張秋楠，常子豪，葉 婷，梁林金，梁文儀，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京100102）

藏藥大三果（Triphala）由訶子Terminalia ChebulaRetz.，毛訶子Terminalia Billerica(Gaertn.)Roxb.與余甘子Phyllanthus emblicaL.的成熟果實按比例組成，以它們?yōu)橹魉幣湮闉槿麥?，三果湯等劑型，簡稱大三果[1-2]。1995年版藏藥部頒標準將其收載，具有清熱、調(diào)和氣血、化解壞血的功效[3]，臨床上多用于治療咽喉腫痛、咳嗽哮喘、消化不良、貧血、肝功能障礙和心血管疾病等，為藏藥眾多方劑的基礎方[4]。近年來國內(nèi)外學者對大三果及其單味藥余甘子、訶子、毛訶子進行了化學成分、藥理作用和臨床應用方面的研究，結果表明大三果富含鞣質(zhì)、酚酸、皂苷、脂質(zhì)、萜類化合物、黃酮類、谷甾醇、強心苷和各種碳水化合物[5]，在抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎等方面均表現(xiàn)出一定的治療和預防保健作用[6-9]，但對其成分、靶點、疾病、通路之間的相互聯(lián)系還未見報道。因此，本研究在鑒定大三果化學成分的基礎上，首次對其進行系統(tǒng)藥理學的機制作用研究，為該藥的臨床合理用藥、質(zhì)量控制以及新藥研發(fā)提供科學依據(jù)和有力保障[10]。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）對大三果醇提取中主要化學成分進行鑒定與表征分析。同時，利用生物信息學等方法構建和分析多元生物網(wǎng)絡，以網(wǎng)絡靶點為切入點進一步探討其主要作用機制，為該藥的臨床合理用藥、質(zhì)量控制提供依據(jù)[10]。

1 材料

1.1 儀器與軟件

UPLC-Q-Orbitrap液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：Ultimate 3000型超高效液相色譜儀（Dionex公司）串聯(lián)Thermo Q Exactive型高分辨質(zhì)譜（Thermo FisherScientific公司）；Xcalibar 3.0工作站（Thermo Fisher Scientific公司）；Compound Discovery 3.0化合物分析鑒定軟件（Thermo Fisher Scientific公司；https://www.thermofisher.com/）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ 5200E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Cytoscape 3.7.2軟 件（Cytoscape Consortium;https://cytoscape.org/）；R語言4.0.2程序包（The R Foundation;https://www.r-project.org/）；Chembiodraw Ultra 14.0軟件（PerkinElmer公司；https://www.chemdraw.com.cn/）等。

1.2 試劑

沒食子酸（批號MUST-17022801）、柯里拉京（批號MUST-17052603）、鞣花酸（批號MUST-17052603），以上對照品純度≥98%，均購于成都曼斯特生物科技有限公司；沒食子酸甲酯（批號TN1127CA14，純度≥98%），購于上海源葉生物科技有限公司；色譜級甲醇和乙酸購于Fisher公司；純凈水購于杭州娃哈哈集團有限公司。

余甘子、訶子和毛訶子藥材均購于北京藏醫(yī)院（產(chǎn)地尼泊爾），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定系劉春生教授鑒定，分別為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.、使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.及毛訶子Terminalia bellirica(Gaertn.）Rox.的干燥成熟果實。

2 方法

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm,Column；Part No：186003539；Serial No：0246325825758）；保護柱：ACQUITY HSS T3 1.8 μm VANGUARD Pre-Col（Part No：186003976；Serial No：0210382710）；柱溫：30℃；流動相：0.1%乙酸(A)-甲醇(B)；流速：0.3 mL·min-1；波長：260 nm、270 nm；流動相梯度如下：0-2 min，3% B；2-10 min，3-13% B；10-15 min，13-25% B；15-22 min，25-30% B；22-32 min，30-60%B；32-45 min，60-95%B；45-55 min，95%B。

2.1.2 質(zhì)譜條件

ESI：負離子模式；霧化氣流：1.5 L·min-1；離子源溫度：320℃；干燥氣壓力：100 kPa；質(zhì)量掃描范圍：m/z100-1500。毛細管溫度為350℃；鞘氣（氮）流量為30 arb；輔助氣體（氮氣）流量為10 arb；源電壓為4.0 kV；毛細管電壓為-35 V；管透鏡電壓為-110 V。軌道阱質(zhì)量分析儀的分辨率設定為30000。隔離寬度為2 amu，歸一化碰撞能量（CE）設定為35%。碰撞誘導解離（CID）在LTQ中進行，活化q為0.25，活化時間為30 ms。

2.2 大三果醇提物供試品和對照品溶液制備

精密稱取余甘子、訶子以及毛訶子藥材粉末（過50目篩）各100 mg置于100 mL錐形瓶中，加入50%甲醇60 mL，稱重，100 MHz超聲60 min，補足原重量，過0.22 μm微孔濾膜過濾，取上清液，即得供試品溶液。

分別精密稱取沒食子酸、柯里拉京和沒食子酸甲酯對照品2.5 mg置于容量瓶中，用甲醇溶解后定容配制成0.5 mg·mL-1的對照品溶液。稱取鞣花酸標準品2.5 mg于5 mL容量瓶中，加入少量DMSO溶解后甲醇定容，配制成0.5 mg·mL-1的鞣花酸對照品溶液。分別取1 mL各對照品溶液，配制成的0.125 mg·mL-1混合對照品溶液，混勻，過0.22 μm微孔濾膜過濾，取上清液，即得混合對照品溶液。

2.3 化合物鑒定解析

進樣后，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準分子離子等信息推測并得到一級質(zhì)譜的精確相對分子質(zhì)量，經(jīng)Xcalibar 3.0軟件進行峰提取、峰匹配等處理并與Compound Discovery 3.0軟件匹配，依據(jù)對照品、參考文獻、Mass Bank數(shù)據(jù)庫（https://massbank.eu/MassBank/）提供的相對保留時間及碎片離子信息進一步確認定性化學成分[11]。

2.4 活性成分篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP）[12]（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）分析平臺，檢索液質(zhì)鑒定出的化合物。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類藥性（drug-like，DL）≥0.18為指標，篩選得到大三果中的活性成分[13]。

2.5 活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

運用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）和Swiss Target Prediction平 臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）搜索活性成分靶點，采用UniProt[14]數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）進行標準化，建立化合物靶點數(shù)據(jù)庫。再將化合物及相應基因導入Cytoscape軟件[15]，構建活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖（Component-Target network，C-T network）。

2.6 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建

將篩選出的潛在靶點全部導入STRING網(wǎng)絡平臺（https://string-db.org/），設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為高等置信度0.9“high confidence”，隱藏沒有相互作用的蛋白，進行蛋白相互作用分析[16]。采用Cytoscape軟件進行可視化分析，采用CytoHubba插件采取最大集團中心性（Maximal clique centrality，MCC）的拓撲算法篩選核心基因（hub gene）。

2.7 GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析

采用人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫DAVID6.8[17]（http://david.ncifcrf.gov/）對大三果醇提取的全部潛在靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）信號通路富集分析和基因本體論（Gene ontology,GO）功能富集分析，以P<0.01進行篩選，研究藥物靶點主要信號通路。

3 結果與分析

3.1 大三果醇提物化學成分分析

因大三果成分主要為酚酸和鞣質(zhì)類化合物，提取液呈酸性，因此選用負離子模式進行分析，得到總離子流圖，綜合表征出了85個化合物，包括酚酸類、簡單沒食子酰酯類、鞣質(zhì)類（分為沒食子鞣質(zhì)、逆沒食子鞣質(zhì)）、脂肪酸類、黃酮類、萜類及其他，結果見表1。

表1 大三果醇提取中化學成分UPLC-Q-Orbitrap-MS鑒定

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

此類化合物共鑒定出8個，含有較多的酚羥基和羧基，在裂解時易失去H2O、CO、CO2及CH2等基團[18]。Ellagic acid（化合物73，鞣花酸）的保留時間是29.74 min，分子離子峰為m/z300.999 0[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，失去一個中性碎片CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z273.004 0[M-H-CO]-，再失去一個CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z245.009 1[M-H-2CO]-；失去一個中性碎片CO（244 u）產(chǎn)生碎片m/z257.009 3[M-H-CO2]-，再失去一個CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z229.014 3[M-H-CO2-CO]-；失去一個中性碎片H2O（18 u）產(chǎn)生碎片離子m/z283.996 5[M-H-H2O]-，推測分子式為C14H6O8[19]。

3.1.2 簡單沒食子酰酯類化合物分析

此類化合物共鑒定出16個，主要含有沒食子?；?，在裂解時易失去沒食子酰基（galloyl，152 u）而產(chǎn)生特征碎片。Ethyl gallate（化合物54，沒食子酸乙酯）的保留時間是20.10 min，分子離子峰為m/z197.045 6[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，失去一個2CH2（48 u）產(chǎn)生碎片m/z169.014 3[M-H-2CH2]-，再失去一個CO2（44 u）產(chǎn)生碎片m/z125.024 4[M-H-C2H4-CO2]-，推測分子式為C9H10O5[20]。

3.1.3 沒食子鞣質(zhì)類化合物分析

此類化合物共鑒定出5個，水解后能生成沒食子酸和糖或多元醇，多為一取代或多取代的沒食子糖苷，因取代的位置不同具有多個同分異構體，在裂解時易失去一系列沒食子?；╣alloyl，152 u）。Tetra?galloylglucose（化合物58）的保留時間是23.53 min，分子離子峰為m/z787.100 5[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可接連丟失沒食子?；鵪alloyl（152 u）產(chǎn)生碎片m/z635.091 5[M-H-galloyl]-和碎片m/z331.056 9[MH-3galloyl]-；丟失一個沒食子酸（170 u）產(chǎn)生碎片m/z617.078 8[M-H-gallic]-，再丟失一個沒食子酸（170 u）產(chǎn)生碎片m/z447.057 3[M-H-2gallic]-，再丟失一個沒食子?；鵪alloyl（152 u）產(chǎn)生碎片m/z465.068 0[M-H-gallic-galloyl]-，推測分子式為C34H28O22[21]。

3.1.4 逆沒食子鞣質(zhì)類化合物分析

所使用的日降水量數(shù)據(jù)來源于2001—2016年臨安國家基本站觀測數(shù)據(jù),以20時為日界,日降水量≥50 mm為一個暴雨雨日。本文中的季節(jié)劃分方式如下:春季為3—5月,夏季為6—8月,秋季為9—11月,冬季為12月—次年2月。

此類化合物共鑒定出23個，由六羥基聯(lián)苯二酸或與其生源關系的酚羧酸與葡萄糖形成酯，水解后可產(chǎn)生逆沒食子酸（鞣花酸），主要分為鞣花鞣酸鞣質(zhì)類成分和訶子次酸鞣質(zhì)類成分。

鞣花鞣質(zhì)類化合物的特征碎片是m/z301，這是由于結構中含有六羥基二苯甲?；℉HDP），其在負離子模式下失去1個H產(chǎn)生的[22]。Punicalagin A（化合物22）和Punicalagin B（化合物30）的保留時間分別為10.67 min和13.85 min，分子離子峰為m/z1083.059 5[M-H]-，失去一個鞣花酸單元HHDP（302 u）產(chǎn)生碎片離子m/z781.053 6[M-H-ellagic acid]-，繼續(xù)失去一個葡萄糖（180 u）產(chǎn)生碎片離子m/z600.990 1[M-H-ellagic acid-glu]-，結合特征碎片離子m/z300.998 8，推測其分子式為C48H28O30，化合物22和30被推測為Punicalagin。反相色譜中，Punicalagin A比Punicalagin B先出峰，因此化合物22被推測為Punicalagin A，化合物30被推測為Punicalagin B[23]。

訶子次酸鞣質(zhì)類化合物結構中含有HHDP存在生源關系的訶子?；╟hebuloyl，Che）。由訶子次鞣質(zhì)的基本結構單元訶子次酸（Chebulic acid）分子內(nèi)失去一個H2O、CO2基團產(chǎn)生碎片m/z337[Chebulic acid-H-H2O]-、m/z293[Chebulic acid-H-H2O-CO2]-是訶子次鞣質(zhì)類化合物的特征碎片。Chebulanin（化合物49，訶子寧）的保留時間是19.19 min，分子離子峰為m/z651.083 8[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可丟失一個沒食子酸（170 u）產(chǎn)生碎片m/z481.063 7[M-H-gallic]-；可丟失一個沒食子酰基galloyl（152 u）產(chǎn)生碎片m/z499.070 3[M-H-galloyl]-；可丟失一個沒食子酰葡萄糖galloylglusoce（332 u）產(chǎn)生碎片m/z319.009 1[MH-galloyglusoce]-，再丟失CO（244 u）產(chǎn)生碎片m/z275.019 7[M-H-galloyglusoce-CO2]-和碎片m/z231.029 8[M-H-galloyglusoce-2CO2]-，再丟失一個CO（28 u）產(chǎn)生碎片m/z203.035 1[M-H-galloyglusoce-2CO2-CO]-，推測分子式為C27H24O19[24]。

3.1.5 黃酮類化合物分析

此類化合物共鑒定出12個。Rutin（化合物69，蘆?。┑谋Ａ魰r間是29.11 min，分子離子峰為m/z609.146 7[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可丟失一個蕓香糖（308 u）形成碎片m/z301.033 4[M-H–C12H20O9]-，再丟失一個H（1 u）產(chǎn)生碎片m/z300.027 6[M-2HC12H20O9]-，或失去一個中性碎片H2CO（30 u）產(chǎn)生碎片m/z271.02 4[M-H-C12H20O9-H2CO]-。碎片m/z301.033 4通過RDA裂解形成碎片m/z151.003 6特征碎片離子，推測分子式為C27H30O16[25]。

3.1.6 萜類化合物分析

此類化合物共鑒定出4個。Arjungenin（化合物85，阿江欖仁素）的保留時間是37.22 min，分子離子峰為m/z503.338 6[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可丟失一個H2O（18 u）基團產(chǎn)生碎片m/z485.328 6[M-H-H2O]-,再丟失一個COOH（45 u）和CH2OH（31 u）基團產(chǎn)生碎片m/z409.312 0[M-H-H2O-COOH-CH2OH]-；可丟失兩個CH（315 u）基團產(chǎn)生碎片m/z473.327 6[MH-2CH3]-，推測分子式為C30H48O6[26]。

3.1.7 其他化合物分析

此他類化合物共鑒定出的17個。Mucic acid（化合物1，粘酸）的保留時間為0.96 min，分子離子峰為m/z209.030 0[M-H]-，經(jīng)碰撞解離，可失去一個H2O（18 u）基團產(chǎn)生碎片離子m/z191.020 0[M-H2O-H]-，也可失去一個CO（244 u）基團產(chǎn)生碎片離子m/z147.030 0[M-CO2-H]-，推測分子式為C30H48O61[27]。

3.2 大三果醇提物網(wǎng)絡藥理學分析

3.2.1 大三果醇提物活性成分和靶點篩選分析

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫ADME過篩標準，共篩選出12個符合條件的潛在活性成分，具體信息見表2。

表2 根據(jù)ADME篩選的12個成分

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction平臺搜索以上12個化合物的相關靶點，得到303個靶點。

3.2.2 主要活性成分-靶點網(wǎng)絡圖構建

構建大三果化合物-靶點網(wǎng)絡圖（圖1）。該網(wǎng)絡由315個節(jié)點（12個藍色節(jié)點代表大三果的活性成分，303個橙色節(jié)點代表相關靶點）與797條邊（代表化學成分與靶點的相互作用）組成，節(jié)點的大小表示Degree值的大小，節(jié)點越大對應得Degree值越大。其中，Quercetin（Degree=231）、Kaempferol（Degree=155）、Luteolin（Degree=148）、Morin（Degree=116）、Ellagic acid（Degree=81）、Digallate（Degree=20）、3,6-Digalloylglucose（Degree=18）、Taxifolin（Degree=14）、Mucic acid 1,4-lactone 5-O-gallate（Degree=9）、(+)-Catechin（Degree=9）、Phyllanemblinin A（De?gree=8）和Chebulic acid（Degree=5）。每個潛在活性成分均能作用于多個靶點，體現(xiàn)了大三果的多成分、多靶點作用。

圖1 大三果化合物-靶點網(wǎng)絡圖

3.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡構建與hub基因篩選

將303個藥物相關靶點構建蛋白相互作用關系繪制PPI網(wǎng)絡（圖2）。該網(wǎng)絡由258個節(jié)點和1276條相互作用連線構成關聯(lián)網(wǎng)絡，節(jié)點的大小表示Degree值的大小，節(jié)點越大對應得Degree值越大。MCC算法計算前10個關鍵基因（CXCL8，APP，CHRM2，CXCL2，CXCL10，ADCY2，CXCR1，CXCL11，PTGER3，ADO?RA1），提示這些關鍵基因在大三果藥理機制中發(fā)揮關鍵作用（圖3）。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）分析

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡中關鍵基因（hub）基因篩選

3.2.4 GO生物過程富集分析

將303個藥物相關靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO生物過程富集分析（P<0.01），共得到524條生物過程。結果顯示，生物過程（Molecular function，MF）共富集得到386條，主要涉及對藥物的反應、細胞凋亡的負調(diào)控、蛋白的自磷酸化與磷酸化和細胞增殖的正調(diào)控；細胞組分（Cellular components，CC）共富集得到48條，主要涉及胞漿、細胞外間隙、質(zhì)膜、胞外體和核漿；分子生物（Biological process，BP）共富集得到90條，主要涉及酶結合、碳酸鹽脫水酶活性、蛋白激酶活性與結合和與蛋白質(zhì)結合（圖4）。

圖4 生物學過程（GO）富集分析

3.2.5 KEGG信號通路富集結果

將303個藥物相關靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG生物過程富集分析（P<0.01），共得到103條信號通路，進一步篩選出前20條，分別為癌癥相關途徑，乙型肝炎，膀胱癌，前列腺癌，胰腺癌，非小細胞肺癌，膠質(zhì)瘤，HIF-1信號通路，PI3K-Akt信號通路，慢性粒細胞白血病，TNF信號通路，小細胞肺癌，F(xiàn)oxO信號通路，黑色素瘤，氮代謝，癌癥中的蛋白多糖，p53信號通路，ErbB信號通路和孕酮介導的卵母細胞成熟通路（圖5）。由此可見，在藥物成分對應的靶基因下，富集的信號通路主要集中在對炎癥、癌癥、免疫等方面，其與大三果的清熱、調(diào)和氣血、化解壞血的主要功效高度吻合，表明了本研究的科學性和合理性。

圖5 KEGG信號通路富集

4 討論

大三果最初記錄在阿育吠陀文本《Charaka Samhita》中，并已被用于各種疾病數(shù)千年[28]。在隋唐時期經(jīng)印度傳入我國，最早見于藏醫(yī)藥《四部醫(yī)典》，主治瘟疫、紊亂熱癥、新舊熱癥、促使熱癥成型[29]。至唐朝，大三果的單味藥訶子、毛訶子和余甘子均被錄入我國首部古藥典《唐·新修本草》[30]。在藏醫(yī)臨床中，用藥多以成方制劑或不同藏藥制劑進行配伍使用，而在藥品標準所收載的藏藥制劑中，毛訶子與余甘子、訶子所組成的藏藥大三果約占19%[4]。大三果具有清熱、祛濕、調(diào)和氣血的功效，并常與其他清熱溫中、活血行氣的藥物配伍使用，用以治療熱性、疼痛性或血液性疾病[31]。近年來科學研究驗證了其自由基清除，抗氧化，抗炎，抗菌以及潛在抗腫瘤的作用[32]。目前，大三果體內(nèi)外實驗以及臨床研究證明可以調(diào)節(jié)多種細胞信號通路，包 括ERK、MAPK、NF-κB、Akt、c-Myc、VEGFR、mTOR、p53、cyclin D1，促凋亡和抗凋亡蛋白等[33]，但物質(zhì)基礎、作用靶點和作用機制仍然不清楚。因此本研究以網(wǎng)絡藥理學為切入點，探討大三果的藥效物質(zhì)基礎以及主要作用靶點與機制。

網(wǎng)絡藥理學整合系統(tǒng)生物學、生物信息學等新興的交叉學科，從“疾病-基因-靶標-藥物”生物網(wǎng)絡的角度全面分析，進而闡述藥物與機體的功能關系[34]。這與中醫(yī)“整體觀”、“辨證論治”的概念理論和中藥及其復方多成分、多通路、多靶點協(xié)同作用的原理相一致。數(shù)據(jù)庫是網(wǎng)絡藥理學的前提和基礎，此外，通過組學技術或中藥化學成分分析等實驗方法獲得的數(shù)據(jù)也是生物網(wǎng)絡數(shù)據(jù)的重要來源，具有真實性和可靠性等優(yōu)點，廣泛地應用在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究。

本實驗中大三果三個單味藥的配比采用印度傳統(tǒng)醫(yī)藥1:1:1比例進行分析，為了更大程度提取主要成分，根據(jù)主要化合物極性采用70%乙醇提取樣品，定性了85個化學成分，主要成分是鞣質(zhì)類化合物和黃酮化合物。進一步得到12個活性成分進行網(wǎng)絡藥理學分析，其中，Chebulic acid（訶子次酸、Ellagic acid（鞣花酸）和Morin（桑色素）主要具有抗炎作用；Taxifolin（花旗松素）具有抗炎與保護心血管作用；Quercetin（槲皮素）、Kaempferol（山奈酚）和Luteolin（木犀草素）具有抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用；(+)-Catechin（(+)-兒茶素）同時具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保護心血管的作用。Chebulic acid（訶子次酸）具有抗氧化活性和對內(nèi)皮細胞功能障礙的保護作用[35]，可以通過改善晚期糖基化產(chǎn)物誘導的炎癥和氧化應激，增強ERK/Nrf2的解毒防御通路，減輕了血管功能障礙[36]。Quercetin（槲皮素）可抑制白血病細胞生長而不抑制正常的造血功能[37]，還可通過Nrf2/HO-1通路抑制H2O2誘導人肝細胞LO2凋亡和損傷[38]。(+)-Catechin（兒茶素）可減少氧化應激物的產(chǎn)生，預防血管炎性和血栓生成[39]，此外，還可抑制多種癌癥細胞[30]。這些成分之間相互配合、相互作用共同發(fā)揮大三果“清熱、調(diào)和氣血、化解壞血”的功效，為快速確定大三果藥效物質(zhì)基礎研究奠定基礎。

首先，12個活性成分作用于303個靶點，依據(jù)PPI分析得到的前10位核心靶點中，發(fā)現(xiàn)關鍵靶點主要歸屬于炎癥因子（CXCL8、CXCL2、CXCL10、CXCL11），免疫相關靶點（CXCR1、ADORA1），心血管相關靶點（CHRM2，PTGER3），膜受體靶點（ADCY2）等。其中，CXCL8、CXCL2、CXCL10、CXCL11是炎癥細胞因子家族中的趨化因子，主要參與免疫反應、造血功能和炎癥反應的調(diào)節(jié)，對炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了重要作用[40-41]。CXCR1和ADORA1都可以通過提高免疫活性來發(fā)揮對機體的保護作用[42]。PTGER3主要參與了水鹽代謝、血壓的調(diào)節(jié)以及誘發(fā)發(fā)熱、痛覺、炎癥等機體活動[43]。CHRM2是調(diào)節(jié)心臟活動的主要受體，其失衡與心臟結構和功能的病理改變有關[44]。ADCY2是一種膜相關酶，催化環(huán)腺苷單磷酸的形成，有研究表明該基因是肝細胞癌5年生存期有關的關鍵基因[45]。由此可見，大三果的治療作用主要是通過以上基因發(fā)揮抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)的功能實現(xiàn)的。

KEGG富集分析顯示，信號通路主要包括與癌癥有關的PI3K-Akt信號通路，TNF信號通路和p53信號通路和HIF-1信號通路。PI3K/Akt信號通路作為細胞內(nèi)外信號轉導的重要紐帶，影響著腫瘤細胞的增殖分化、代謝、凋亡、血管生成等，有研究表明該通路中的PI3K和AKT基因在肝癌、結腸癌、胃癌及乳腺癌等惡性腫瘤中常常出現(xiàn)基因突變或基因增殖[46-48]。據(jù)報道，Akt下游有40多個靶點，其中p53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因，超過50%的癌癥伴有p53基因的突變[49]。突變型p53將降低細胞對有絲分裂、細胞周期、糖酵解、核酸和脂質(zhì)合成的嚴格控制,從而促進腫瘤細胞的增殖[50]。目前有研究表明，大三果在SKOV-3、HeLa和HEC-1B細胞，異種斑馬魚移植模型和胰腺癌Capan-2異種移植模型中，都可以抑制腫瘤細胞生長，減少Akt和p53的過表達，進一步證實了大三果通過抑制PI3K-Akt和p53信號通路發(fā)揮其抗腫瘤的作用[51-53]。此外，PI3K/Akt細胞核轉錄因子激活后，將啟動和調(diào)控下游細胞因子和炎癥介質(zhì)如TNF-α的基因轉錄[54]，引起或加重炎癥。TNF-α作為TNF信號通路重要細胞因子，在參與細胞增殖、分化、侵襲、轉移、凋亡的同時，還參與機體免疫應答及炎癥反應，是許多癌癥治療的有效靶點[55]。HIF-1信號通路也是與癌癥相關的重要信號通路。HIF-1由α和β兩個亞基組成，參與腫瘤糖酵解、血管生成、增殖與凋亡、侵襲轉移、微環(huán)境pH調(diào)節(jié)[56]。在實體腫瘤早期階段，瘤內(nèi)細胞的缺氧環(huán)境可導致HIF-1α在腫瘤組織和外周血中的表達呈上升趨勢[57]。

此外，KEGG富集結果顯示，大三果還涉及膀胱癌，前列腺癌，非小細胞肺癌，膠質(zhì)瘤，慢性粒細胞白血病，小細胞肺癌，黑色素瘤，氮代謝，癌癥中的蛋白多糖，孕酮介導的卵母細胞成熟等信號通路。這些網(wǎng)絡藥理學預測結果說明大三果可以通過這些信號通路對特定疾病具有靶向作用，對研究開發(fā)大三果新的適應證具有指導意義。

綜上所述，大三果在現(xiàn)代醫(yī)學研究下不斷展現(xiàn)出其廣泛的臨床方面的應用潛力。本研究首次采用UHPLC-Q-Orbitrap-MS技術與網(wǎng)絡藥理學結合的方法，對大三果醇提取的化學表征、作用靶點及其信號通路進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)大三果主要通過抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)與血壓調(diào)節(jié)等作用，其作用機制可能與CXCL8、CXCL2、CXCL10、CXCL11、CXCR1、ADORA1、CHRM2、PTGER3、ADCY2、PI3K/AKT信號通路，TNF信號通路和p53信號通路有關，為大三果的臨床應用提供依據(jù)。