趙磊，李淼，黃赫，劉禾，朱競(jìng)赫，甘雨，劉小虎＊＊，梁茂新，2，李國(guó)信＊＊

（1.遼寧省中醫(yī)藥研究院科研處沈陽110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院大連116600）

血脂異常一般指血漿中脂質(zhì)異常，通常表現(xiàn)為血漿中甘油三酯（TG）和（或）總膽固醇（TC）升高，也包括低密度脂蛋白（LDL-C）升高和高密度脂蛋白（HDLC）降低。血脂異常是冠心病、心肌梗死和缺血性腦卒中等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，49.2%的心肌梗死與其相關(guān)，且女性比男性相關(guān)性更強(qiáng)[2]。近30年，中國(guó)人群血脂異?；疾÷手鹉赀f增[3]。女性絕經(jīng)后的發(fā)生率明顯上升[4]，患病率高達(dá)72.80%[5]，可見女性患病的特殊性和嚴(yán)重性。故圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后的血脂管理對(duì)于減輕女性長(zhǎng)遠(yuǎn)期疾病負(fù)擔(dān)具有關(guān)鍵意義[6]。近年來，許多研究也發(fā)現(xiàn)女性血脂異常與雌激素關(guān)系密切，GPR30/PPARγ/MAPK是與二者皆相關(guān)的信號(hào)通路，具有重要的調(diào)控作用。

目前治療女性血脂異常的方法并沒有充分意識(shí)其患病的特殊性，一般在發(fā)現(xiàn)疾病后采用常規(guī)降血脂類藥物控制，缺乏具有針對(duì)性的防控措施，同時(shí)患者需要終身服藥，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重。若在調(diào)節(jié)絕經(jīng)綜合征的同時(shí)能夠干預(yù)脂質(zhì)代謝過程則可達(dá)到有效防治目的，事半功倍。中醫(yī)認(rèn)為血脂歸于“痰”類，“痰之本無不在腎”。絕經(jīng)期婦女“年過四十，而陰氣自半也”“七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通”肝腎陰虛明顯。濟(jì)陰顆粒是利用自身研制的“《普濟(jì)方》數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)”，總結(jié)古代用藥規(guī)律，結(jié)合現(xiàn)代臨床經(jīng)驗(yàn)篩取所得，由生地黃、淫羊藿、丹參、香附、黃柏組成，滋補(bǔ)肝腎，理氣活血。前期研究表明[7-9]，濟(jì)陰顆?？捎行д{(diào)節(jié)絕經(jīng)綜合征癥狀、雌激素水平，抑制卵巢細(xì)胞凋亡，且5味中藥分別可抑制脂肪酸、膽固醇合成，促進(jìn)脂肪分解代謝等，具有現(xiàn)代藥理學(xué)調(diào)節(jié)血脂作用。因此，本研究考察濟(jì)陰顆粒治療去勢(shì)雌性血脂異常大鼠的療效及其對(duì)GPR30/PPARγ/MAPK信號(hào)通路的影響，為女性圍絕經(jīng)期和長(zhǎng)遠(yuǎn)期疾病，如血脂異常、冠心病防治，中藥新藥研發(fā)提供新思路、新方法。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)、雌性SD大鼠75只，體質(zhì)量160-200 g，購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：溫度20-25℃，濕度40-50%，自由飲食飲水。水及飼料均經(jīng)輻照消毒處理。所有研究人員人道地進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)倫理?xiàng)l例。

1.2 藥品

注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F8008502）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：X67405）、珍珠靈芝片（湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z43020830）；濟(jì)陰顆?！采攸S、淫羊藿、丹參、香附、黃柏免煎顆粒劑（江陰天江藥業(yè)有限 公 司，批 號(hào)：18334517、18112331、19032831、19051161、19032251）〕。

1.3 主要試劑

膽固醇、丙基硫氧嘧啶、吐溫-80、1,2-丙二醇、膽酸鈉（成都華夏化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：P354464、P436521、P354672、P453641、P243652），TG、TC酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：12/2019）、G蛋白偶聯(lián)受體30抗體（GPR30）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、過氧化酶活化增生受體γ（PPARγ）抗體（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：AD03031236、AI09293131、AI09064702）、β-actin（Immunoway公司，貨號(hào)：YT0099）、IgG（HRP）（Abcam公司，批號(hào)：GR3208239-1）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Bio公司，貨號(hào)：RR047A）、實(shí)時(shí)定量PCR染料〔SYBR qPCR Master Mix(Universal)，貨號(hào)：R01001〕。

1.4 主要儀器

Neofuge 13R高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、DR-200BS酶標(biāo)分析儀（無錫華衛(wèi)德朗一起有限公司）、光電顯微鏡（奧林巴斯中國(guó)有限公司，BX53）、LBY-N6COMPACT全自動(dòng)血液流變儀（北京普利生儀器有限公司）、連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)MolecularPevices）、實(shí) 時(shí) 定 量PCR儀（ABI7500）、NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)。

2 方法

2.1 造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后，腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉，去除雙側(cè)卵巢。術(shù)后腹腔注射青霉素3天預(yù)防感染，取陰道分泌物涂片檢測(cè)動(dòng)情周期。確認(rèn)未出現(xiàn)動(dòng)情期后進(jìn)行造模，每天給予脂肪乳劑（膽固醇10 g，豬油25 g，丙基硫氧嘧啶1 g，吐溫-80 25 mL，1,2-丙二醇20 mL,膽酸鈉2 g，蒸餾水30 mL）灌胃（10 mL/kg·d）[10]，連續(xù)8周。

2.2 分組和給藥

依據(jù)前期研究，空白組與假手術(shù)組的各項(xiàng)指標(biāo)未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、西藥對(duì)照組（阿托伐他汀鈣片）、中藥對(duì)照組（珍珠靈芝片）、濟(jì)陰顆粒組，每組15只。空白組和模型組蒸餾水灌胃（10 mL·kg-1）；西藥和中藥對(duì)照組根據(jù)臨床劑量換算為大鼠劑量給予藥物灌胃干預(yù)（10 mL·kg-1）；依據(jù)前期研究結(jié)果[8,9]，濟(jì)陰顆粒中劑量（7.8 g生藥/（kg·天））與高劑量組（15.6 g生藥/（kg·天））對(duì)雌激素、卵巢衰老、冠心病心電圖、心肌酶的影響各有參差，差異不顯著，綜合考慮選擇7.8 g生藥/（kg·天）作為本次實(shí)驗(yàn)干預(yù)劑量，連續(xù)8周。

2.3 標(biāo)本采集和檢測(cè)方法

末次給藥后禁食、水24 h。腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行血液流變學(xué)檢測(cè)，分離血清后ELISA法檢測(cè)TC和TG；取肝臟1葉去除脂肪組織，10%多聚甲醛溶液固定，HE染色觀察肝細(xì)胞形態(tài)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GPR30、MAPK、PPARγ蛋白表達(dá)；1葉-80℃保存，熒光RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)（表1）。

表1 基因引物信息

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 對(duì)肝臟細(xì)胞形態(tài)的影響

空白組肝細(xì)胞索放射狀分布，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、大小均勻、排列整齊。模型組肝細(xì)胞索失去正常結(jié)構(gòu)、細(xì)胞呈空泡性脂肪變性，核固縮染色較深，部分凋亡或壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝組織損傷顯著。與模型組比較濟(jì)陰顆粒組肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，細(xì)胞形態(tài)比較完整（圖1）。

圖1 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟細(xì)胞形態(tài)的影響（光鏡×400）

3.2 對(duì)血液流變性的影響

與空白組比較，模型組大鼠低、中、高切變率下全血粘度均顯著升高，組間差異顯著（P<0.01）；與模型組比較，西藥、中藥對(duì)照組、濟(jì)陰顆粒組大鼠低、中、高切變率下全血粘度顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01），血液流變性有不同程度改善（表2）。

表2 濟(jì)陰顆粒對(duì)血液流變性的影響（±s，n=15）

表2 濟(jì)陰顆粒對(duì)血液流變性的影響（±s，n=15）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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3.4 對(duì)血清TC、TG的影響

與空白組比較，模型組血清TC、TG水平顯著升高（P<0.01），表明血脂異常大鼠造模成功；與模型組比較，西藥、中藥對(duì)照組、濟(jì)陰顆粒組血清TC、TG水平降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（表3）。

表3 濟(jì)陰顆粒對(duì)血清TG、TC的影響（±s，n=15）

表3 濟(jì)陰顆粒對(duì)血清TG、TC的影響（±s，n=15）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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3.4 對(duì)肝臟GPR30、PPARγ、MAPK蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組GPR30、PPARγ蛋白表達(dá)降低，MAPK蛋白表達(dá)升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.01）；與模型組比較，西藥對(duì)照組、濟(jì)陰顆粒組GPR30蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），西藥對(duì)照組、濟(jì)陰顆粒組（P<0.01）、中藥對(duì)照組（P<0.05）PPARγ蛋白表達(dá)水平升高，西藥對(duì)照組、濟(jì)陰顆粒組（P<0.01）、中藥對(duì)照組（P<0.05）MAPK蛋白表達(dá)水平降低（表4、圖2~圖4）。

表4 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟GPR30、PPAR-γ、MAPK蛋白表達(dá)的影響（MOD/μm2，±s，n=6）

表4 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟GPR30、PPAR-γ、MAPK蛋白表達(dá)的影響（MOD/μm2，±s，n=6）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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圖2 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟GPR30蛋白表達(dá)的影響（光鏡×400）

圖4 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟MAPK蛋白表達(dá)的影響（光鏡×400）

3.5 對(duì)肝臟Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，西藥對(duì)照組、中藥對(duì)照組、濟(jì)陰顆粒組Bcl-2 mRNA表達(dá)均上調(diào)（P<0.05），調(diào)節(jié)強(qiáng)度相當(dāng)；與空白組比較，模型組Bax mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.01）。與模型組比較，西藥對(duì)照組、中藥對(duì)照組、濟(jì)陰顆粒組均可抑制Bax mRNA表達(dá)（P<0.01），調(diào)節(jié)強(qiáng)度相當(dāng)。

4 討論

血脂異常是一類常見的代謝類疾病，與血糖升高或糖尿病有緊密聯(lián)系[11]；脂質(zhì)過高與炎癥促進(jìn)、頸總動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度之間呈正相關(guān)[12]，是心腦血管疾病重要風(fēng)險(xiǎn)因素。研究表明，45歲前男性TC平均水平和高膽固醇血癥患病率高于女性，而在45歲之后女性高于男性，女性絕經(jīng)后高膽固醇血癥患病率增加，提示圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后是女性血脂異常防治的關(guān)鍵時(shí)期[13]，是防控冠心病、心梗、腦梗的重要階段。

圖3 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響（光鏡×400）

中醫(yī)認(rèn)為血脂與古代“脂”、“膏”的論述相似，歸為“痰飲”、“濕濁”、“瘀血”之類[14]。因此，臨床多以活血化瘀、祛痰除濕為主要治療手段。然而，血脂異常實(shí)為本虛標(biāo)實(shí)：臟腑功能失常為本，則水液運(yùn)化和疏布異常，痰濁內(nèi)生，留于血脈，阻滯氣血，而成痰瘀內(nèi)阻為標(biāo)。腎為先天之本，主水，調(diào)節(jié)津液；肝主疏泄，調(diào)暢氣血，絕經(jīng)期女性肝腎陰虛[15]，津液代謝失調(diào)，津液停聚、痰濁內(nèi)蘊(yùn)、陰虛失于潤(rùn)澤，津枯血燥，膏脂疏布、運(yùn)化障礙而不得藏，外泄于血脈則血脂異常。濟(jì)陰顆粒方中生地黃養(yǎng)陰生津，為君藥；淫羊藿補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，陽生陰長(zhǎng)為臣藥；生地黃配伍淫羊藿滋補(bǔ)肝腎。香附行血中之氣、疏肝解郁；丹參活血祛瘀；香附配伍丹參調(diào)氣和血。黃柏清熱燥濕為佐藥，協(xié)助君臣清虛熱，具有堅(jiān)腎陰功效，合而滋補(bǔ)肝腎、理氣活血?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究：經(jīng)生地黃水煎總提物干預(yù)后肝組織中泡沫細(xì)胞數(shù)量、膽固醇酯含量、膽固醇流出率明顯減少[16]；丹參涉及的生物過程包括調(diào)理血脂水平[17]，減少脂肪酸和內(nèi)源性膽固醇合成[18]；淫羊藿醇提物具降血脂活性[19]，減少白色脂肪堆積；香附乙醇提取物可降低隨衰老而增長(zhǎng)的總膽固醇、甘油三酯、LDL，VLDL[20,21]；黃柏中小檗堿可通過AMPK[22]、JNK[23]多種途徑上調(diào)LDLR的表達(dá)來降低膽固醇[24]。本研究顯示，模型組大鼠全血粘度升高，血清TC、TG升高，變化顯著，出現(xiàn)高血脂癥狀。經(jīng)濟(jì)陰顆粒干預(yù)后，血液流變性改變減少，血清TC、TG水平降低（P<0.01），提示濟(jì)陰顆粒能夠改善血液及血清內(nèi)血脂含量。

GPR30是G鈣蛋白偶聯(lián)受體又是雌激素受體，對(duì)血壓和膽固醇代謝具調(diào)節(jié)作用[25]，是心血管疾病性別特異性的決定因素，女性圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后患病的關(guān)鍵因子。GPR30激活后促使肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子從細(xì)胞膜上釋放，使得MAPK級(jí)聯(lián)活化[26]。有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通過C/EBPβ和PPARγ調(diào)節(jié)前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化[27]。抑制MAPK信號(hào)通路可以激活PPARγ[28]。PPARγ在脂蛋白脂肪酶的作用下調(diào)整葡萄糖含量，再通過影響3-磷酸甘油進(jìn)而影響TG的最終合成[29,30]；調(diào)節(jié)棕色脂肪組織促進(jìn)脂肪燃燒，產(chǎn)生熱量[31]；增加白脂肪組織中ADP表達(dá)，活化AMPK，從而啟動(dòng)脂質(zhì)代謝酶的基因轉(zhuǎn)錄[32]。脂肪形成過程中MAPKs/Akt/PPARγ的降低有助于抑制脂肪細(xì)胞的分化，在脂質(zhì)蓄積過程中阻斷MAPK信號(hào)通路來抑制NF-κB的激活[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)濟(jì)陰顆粒干預(yù)后，大鼠肝組織中GRP30、PPARγ蛋白表達(dá)水平升高，MAPK蛋白表達(dá)明顯降低，提示濟(jì)陰顆粒對(duì)去勢(shì)雌性血脂異常大鼠的干預(yù)作用可能是通過GPR30/PPARγ/MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的。

表5 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟Bcl-2，Bax mRNA表達(dá)的影響（RQ，±s，n=3）

表5 濟(jì)陰顆粒對(duì)肝臟Bcl-2，Bax mRNA表達(dá)的影響（RQ，±s，n=3）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官，肝細(xì)胞受損導(dǎo)致脂代謝異常，而脂肪過度積累又是導(dǎo)致肝代謝障礙的最重要因素。因此，肝細(xì)胞凋亡伴隨著脂代謝異常的發(fā)生發(fā)展。Bcl-2和Bax是同一家族成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[34]預(yù)防肝臟病變[35]中起到重要作用，Bax可通過對(duì)線粒體的調(diào)節(jié)，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，推進(jìn)凋亡過程，而Bcl-2的作用正相反[36]。通過HE染色觀察肝組織形態(tài)，熒光RT-PCR法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡因子表達(dá)，與空白組相比，模型組Bax mRNA表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞丟失、空泡變性等凋亡情況，肝細(xì)胞受損嚴(yán)重。經(jīng)濟(jì)陰顆粒干預(yù)后肝組織中Bax mRNA表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)升高，肝細(xì)胞形態(tài)好轉(zhuǎn)，提示濟(jì)陰顆?？赏ㄟ^降低肝細(xì)胞凋亡進(jìn)而保護(hù)肝臟。

綜上所述，濟(jì)陰顆粒能夠緩解去勢(shì)雌性血脂異常大鼠肝組織損傷，改善血脂代謝、全血粘度，降低TC、TG水平，GPR30/PPARγ/MAPK信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制之一。也就是說，濟(jì)陰顆粒在調(diào)節(jié)絕經(jīng)期綜合征，延緩卵巢衰老的同時(shí)可有效干預(yù)女性絕經(jīng)后血脂異常，對(duì)女性圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后血脂異常的預(yù)防和治療具有一定意義，在女性疾病防治的關(guān)鍵時(shí)期發(fā)揮重要作用，降低女性長(zhǎng)遠(yuǎn)期疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。但本病發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，濟(jì)陰顆粒也可能通過其他途徑發(fā)揮作用，有待深入研究。