R語言“Biomanager”、“ClusterProfiler”等軟件包[14]，將得到的差異lncRNA的順式（cis）作用靶基因進行基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。其中cis作用靶基因指在每個lncRNA上下游10kb范圍內(nèi)，可能受其調(diào)控的mRNA[15]。GO富集分析由生物過程，細胞組成和分子功能組成，三個部分各自描述了基因產(chǎn)物可能形式的分子功能，參與的生物過程和所處的細胞環(huán)境。KEGG基因富集分析可將已知的基因組注釋信息進行分類，對差異顯著的信號通路進行富集，有助于找到顯著性差異變化的生物學調(diào)控通路[16]。

2 結(jié)果

2.1 差異lncRNA的散點圖與火山圖

將原始數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，以log2（FC）的絕對值小于0.5或大于2.0，以及P值小于0.05篩選差異表達lncRNA。散點圖與火山圖見圖1A與圖1B，從兩圖可得知兩組間有一定量的差異表達lncRNA。圖中展示的為未經(jīng)Flag篩選的所有信號值，故差異基因（紅色、藍色點）的個數(shù)會多于差異基因列表。

圖1 差異lncRNA的散點圖與火山圖

2.2 差異lncRNA篩選

對兩組之間表達lncRNA以log2（FC）的絕對值小于0.5或大于2.0，以及P值小于0.05篩選差異表達lncRNA，發(fā)現(xiàn)兩組共有20個差異lncRNA，其中19個下調(diào)，1個上調(diào)。差異lncRNA熱圖見圖2，詳細信息見表1。

表1 兩組間差異表達的20個lncRNA

圖2 兩組間差異lncRNA熱圖

2.3 差異基因GO功能富集與KEGG通路富集分析

對差異lncRNA的cis作用靶基因進行富集分析。共獲得353個GO功能富集分析，其中富集分析前30的結(jié)果涉及生物過程19個，主要為RNA代謝過程的調(diào)節(jié)、細胞組件組裝及生物合成過程等；細胞組分7個，主要在細胞核上；分子功能4個，主要為水解酶活性及核酸結(jié)合等（圖3）。此外共獲得18個KEGG通路富集分析，其中富集結(jié)果為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、雌激素（Estrogen）信號通路等（圖4）。

圖3 差異lncRNA的GO功能富集分析

圖4 差異lncRNA的KEGG通路富集分析

3 討論

中醫(yī)學將腦梗死歸納于“中風”范疇，并認為主要病機為因虛致瘀、脈絡瘀滯，氣虛血瘀為中風病重要的病理因素[17]。補陽還五湯由清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，專用于中風病氣虛血瘀證的治療。方中重用黃芪，大補元氣使氣旺以促血行；臣藥當歸尾長于活血，且有化瘀而不傷血之妙；佐以川芎、赤芍、桃仁、紅花助當歸尾活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡，全方共奏益氣活血之功。臨床研究表明，補陽還五湯能夠改善急性腦梗死患者的神經(jīng)功能，提高患者的日常生活質(zhì)量[18]。

腦梗死的發(fā)病機制十分復雜，其神經(jīng)損傷為多重因素、多種機制交互作用發(fā)生的“瀑布式”病理變化，包括神經(jīng)細胞能量代謝障礙、神經(jīng)炎性損傷等[11]。在腦缺血后，如何有效的將藥物快速傳遞通過血腦屏障，對挽救受損腦組織有著重大意義。研究表明，大腦內(nèi)含有大量外泌體，這些外泌體能夠維持大腦神經(jīng)元正常功能，且在促進大腦內(nèi)外細胞通訊的過程中有著重要作用[19]。如有研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后大腦的外泌體濃度會顯著上升[20]，并攜帶神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)快速穿透血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)保護作用[21]。此外臨床實驗亦表明，通過外泌體給藥治療，能夠有效促進缺血性腦損傷組織的神經(jīng)再生和血管生成[22,23]。

外泌體發(fā)揮其細胞間通訊功能被認為主要與其所攜帶的包括lncRNA在內(nèi)的各類信號因子有關[24]。lncRNA并不能直接翻譯蛋白質(zhì)，但是目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等多個方式，參與許多重要的生物過程[25]。如有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1）在腦缺血后可通過調(diào)控VEGF與HIF-1的表達，促進血管新生，降低腦缺血損傷[26]。另有報道表明lncRNA H19在腦缺血后與TNFα呈正相關，而敲除該基因后會逆轉(zhuǎn)小膠質(zhì)細胞的活化并降低TNF-α的產(chǎn)生[27]。此外，有研究證實通過沉默lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）會抑制促腦缺血后凋亡因子的生成[28]；但也有研究指出lncRNA MALAT1亦具有調(diào)控細胞自噬，減輕神經(jīng)元死亡的作用[29]。上述研究提示lncRNA可能是發(fā)揮抗腦缺血損傷的新靶點。

目前，中醫(yī)藥對lncRNA的研究還相對較少，屬于初步探索階段。既往研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇、姜黃素等多種中藥活性成分，能夠通過調(diào)控各類lncRNA，發(fā)揮抗癌作用[30]，亦有研究表明中醫(yī)藥能夠通過調(diào)控lncRNA，發(fā)揮促進血管新生，抑制凋亡的作用[31-32]。有學者通過采集缺血性中風急性期患者的血清，篩選出中風病陰陽類證及與正常組對比的lncRNA差異表達譜，并發(fā)現(xiàn)急性缺血中風陰陽類證的發(fā)生發(fā)展與血糖、血脂及同型半胱氨酸的代謝有關[33-34]。腦心通膠囊是治療腦缺血的有效中成藥，通過高通量測序腦心通膠囊腸吸收液對脂多糖誘導的小膠質(zhì)細胞lncRNA的差異表達，推測腦心通膠囊可能通過調(diào)控lncRNA生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest specific transcript 5,Gas5）及其靶向的mRNA抑制炎癥反應，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用[35-36]。Cui等則發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可影響腦損傷大鼠腦組織18個lncRNA差異表達，這些lncRNA的生物學機制可能與血紅蛋白復合物、氧轉(zhuǎn)運蛋白活性和丙酮酸代謝有關[37]。

本研究是首次同時從外泌體和轉(zhuǎn)錄組學的角度探討了補陽還五湯對急性腦梗死患者血清外泌體lncRNA表達譜的影響。結(jié)果表明，兩組間共有20個差異表達的lncRNA，其中19個下調(diào)，1個上調(diào)，差異表達最顯著的lncRNA索引號依次為lnc-PARN-12:1、NR_039803及l(fā)nc-NDEL1-6:1，目前尚未見上述3個lncRNA的研究報道，有待驗證。通過對差異lncRNA的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)GO功能富集分析與眾多生物過程密切相關，提示補陽還五湯治療急性腦梗死涉及多重因素多重分子機制。此外，KEGG通路富集分析主要為MAPK信號通路、雌激素信號通路等。MAPK信號通路是大腦缺血缺氧后的重要調(diào)控通路，與氧化應激、炎癥反應、凋亡及自噬等病理過程密切相關[38]。有實驗證實，在腦缺血后活化的MAPK通路會激活Nrf2通路，而中藥能夠抑制MAPK通路的磷酸化，扭轉(zhuǎn)Nrf2核移位，減少氧化應激[39]；亦有研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路與炎癥反應密切相關，其在大腦缺血后可激活下游的NF-κB通路，促進炎癥反應[40]，抑制MAPK通路活化則可以減輕炎癥反應，具有神經(jīng)保護作用[41]。前期研究已發(fā)現(xiàn)補陽還五湯含藥血清能夠通過調(diào)控MAPK信號通路，對糖氧剝奪模型的星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生保護作用[42]。雌激素是一組類固醇激素，易于擴散穿過細胞膜，并通過與靶器官中的雌激素受體結(jié)合而產(chǎn)生生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，大腦中的雌激素并非來自通過血腦屏障循環(huán)的雌激素，而是在大腦中合成[43-44]。且有證據(jù)表明通過雌激素治療，能夠?qū)δX缺血后卵巢切除的動物產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[45]。此外，課題組前期研究亦已證實補陽還五湯能夠通過調(diào)控雌激素及其受體的水平，減輕腦缺血損傷[46]。上述研究表明補陽還五湯能夠通過多通路、多靶點發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，也進一步印證了本研究的準確性。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)補陽還五湯會改變急性腦梗死患者的血清外泌體lncRNA表達譜，推測補陽還五湯可能通過調(diào)控這些lncRNA的表達水平，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。這些lncRNA涉及諸多生物過程和信號通路，為后續(xù)的臨床及基礎研究提供了新思路。但由于基因芯片高昂的價格，本研究只納入了少量病例，今后課題組將做進一步的研究。